At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Evne betændt endotel at rekruttere leukocytter fra flow reguleres af mesenkymale stromale celler. Vi beskriver to in vitro modeller med primære humane celler, som kan anvendes til at vurdere neutrofil rekruttering fra flow og undersøge den rolle, som mesenchymale stromale celler spiller i reguleringen af denne proces.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stromaceller regulerer ansættelse af cirkulerende leukocytter under inflammation gennem cross-talk med de omkringliggende endotelceller. Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller til at studere rekruttering af cirkulerende neutrofiler fra flow ved betændte endotelceller. En stor fordel ved disse modeller er evnen til at analysere hvert trin i leukocytadhæsion kaskade i orden, som det ville ske in vivo. Vi beskriver også, hvordan begge modeller kan tilpasses til at studere rollen af ​​stromaceller, i dette tilfælde mesenchymstamceller (MSC), i reguleringen leukocytrekruttering.

Primære endotelceller blev dyrket alene eller sammen med humant MSC i direkte kontakt på Ibidi microslides eller på modstående sider af et Transwell filter i 24 timer. Kulturer blev stimuleret med tumornekrosefaktor-alfa (TNFa) i 4 timer og inkorporeres i en flow-baseret adhæsion assay. En bolus af neutrofiler blev perfunderetover endothelium for 4 min. Tilfangetagelsen af ​​strømmende neutrofiler og deres samspil med endotel blev visualiseret ved fasekontrastmikroskopi.

I begge modeller, cytokin-stimulering øget endotel rekruttering af strømmende neutrofiler på en dosis-afhængig måde. Analyse af adfærd rekrutterede neutrofiler udviste en dosisafhængig fald i rullende og en dosis-afhængig stigning i transmigration gennem endotel. I co-kultur, MSC undertrykt neutrofil adhæsion til TNFa-stimuleret endotel.

Vores flow baseret friktionskoefficient modeller efterligne de indledende faser af leukocytrekruttering fra kredsløbet. Ud over leukocytter, kan de anvendes til at undersøge rekruttering af andre celletyper, såsom terapeutisk administreret MSC eller cirkulerende tumorceller. Vores flere lag co-kultur-modeller har vist, at MSC kommunikere med endotel at ændre deres svar på pro-inflammatoriske cytokiner, Altering rekruttering af neutrofiler. Yderligere forskning ved hjælp af sådanne modeller er forpligtet til fuldt ud at forstå, hvordan stromale celler fra forskellige væv og betingelser (inflammatoriske lidelser eller kræft) påvirke rekrutteringen af ​​leukocytter under inflammation.

Introduction

Inflammation er en beskyttende reaktion på mikrobiel infektion eller vævsskade, der kræver stram regulering af leukocyt indsejling i og udsejling fra det betændte væv til at tillade opløsning 1,2. Cross-talk mellem endotelceller (EF) denne linje blodkar, cirkulerende leukocytter og væv-resident stromaceller er afgørende for at koordinere denne proces 3. Men ukontrolleret rekruttering af leukocytter og deres ineffektiv clearance understøtte udviklingen af kroniske inflammatoriske sygdomme 4. Vores nuværende forståelse af leukocytrekruttering i sundhed og sygdom er ufuldstændig og mere robuste modeller er nødvendige for at analysere denne proces.

De mekanismer, der støtter ansættelse af leukocytter fra blod gennem vaskulær EF i post-kapillære venuler er blevet godt beskrevet 1,2,5. Cirkulerende leukocytter indfanges af specialiserede receptorer (fx VCAM-1, E-selectin, P-selectin), somer opreguleret på betændt endotel. Disse kortvarige interaktioner tillader leukocytter at interagere med overflade bundet chemokiner og lipid-afledte mediatorer (enten endotel eller stromale oprindelse), der aktiverer integriner udtrykt af leukocytter 6- 11. Dette vil til gengæld stabiliserer adhæsion og drev migration over endotelet og ind i vævet 12- 15. Inden væv, ansat leukocytter underkastes stromale-afledte stoffer, der påvirker deres motilitet, funktion og overlevelse 16,17. Voksende beviser antyder kraftigt, at signaler, der modtages på hvert trin i rekrutteringsprocessen betingelser leukocytter til det næste. Men vores forståelse af leukocytrekruttering stadig ufuldstændig og meget lidt er kendt om komponenterne forme leukocyt bevægelse inden væv.

I Birmingham har vi udviklet flere in vitro "vaskulære" modeller til at studere rekruttering af leukocytter fraflow 9,18,19. Vi forstår nu, at vaskulær EF-retsakt som umiddelbare regulatorer af leukocytrekruttering reagere på ændringer i deres lokale mikromiljø. Specifikt kan væv-resident stromaceller aktivt regulere inflammatoriske respons, delvist ved samtale med tilstødende vaskulær EF til at påvirke deres rolle i rekrutteringen 3. Vi har tidligere vist, at forskellige stromaceller modulere evne EF at understøtte adhæsion og migrering af leukocytter i en vævsspecifik måde, og at disse virkninger bliver ændret i kroniske sygdomme 13,16,20,21. Således stromaceller etablere væv 'adresse-koder ", der definerer rammerne af hver inflammatorisk reaktion 22. På det seneste har vi vist, at knoglemarv afledt MSC (BMMSC) kraftigt nedregulere respons EF cytokiner, hvilket fører til en reduktion i ansættelse af både neutrofiler og lymfocytter 23.

