पूरे ऊतक और बायोप्सी से मानव उपकला Enteroids और Colonoids की स्थापना

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Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy. J. Vis. Exp. (97), e52483, doi:10.3791/52483 (2015).

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Abstract

Introduction

जठरांत्र पथ के अस्तर उपकला लगातार नवीकरण में है। यह प्रक्रिया लगातार यह खत्म हो जाता है के रूप में तेजी से आंतों उपकला को बदलने के लिए संतान की उपज है, जो आंतों स्टेम कोशिकाओं (ISCs) के प्रसार से शुरू हो रहा है। ISCs शामिल प्रफलन डिब्बे तहखाने की तह तक ही सीमित है। ISCs अंततः अवशोषण या स्रावी प्रजातियों में अंतर है, जो संतान को जन्म दे। वे लुमेन एक में विभाजन से पहले ऊपर की तरफ विस्थापित के रूप में तहखाना के बाहर और अंकुर या सतह उपकला पर चल रहा है, कोशिकाओं उत्तरोत्तर अंतर। ISCs enterocytes, microfold कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं, जाम कोशिकाओं, गुच्छा कोशिकाओं और Paneth कोशिकाओं सहित सभी आंतों उपकला कोशिका प्रकार को जन्म दे। पेट के बिखरे हुए enteroendocrine और गुच्छा कोशिकाओं 2 के साथ ज्यादातर colonocytes और जाम कोशिकाओं से बना लम्बी तहखाने, की विशेषता है।

पूर्व vivo संस्कृतिसंरचना सिस्टम आईएससी रखरखाव और आंतों ऊतक homeostasis के अध्ययन के लिए होनहार उपकरण का गठन। शारीरिक स्थितियों को पूरी तरह से reproduced और उपकला