Mekanismerne af natioerning rekruttering belyst in vitro har i vid udstrækning brugt assays inkorporerer en enkelt celle (f.eks, EF) eller protein i isolation. Men disse undersøgelser ikke tage hensyn til virkningerne af den lokale væv miljø (dvs. tilstedeværelsen af stromale celler) på rekruttering af leukocytter og deres efterfølgende migrering ind i vævet. Her beskriver vi to flow-baserede metoder, hvor stromaceller specifikt mesenchymstamceller (MSC), co-dyrket med EF 23. Sådanne modeller giver os mulighed for at undersøge effekten af ​​stromacellen på endotel reaktioner, især deres evne til at støtte leukocytrekruttering fra flow.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering og dyrkning af primære humane endotelceller og mesenchymale stamceller

  1. Isolering og dyrkning af humane umbilical vene endotelceller (HUVEC):
    1. Sæt navlestrengen på en bakke med køkkenrulle og spray med 70% ethanol. Sted i en vævskultur hætte. Identificer venen og Kanyler i begge ender. Placer en kabelbinder omkring kanyle ende at sikre det.
    2. Skyl veneblod med PBS ved hjælp af en sprøjte. Fyld sprøjten med luft og passere gennem venen at fjerne og kassere den resterende PBS.
    3. Thaw 10 mg / ml collagenase type Ia og fortyndes 1:10 i PBS (med calcium og magnesiumchlorid) til en endelig koncentration på 1 mg / ml. Pass collagenaseopløsning i venen, indtil begge kanyler er fyldt. Luk klemmerne på kanyler i begge ender.
    4. Dæk bakken med væv og spray med 70% ethanol. Placer ledningen i en inkubator i 20 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
    5. Tag ledningen udaf inkubatoren og stram kabelbindere. Massage ledningen forsigtigt i 1 min. Skyl cellesuspensionen med 10 ml PBS og opsamles i et 50 ml centrifugerør.
    6. Fyld sprøjten med luft og passerer gennem venen for at fjerne enhver resterende PBS to gange, opsamling af PBS i et 50 ml centrifugerør anvendt i trin 1.1.5. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    7. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 1 ml komplet EF medium. EF medium består af M199 suppleret med 35 ug / ml gentamicinsulfat, 10 ng / ml human epidermal vækstfaktor, 1 ug / ml hydrocortison, 2,5 ug / ml amphotericin B og 20% ​​føtalt kalveserum.
    8. Tilsæt 4 ml EF medium og EF suspensionen til et 25 cm 2 kolbe. Skift medium på den følgende dag og derefter hver 2. dag.
    9. EF udviser en brosten-lignende morfologi (figur 1ai). For adhæsionsassays er EF generelt seedet, når de når 100% konfluens (se afsnit 1.4
  2. Isolering af Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJMSC) fra humane navlestrenge:
    1. Isoler Whartons jelly-afledte MSC (WJMSC) af friske navlestrenge eller ledninger, der allerede er brugt til at isolere EF. Skær navlestrengen i 5 cm lange stykker. Skær hvert stykke langs for at afsløre de blodkar (2 arterier [White, stiv] og 1 vene [gul, udspilet]).
    2. Brug steril saks og pincet fjerne blodkarrene og kassér. Skær alle væv til 2 - 3 mm 3 stykker. Brug pincet sted 2-3 mm 3 stykker i et 50 ml centrifugerør.
    3. Optø 100 mg / ml stock collagenase type II og fortyndes 1: 100 i 10 ml PBS til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Optø 20.000 U / ml stock hyaluronidase og fortyndes 1: 400 til en slutkoncentration på 50 U / ml i collagenase opløsning.
    4. Tilføj enzymatisk cocktail til centrifugerøret indeholdende vævsfragmenter. Inkubér væv fragmenteringts i 5 timer ved 37 ° C på en langsom rotator.
    5. Cellesuspensionen 1 fortyndes: 5 i PBS. Placer en 100 um pore filter over i en ny 50 ml centrifugerør. Hæld cellesuspensionen på 100 um porefilter.
      BEMÆRK: Resterende vævsfragmenter bevares på filteret og celler vil blive opsamlet i 50 ml centrifugerør.
    6. Kassér filteret. Centrifugeres cellesuspensionen ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender WJMSC pellet i 12 ml komplet WJMSC dyrkningsmedium (DMEM lav glucose, 10% FCS og 100 U / ml penicillin + 100 pg / ml streptomycin mix).
    7. Seed alle celler i en 75 cm2 vævsdyrkningskolbe. Skift mediet efter 24 timer med 12 ml komplet WJMSC dyrkningsmedium. Erstat medium hver 2 - 3 dage. Celler bør nå 70-80% konfluens inden for 2 uger. Passage når WJMSC nå 70-80% konfluens (se afsnit 1.4).
  3. Udvidelse af knoglemarv-afledte MSC (BMMSC): Isoler human knoglemarv afledt MSC (BMMSC) som tidligere beskrevet 24. Tilsæt 10 ml forvarmet MSC vækstmedium (MSCGM) i en 15 ml centrifugerør.
  4. Optø et hætteglas med P2 BMMSC ved anbringelse i et 37 ° C vandbad i 2 min. Tilsæt BMMSC suspension til centrifugerør indeholdende MSCGM. Bland godt ved pipettering.
  5. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten fuldstændig.
  6. Resuspender celler i 1 ml MSCGM og tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en digital celle tæller som en cellometer.
  7. Seed celler i 75 cm2 dyrkningskolber ved en densitet på 5.000 - 6.000 celler pr cm 2 i 12 ml MSCGM. Skift mediet efter 24 timer med 12 ml MSCGM. Feed celler med 12 ml MSCGM hver 2 - 3 dage.
  8. Passage når BMMSC nå 70-80% konfluens (se afsnit 1.4). Celler udviser en fibroblastisk morfologi (fig 1Aii).
  • Detachment af EF og MSC: Aspirer medium fra 25 cm 2-dyrkningskolber. Tilsæt 2 ml 0,02% EDTA i omtrent 2 minutter. Aspirer EDTA og der tilsættes 2 ml trypsin (2,5 mg / ml). Se under mikroskop, indtil cellerne bliver rundt.
  • Tryk på kolben for at frigøre cellerne. Inaktivere trypsin ved tilsætning af 8 ml dyrkningsmedium (afhængig af celletype; EF medium for HUVEC, DMEM LG for WJMSC og MSCGM for BMMSC) til kulturen kolben og suspensionen til et 15 ml centrifugerør.
  • Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten som beskrevet nedenfor.
    1. For passage af MSC, resuspender pellet i 3 ml dyrkningsmedium. Tilføj 11 ml dyrkningsmedium i tre separate 75 cm 2-dyrkningskolber. Tilsæt 1 ml cellesuspension til hver dyrkningskolbe (1: 3 split). Passage WJMSC og BMMSC 3 gange (P3) før anvendelse i co-kultur assays.
    2. Til såning EF, eller MSC i adhæsionsassays - se afsnit 2 og 3.
  • Indefrysning MSC:
    1. Ved passage 3 Tag MSC som beskrevet i afsnit 1.4. Aspirer supernatanten og resuspender i 3 ml iskold CryoSFM. Pipette 1 ml portioner af cellesuspension i 1,5 ml iskold kryoglas. Put kryoglas i en indefrysning container.
    2. Opbevar beholderen ved -80 ° CO / N. Overførsel til flydende nitrogen. Thaw hætteglas MSC (følg trin 1.3.1 - 1.3.6). Resuspender MSC i 5 ml dyrkningsmedium (vælg egnede medie til WJMSC eller BMMSC) og frø i en 25 cm 2 kolbe.
  • 2. Etablering Endothelial-mesenkymale stamceller Co-kulturer på Ibidi Microslides

    1. Trypsinisér en sammenflydende 25 cm 2 kolbe af EF (~ 1,5 x 10 6 celler som afsnit 1.4). Resuspender EF i 380 pi MSCGM (1 x 25 cm 2 kolbe vil seede to 6-kanals Ibidi microslides (~ 1,25 x 10 5 / kanal), for adhæsionsassays alle celle Types dyrkes i MSCGM). Tilføj 30 pi EF suspension til hver kanal (dette vil dække området vækst gennem kapillarvirkning). Inkuber Ibidi mikroobjektglas ved 37 ° C og 5% CO2 i 1 time.
    2. Tilføj 140 pi MSCGM til hver kanal og derefter suge det ud. Gentag to gange for i alt 3 vaske. Tilføj 140 pi MSCGM og plads i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    3. For co-kulturer frigøre MSC (afsnit 1.4). Udfør en celletælling ved hjælp af et hæmocytometer eller en cellometer. Juster koncentrationen af MSC til 1,5 x 10 5 celler / ml.
    4. Aspirer overskydende medium fra Ibidi kanaler (forlader kun vækstområde af kanalen i medium). Tilføj 30 pi af MSC suspension til Ibidi kanaler. Aspirer mediet, der blev skubbet ud fra vækstområde på kanalen, og der tilsættes yderligere 30 pi MSC suspension. Gentag en gang mere, og derefter placere Ibidi mikroobjektglas i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 </ Sub> i 1 time.
    5. Tilføj 140 pi MSCGM til hver kanal og derefter suge det ud. Gentag to gange for i alt 3 vaske. Tilføj et slutvolumen på 140 pi MSCGM til hver kanal og sted i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    6. Optø 1 x 10 5 U / ml stock TNFa og fortyndes 1: 1000 i MSCGM til en endelig koncentration på 100 U / ml (svarende til ca. 10 ng / ml). Udfør en seriel fortynding ved at fortynde 100 U / ml TNFa ved 1:10 i MSCGM at opnå 10 U / ml. Fortynd 10 U / ml TNFa ved 1:10 i MSCGM at opnå 1 U / ml.
    7. Behandl kanaler med TNFa ved 37 ° C i 4 timer før assayet. Temperatursvingninger under cytokin behandling vil ændre mønstre for neutrofilrekruttering observeret. Føj frisk MSCGM til ubehandlede kanaler.

    3. Etablering Endothelial-mesenchymstamceller Cell Co-kulturer på filtre

    1. Frigør WJ eller BMMSC som beskrevet i afsnit 1.4. Resuspender pelleti 1 ml MSCGM. Udfør en celletælling celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en cellometer.
    2. Juster lydstyrken, så den endelige koncentration 5 x 10 5 MSC i 500 pi MSCGM.
    3. Brug steril pincet invertere 6-godt, 0,4 um PET Transwell filtre og sted i en steril boks.
    4. Seed 5 x 10 5 MSC på den ydre overflade af filtrene. Inkuber filtre ved 37 ° C og 5% CO2 i 1 time.
    5. Saml medier fra den ydre overflade af filteret. Tæl antallet af ikke-klæbende MSC i medierne. Re-invertsukker filtre med sterile pincetter og sted i en matchende 6-brønds plade indeholdende 3 ml MSCGM.
    6. Tilsæt 2 ml MSCGM på den indre overflade af filteret (figur 1B). Anbringes i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer. Trypsinisér en sammenflydende 25 cm 2 kolbe af EF (figur 1ai, som afsnit 1.4).
    7. Resuspendér EF i 8 ml MSCGM (1 x 25 cm 2 kolbe will frø fire 6-brønds filtre; ~ 5 x 10 5 EF / filter). Aspirer medium fra toppen og bunden af ​​den porøse filtre. Tilsæt 3 ml frisk MSCGM ind i det nedre kammer (under filter). Tilsæt 2 ml EF suspension til den indre overflade af hvert filter. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2.
    8. Aspirer medium at vaske ikke-klæbende EF og erstatte med frisk MSCGM. Opsætning parallelle EF mono-kultur filtre ved podning celler på den indre overflade uden først seeding MSC. Inkuber O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
    9. Kontroller, at EF-monolag er sammenflydende og indeholder ingen huller. Sub-konfluerende monolag kan ikke anvendes til adhæsionsassays (figur 1b).
    10. Behandl de øvre og nedre kamre i filtrene med 1, 10 eller 100 E / ml TNF (svarende til ~ 10 ng / ml) ved 37 ° C i 4 timer før assay (beskrevet i afsnit 2).

    4. Isolering af leukocytter

    1. Tage venøsblod fra raske frivillige og alikvot umiddelbart i EDTA-rør. Inverter rør forsigtigt for at blande.
    2. Layer 2,5 ml Histopaque 1077 onto 2,5 ml Histopaque 1119 i en 10 ml rundbundet rør. Lag 5 ml fuldblod på Histopaque-gradient. Centrifuger ved 800 x g i 40 minutter ved stuetemperatur.
    3. Harvest perifere polymorfonukleære neutrofiler (PMN) ved grænsefladen af ​​Histopaque 1077 og 1119 (over erythrocyt Layer). Anbringes i et 10 ml rundbundet rør og der fyldes op til 10 ml med PBSA. Vend forsigtigt rør og centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. 7,5% BSA-opløsning 1:50 fortyndes i 100 ml PBS (med calcium og magnesiumchlorid) til en endelig koncentration på 0,15% (w / v; PBSA). Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml PBSA. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Resuspendér i 1 ml PBSA. Tag en 20 pi alikvot af cellesuspensionen og føje til 380 pi PBSA (1:20 fortynding). Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller en cellometer. Der fortyndes til den ønskede koncentration (1 x 10 6 / ml Transwell filtre og Ibidi mikroobjektglas) i PBSA. Oprethold neutrofil suspension ved stuetemperatur, indtil analysen.

    5. Montering af Flow System

    1. Indstil strømmen som vist i figur 1C. Tænd ovnen og sat til 37 ° C. Sæt en 20 ml sprøjte (fjern stemplet) og en 5 ml sprøjte til en 3-vejs hane. Sæt hanen til Perspex kammer hjælp Micropore tape.
    2. Mål og skære et langt stykke af silicium 2/4 mm (tyk) rør, der er ca. afstanden mellem ventilen og den 3-vejs hane. Skær en 8 - 10 mm langt stykke 1/3 mm (tynd) rør og indsætte i den ene ende af den tykke slange. Sæt den tykke slange side på 3-vejs hanen.
    3. Tilslut den tynde slange enden på en havn i det elektroniske 3-vejs mikroventil. Dette er den "vask reservoir". Skær en 6-8 mm langt stykke af tykt og tyndt rør.
    4. Sæt den tynde slangen i den ene ende af den tykke slange. AttACH den tykke slange ender på en 2 ml sprøjte (fjern stemplet).
    5. Tilslut den tynde slange ende af 2 ml sprøjte på en havn på den elektroniske mikroventil at gøre "prøvereservoiret". Tilslut ventilen til filteret strømningskammeret ved at måle og skære et langt stykke tynd slange, som er afstanden mellem mikroventil og centrum af mikroskopbordet.
    6. For mikroobjektglas model, vedhæfte en 8 - 10 mm stykke tyk slange til slutningen af ​​den tynde slange. Placer en L formet stik til slutningen af ​​den tykke slange. Dette vil oprette forbindelse til mikroobjektglas. For filteret model, vedhæfte en 8 - 10 mm stykke Portex Blue Line Manometer forbinder rør til slutningen af ​​den tynde slange.
    7. Anbring tynde rør ende på mikroventil. Dette er den fælles udgang for vask og prøvebeholdere. Fyld reservoirer med PBSA. Prime slange ved at strømme PBSA gennem dem for at fjerne eventuelle luftbobler.
    8. Vedhæft Manometer slange til et 29 mm (50 ml) glas syringe. Prime sprøjten ved at fylde med 10 ml PBSA. Vend sprøjten, således at enden er forbundet til slangen vender opad og skubbe alle luftbobler. Refill med 5 ml PBSA.
    9. For mikroobjektglas eneste model, vedhæfte et 10-12 mm stykke tyk slange til slutningen af ​​Manometer slange der fører til sprøjte glasset. Placer en L formet stik på enden af ​​den tykke slange. Placer sprøjten glasset i en sprøjte pumpe til infusion / tilbagetrækning.
    10. Beregn refill strømningshastighed (Q), der kræves for at generere den ønskede væg forskydningsspænding (τ w i Pascal, Pa) på 0,1 Pa (Transwell filtre) eller 0,05 Pa (Ibidi microslides) ved hjælp af følgende formler:
      γ w = (6.Q) / (WH 2)
      τ = n.γ
      Hvor W = indre bredde og h = indre dybde af strømningskanalen. n = viskositet af den strømmende opløsning; PBSA er n = 0,7 mPa.s. For parallel plade filter strømningskammeret, bredde (w) er 4 mm, og dybden (h) er 0,133 mm. Den depth af kammeret kan variere lidt på grund af forskelle i tykkelsen af ​​Parafilm pakning anvendes. For Ibidi mikroobjektglas, bredden er 3,8 mm, og dybden er 0,4 mm.
      BEMÆRK: På grund af forskelle i dimensionerne af strømningskanalen, og fange dynamik vi bruger forskellige forskydningsspændinger for mikroobjektglas model i forhold til filteret model 6.

    6. Opsætning af Parallel Plate strømningskammer Integrering filtre

    1. Skær et stykke Parafilm (samme størrelse som dækglas) ved hjælp af en metal skabelon. Skær en 20 x 4 mm spalte i Parafilm (at skabe strømningskanalen) ved hjælp af en metal skabelon. Brug pakningen for at markere strømningskanalen på dækglas.
    2. Juster kanterne på 6-brønds filter på dækglas. Sørg for, at filteret dækker strømningskanalen markeringer. Skær forsigtigt filteret ved hjælp af en type 10A skalpel.
    3. Dækker forsigtigt filteret med en Parafilm pakning, der sikrer, at strømningskanalenslot er i midten af filteret (figur 1D). Brug et stykke af ren væv og skubbe ud eventuelle bobler.
    4. Placer dækglasset i fordybningen af ​​bundpladen af ​​Perspex strømningskammeret. Placer toppen Perspex plade over toppen af pakningen og skrue pladerne sammen (figur 1D).
    5. Drej 3-vejs hane at tillade vaskebuffer (PBSA) at strømme gennem ventilen. Slut manometerslangen til indløbsåbningen af ​​den øverste Persex plade. Kør PBSA gennem strømningskanalen for at tillade bobler at passere igennem.
    6. Slut Manometer slange fra sprøjten pumpe i stikkontakten porten på Perspex pladen. Indstil sprøjtepumpen at påfylde og tryk løb. Rens PBSA der har dryppes på den øvre plade af kammeret.
    7. Placer kammeret på scenen af ​​et invert fasekontrastmikroskop. Juster fokus at visualisere EF over filtre (figur 1B).

    7. Opsætning Microslides for Flow </ P>

    1. Placer mikroobjektglas ind på scenen af ​​et invert fasekontrastmikroskop. Forbind L-formet stik i indgangsporten af ​​en kanal. Kør PBSA gennem strømningskanalen.
    2. Placer L formet stik fra sprøjten pumpe i stikkontakten port af kanalen. Indstil sprøjtepumpen at påfylde og tryk løb. Rens PBSA der har dryppet på mikroobjektglas. Juster fokus at visualisere EF monolag.

    8. Perfusion af leukocytter Over endotelceller

    1. Sæt 2 ml renset neutrofiler i prøven reservoiret og lad det varme i 2 min. Vask endotelet med PBSA for 2 min.
    2. Drej ventilen på at perfundere neutrofiler løbet endotel. Aflever neutrofil bolus i 4 min. Drej ventilen OFF og perfundere PBSA fra vask reservoir for resten af ​​eksperimentet.
    3. Kontroller, at luftbobler ikke passerer gennem strømningskanalen på noget tidspunkt under assayet, da dette vil forstyrre EF monolayER og årsag frigørelse af adhærente neutrofiler.

    9. Optagelse Neutrofil Capture og Behavior

    1. Optag neutrofilrekruttering enten under neutrofil flow eller post-perfusion.
    2. Gør alle digitale optagelser af mindst 5 - 10 felter i midten af ​​strømningskanalen. Identificer midten af ​​kanalen ved at flytte målet til kanten af ​​kanalen ved indgangsåbningen og identificere midten af ​​porten.
      1. Til optagelse under neutrofil flow, tage billeder af et enkelt felt hver 10 sek til 1 min. Flyt langs kanalen og optage et andet felt i 1 min. Gentag for varighed af bolus.
      2. Til optagelse efter perfusion, gør 10 sek registrering af 5 - 10 felter ned i midten af ​​strømningskanalen for at vurdere leukocyt adfærd (typisk 2 minutter efter afslutningen af ​​den neutrofile bolus). Tag billeder hvert sekund i 10 sek interval. Dette giver tilstrækkelig tid til opsamling fra flow og adfærd vedhængende neutrophils skal analyseres.
      3. Optag et enkelt felt, der indeholder mindst 10 transmigrated neutrofiler i 5 min, tager billeder hver 30 sek. Dette kan anvendes til at beregne hastigheden af ​​migrerede celler (enten over eller under den endotel).
      4. Optag en anden serie på 10 sek felter (typisk 9 min post-perfusion). Dette tillader neutrofiler tid til at migrere gennem den endotele monolag.
      5. Stop sprøjtepumpen og fjern slangen. Skil strømningskammeret og skyl prøvebeholder og slange. Gentag for de efterfølgende filtre / mikroobjektglas kanaler.

    10. Analyse af leukocytrekruttering og Behavior

    1. Tæl antallet af neutrofiler på hvert område i løbet af de 10 sek optagelser på 2 min tidspunkt. Alle celler skal være til stede i det første andet felt for at blive talt. Celler, der er delvist i området på 2 sider (fx top / højre grænse) i synsfeltet er inkluderet itællingerne, så længe de forbliver inden for hele 10 sek.
    2. Beregn det gennemsnitlige antal vedhængende neutrofil per felt. Mål længden og bredden af ​​den optagne område. Beregn arealet af feltet. Beregn hvor mange felter der er i 1 mm 2. Multiplicer den gennemsnitlige neutrofiltal med antallet af felter i 1 mm 2.
    3. Beregn det samlede antal af neutrofiler perfunderet ved at multiplicere mængden af neutrofiler perfunderet (f.eks 2 x 10 6 / ml * Q [fx 0,0999 ml / min for parallel plade strømningskammeret]) ved varigheden af bolus (fx 4 min ).
    4. Opdel neutrofiltal / mm 2 med det samlede antal af neutrofiler perfunderet at bestemme det samlede antal af celler, som har adhæreret (adhærente celler / mm 2/10 med 6 perfunderet).
    5. Vurdere, om den vedhængende neutrofiler er rullende, fast vedhængende eller transmigrated (Supplerende Video 1 og 2).
      1. Arullende neutrofil er fase lys og vil langsomt bevæge sig langs endotelmonolaget (1 - 10 um / sek Supplerende Video 1).
      2. Fast vedhæftende celler er fase lyse og bundet til EF-overflade, enten resterende stationære (dvs. ikke bevæger sig under optagelse) eller har undergået forandring form og flytter over EF overflade (Figur 1Ei).
      3. En transmigrated neutrofil er fase mørke og under EF-lag (figur 1Eii).
    6. Procentdelen af ​​vedhængende celler, som rullende, stationære og transmigrated. Alternativt kan neutrofil adfærd udtrykkes som totale celleantal, der udviser de forskellige adfærd ved at anvende samme formel, der anvendes til at beregne den samlede friktion (som beskrevet i trin 10,6-10,7).
      1. Mark forkanten af ​​en rullende neutrofil. Marker forkanten af ​​den samme celle ved slutningen af ​​10 sek sekvens. Tegn en linje væddemållem 2 point og måle den afstand, cellen har bevæget sig.
      2. Divider denne værdi med varigheden af optagelsen, hvor cellen er rullende (dvs. 10 sek). Prøv og vælg neutrofiler, der er på området for hele 10 sek interval.
    7. For at beregne hastigheden af neutrofiler migrerer over overfladen (formede ændret fase lys), eller under endotel (fase mørk) bruge 5 min optagelse (Supplerende Video 2).
      1. Tegn en skitse af migrerede celler ved begyndelsen af ​​sekvensen og spore deres bevægelser hele sekvensen. Læg mærke til X og Y positioner af geometriske tyngdepunkt på hver 1 min interval for hver celle. Fratræk værdier af X og Y-positionen fra det første billede i sekvensen fra værdierne i det andet billede. Dette er baseret på Pythagoras 'læresætning.
      2. Fratræk værdierne fra det andet billede fra det tredje billede. Gør dette for alle billeder i sekvensen. Square than X- og Y-værdier, og tilføje dem sammen.
      3. Kvadratrod den resulterende værdi. Beregn hastigheden for hver celle ved midling af hastigheder beregnes for hvert minutters interval. Track 10 migrerede neutrofiler og beregne det gennemsnitlige hastighed.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Oprindeligt analyserede vi effekten af stimulerende EF med TNFa om rekruttering af neutrofiler fra flow ved hjælp af Ibidi mikroobjektglas model (Afsnit 7 - 9). I fravær af TNFa, lidt eventuelle neutrofiler klæbet til endotelmonolaget (figur 2A). Det var forventet, da ubehandlet / hvilende EF udtrykker ikke de nødvendige adhæsionsmolekyler (selectiner) eller kemokiner at støtte bindende 25,26. I modsætning hertil cytokin-stimulering steget betydeligt neutrofil adhæsion til endotelet på en dosis-afhængig måde (figur 2A). Adhæsion normalt forbliver stabil i løbet af assayet. Binding af leukocytter til ubehandlet endotel indikerer, at enten EF aktiveres (dvs. kontamineret med LPS under dyrkningen processen) og / eller neutrofiler blev aktiveret under isolation processen. Faktisk har LPS vist sig at øge ekspressionen af ​​E-selectin, ICAM-1 og VCAM-25-27 januar på overfladen af EF, så de kan binde neutrofiler.

    Ved analyse af adfærden af de rekrutterede neutrofiler vi typisk iagttage et dosisafhængigt fald i procentdelen af neutrofiler rullende (figur 2B) med en samtidig dosisafhængig stigning i procentdelen af neutrofiler, der migrerer gennem endotel monolag (figur 2C). Ved de lavere doser af TNFa-stimulering (1 U / ml) en større andel af neutrofiler vises fase lyse indikerer, at de er bundet til den apikale overflade af endotelet (figur 2B). I modsætning, på 10 og 100 U / ml (højere doser) ca. 40% af de rekrutterede neutrofiler vises fase mørke ved 2 min indikerer, at disse celler har migreret gennem endotelmonolaget og er under endothelium (figur 2C). Neutrofiler er i stand til at migrere gennem EF inden for 1 - 2 minutter med transmigration nå maximal niveauer på ~ 10min post-perfusion 28. Her observerede vi en stigning i neutrofil transmigration fra 40% ved 2 min til 60% med 9 minutter efter perfusion (figur 2C). Vi observerede ingen effekt af TNF-koncentration på hastigheden af ​​rullende (~ 3 um / sek) eller migrering (~ 10-12 um / min) neutrofiler.

    I filteret model, TNFa-stimulering forøget neutrofil adhæsion på en dosis-afhængig måde svarende til den, der ses ved anvendelse af Ibidi mikroobjektglas model (figur 3A). Med hensyn til adfærd, neutrofil rullende var upåvirket af TNFa dosis (figur 3B), medens en dosisafhængig stigning i procentdelen transmigration blev observeret (figur 3C). I denne serie af forsøg observerede vi ingen signifikant effekt af tid på neutrofil transmigration (figur 3C).

    Vi leverer metoder til, hvordan man kan generere to forskellige co-kultur konstruktioner, der hversom er udformet for at besvare specifikke spørgsmål. I Ibidi mikroobjektglas model, EF og MSC dyrkes i et enkelt monolag i direkte kontakt med hinanden. Denne model er anvendelig til at undersøge virkningen af ​​terapeutisk injektion af MSC i blodet og den efterfølgende integration i EF monolaget. I modsætning i filter-baserede model, EF og MSC dyrkes på modstående sider af filteret i umiddelbar nærhed, men ikke nødvendigvis i direkte kontakt. Dette ligner mere væv, med endotelceller danner et monolag repræsenterer blodkarret og MSC bopæl i subendotele rum. Dette giver os mulighed for at undersøge effekten af ​​væv-resident MSC på svaret fra EF til cytokinstimulering.

    Baseret på vores erfaringer, observere vi, at maksimal neutrofil rekruttering og transendothelial migration opstår, når EF stimuleres med 100 U / ml TNFa. Som sådan har vi anvendt denne koncentration til at undersøge virkningen af ​​MSC co-kulturpå endotel rekruttering af neutrofiler fra flow. Her præsenterer vi data for BMMSC i co-kultur med EF ved hjælp af mikroobjektglas og filter-baserede modeller kan dog også undersøges andre typer MSC f.eks WJMSC. I begge modeller tilstedeværelsen af BMMSC væsentligt reduceret neutrofil adhæsion til EF sammenlignet med EF dyrket alene (figur 4A). Co-kultur havde ingen effekt på adfærd rekrutterede neutrofiler, med lignende niveauer af rullende og transmigration observeret på EF dyrket alene eller med MSC (figur 4B og C). Således kan MSC ændre EF reaktion på cytokinstimulering, der undertrykker deres evne til at understøtte neutrofil rekruttering fra flow.

    Figur 1
    Figur 1. Etablering EF-MSC co-kultur og analyse neutrofilrekruttering ved hjælp af en flow-baseret adhæsionsassay. (A) (i) den primære EF og (ii) passage 3 BMMSC dyrket på vævskulturkolber. (B) mikrograf af EC og MSC dyrket på 6 brønde Transwell filterindsatse. (C) Diagram af perfusion, der anvendes til at generere flow. (D) Skematisk repræsentation af parallelle plader filter strømningskammeret. (E) Micrograph af (i) fast klæbende (FA) og (ii) transmigrated (TM) neutrofiler efter rekruttering fra flow til EF stimuleret med 100 U / ml TNFa . Billeder C og D er taget fra figur 2 og 3 i Methods in Molecular Biology:. T-celle Trafficking, 2010, s 53-54 28 med venlig tilladelse fra Springer Science og Business Media Klik her for at se en større udgave af dette figur.


    . Figur 2. neutrofilrekruttering fra flow til TNFa-stimulerede EF hjælp Ibidi microslides EF blev stimuleret med stigende koncentrationer af TNFa (0-100 U / ml) i 4 timer. En 4 min bolus af neutrofiler blev perfunderet over EF monolag ved 0,05 Pa. (A) neutrofiladhæsion vurderet ved 2 min. ANOVA viste en signifikant virkning af TNFa behandling på neutrofil adhæsion, p <0,01. Neutrofil opførsel blev vurderet på 2 og 9 minutter og udtrykt som en procentdel af klæbende celler, der var (B) valsning eller (C) transmigrated. ANOVA viste en signifikant effekt af TNF-behandling på opførslen af ​​vedhængende neutrofiler, p <0,001. I C, ANOVA viste en betydelig tid på transmigrated neutrofiler p <0,01. Data er gennemsnit ± SEM fra n = 3 eksperimenter. * P <0,05 og **p <0,01 sammenlignet med den ikke-stimulerede (0 U / ml), EF kontrol Dunnett post-test. ## p <0,01 og ### p <0,001 sammenlignet med 1 U / ml EF på samme tidspunkt af Bonferroni post test.

    Figur 3
    . Figur 3. neutrofilrekruttering fra flow til TNFa-stimulerede EF anvendelse filter assay EF blev stimuleret med stigende koncentrationer af TNFa (0-100 U / ml) i 4 timer. En 4 min bolus af neutrofiler blev perfunderet over EF monolag på 0,1 Pa. (A) neutrofiladhæsion vurderet til 2 min. ANOVA viste en signifikant virkning af TNFa behandling på neutrofil adhæsion, p <0,001. Neutrofil opførsel blev vurderet på 2 og 9 minutter og udtrykt som en procentdel af klæbende celler, der var (B) valsning eller (C) transmigrated. I C, ANOVA showed en signifikant effekt af tid og cytokin behandling på neutrofil transmigration, p <0,05. Data er gennemsnit ± SEM fra n = 3 eksperimenter. ** P <0,01 og *** p <0,001 sammenlignet med ikke-stimulerede (0 U / ml), EF kontrol Dunnett post-test. # P <0,05 i forhold til 1 U / ml EF på samme tidspunkt af Bonferroni stolpe -test.

    Figur 4
    Figur 4. neutrofilrekruttering fra flow til TNFa-stimulerede EF-BMMSC co-kulturer. BMMSC blev co-dyrket med EF i 24 timer forud for stimulering med 100 U / ml TNFa i 4 timer. En 4 min bolus af neutrofiler blev perfunderet over EF monolag ved 0,05 Pa for (A, C, E) microslides og 0,1 Pa for (B, D, F) filtre. (AB) neutrofiladhæsion blev vurderet på 2 min. Neutrofil opførsel blev vurderet ved 2 og 9 mi og udtrykt som en procentdel af klæbende celler, der var (CD) valsning eller (EF) transmigrated. I C og D, ANOVA viste en signifikant effekt af dyrkningsbetingelser på neutrofile rullende, p <0,05. I E og F, ANOVA viste en signifikant effekt af tid på neutrofil transmigration, p <0,05. Der blev dog ikke observeret nogen signifikante forskelle i sjælevandring mellem de enkelte behandlinger af Bonferroni post-test. Data er gennemsnit ± SEM fra n = 5 eksperimenter. * P <0,05 sammenlignet med EF-monokultur ved parret t-test eller Bonferroni post-test.

    Supplerende Video 1. Analyse af neutrofile rullende hastigheder. EF dyrkes på et Transwell filter blev stimuleret med 100 U / ml TNFa i 4 timer. En bolus af neutrofiler blev perfunderet over EF for 4min. Repræsentant digitaliseret sekvens af et enkelt 10 sek område taget 2min post-perfusion. Ændringen i position af en enkelt rullende neutrofil fra begyndelsen til slutningen af ​​10 sek sekvens kan anvendes til at beregne den hastighed, hvormed neutrofile ruller.

    Supplerende Video 2. Analyse af neutrofilmigration hastigheder. EF dyrkes på et Transwell filter blev stimuleret med 100 U / ml TNFa i 4 timer. En bolus af neutrofiler blev perfunderet over EF for 4 min. Repræsentant digitaliseret sekvens af en enkelt 5 min felt til at spore flytning af transmigrated neutrofiler. Dette kan anvendes til at beregne hastighed.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller til at studere rekruttering af cirkulerende neutrofiler ved betændt endotel. En stor fordel ved disse modeller er evnen til at analysere hvert trin i leukocytadhæsion kaskade i orden, som det ville ske in vivo. Vi har tidligere observeret en dosisafhængig stigning i neutrofil adhæsion til og transmigration gennem TNFa-stimuleret EF 9,29. Vi beskriver også, hvordan begge modeller kan tilpasses til at studere virkningerne af stromale celler på leukocytrekruttering. Her MSC blev co-dyrket med EF i en Ibidi mikroobjektglas eller på modsatte sider af en porøs filter. Dette giver begge celletyper til at kommunikere med hinanden og derved modificere hinandens fænotype og respons. Vi har vist her, og i tidligere undersøgelser 23, at tilstedeværelsen af MSC undertrykt neutrofil adhæsion til TNFa-stimulerede EF. Dette indikerer, at stromaceller ændre EF svartil cytokiner og efterfølgende ændrer rekruttering af cirkulerende leukocytter.

    Ud over de modeller, der er beskrevet ovenfor, Cellix Biochips, Bioflux plader og Glyotech parallel plade strømningskamre er kommercielt tilgængelige Flow kanalsystemer, der giver en overflade til dyrkning endotel og observere rekruttering. I alle systemer bør visse parametre overvejes samtidig oprette endotel kulturer og udførelse af flow-baserede adhæsionsassays, hvoraf nogle er fremhævet nedenfor og i tidligere rapporter 30,31. Eventuelle antiinflammatoriske midler, såsom hydrocortison, der kan påvirke cytokinresponser bør udelades fra mediet for varigheden af den kultur og assay 18,29. Når du bruger Ibidi mikroobjektglas sikre, at der ikke er luftbobler til stede i strømmen kanalen under dyrkningen i EF, da disse vil forstyrre EF-monolag. Integriteten af ​​endotelmonolaget bør bekræftes før cytokine-behandling, som neutrofiler vil binde til hullerne i monolag, hvor BSA har belagt den mikroobjektglas / filter. Det er også vigtigt at sikre, at EF holdes på 37 ° C under hele cytokin-stimulering, fordi TNFa er temperaturfølsom og kun har den maksimale effekt ved 37 ° C. For flow assay selv vælge en passende vaskebuffer, vi bruger typisk PBSA for korte assays (mindre end 30 minutter) og M199 medium suppleret med BSA (0,15%) for længere assays (1 - 48 timer) 30,31. Endelig sikre, at der ikke er luftbobler til stede i strømningskanalen under assayet, da dette forstyrrer strømningshastighed skader EF monolaget og aktiverer adhærente neutrofiler.

    En af de store fordele ved de multi-cellulære in vitro-modeller er beskrevet her, er deres evne til at replikere in vivo interaktioner mellem EF og stromaceller. Det er vanskeligt at isolere virkningerne af specifikke stromale komponenter in vivoog at ændre dem på en kontrolleret måde. I vores modeller kan stromaceller manipuleres til at belyse, hvorledes de kommunikerer med EF og påvirke den inflammatoriske proces i sundhed og sygdom. For eksempel ved anvendelse af siRNA teknologi, vi har tidligere vist, at produktion af IL-6 ved MSC i løbet af co-dyrkning var nødvendig for deres immunosuppressive virkninger 23. Hver model kan bruges til at behandle specifikke spørgsmål dvs. effekten af væv-resident stromale celler (filter-baserede model) eller terapeutisk administreret stromale celler (Ibidi microslides og andre kommercielt tilgængelige systemer) på leukocytrekruttering. I begge tilfælde har vi titreret forskellige stromale celletyper for at sikre deres levedygtighed og at etablere passende forhold mellem stromacelle til EF til vurdering effekter på rekruttering 15,25. Tilsvarende dyrkningsmedium skal være forenelige med hver celletype indarbejdes i modellen. I vores hænder co-kulturer udføres typisk i stromal celle medium 11,18,23,31.

    Brug af filter-baserede model har vi tidligere vist, at forskellige stromaceller modulere evne EF at understøtte adhæsion og migrering af leukocytter i en vævsspecifik måde, og at disse virkninger bliver ændret i kroniske sygdomme 3. Dette førte til begrebet at stromaceller etablere vævsspecifikke "adresse koder", som aktivt regulerer ansættelse af leukocytter til betændt væv 24. Disse modeller er specielt designet til at undersøge de indledende faser af rekruttering i detaljer, men er ude af stand til at studere den efterfølgende migration i subendotelrummet (dvs. væk fra endotelet i vævet). Multi-cellulære, flerlags 3D konstruktioner såsom en statisk collagengel assay 12,32 ville være mere passende for at studere disse sidste faser af rekruttering.

    Vores flow-baserede adhæsion modeller er meget alsidig. Vi har described deres anvendelse i forbindelse med neutrofil rekruttering, men andre leukocytundergrupper kan undersøges på en lignende måde. Vi har også brugt Ibidi mikroobjektglas system til at undersøge rekrutteringen af cirkulerende MSC af EF 23, og om dette sker gennem den samme vedhæftning kaskade rapporteret for leukocytter. Ligeledes disse modeller kan anvendes til at undersøge rekruttering og inkorporering af metastatiske tumorcellelinjer, og deres efterfølgende virkninger på endotel svar og leukocytrekruttering. Alternativt kan filteret baseret model tilpasses til at optage forskellige typer af stromaceller (fx fibroblaster, podocytter, glatte muskelceller) fra raske væv 13,21 og steder af sygdom 11,18,20. Dette vil gøre det muligt at studiet af vævsspecifikke regulerende veje, der handler på niveau med den EF og / eller leukocytter. I alle tilfælde kan undersøges forstyrrelse af normale regulatoriske processer i en række sygdomstilstande at identificere key regulatoriske mediatorer (såsom IL-6 og TGFp) og potentielle nye terapeutiske mål. I forbindelse med kronisk inflammation disse midler kan anvendes til at slukke for rekrutteringsprocessen, mens der i cancer biologi man kunne forestille sig deres anvendelse for at tænde rekruttering til at målrette tumoren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7, (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91, (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6, (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164, (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82, (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142, (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6, (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28, (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39, (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85, (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131, (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7, (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187, (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48, (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54, (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52, (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43, (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88, (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193, (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26, (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31, (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136, (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317, (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40, (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics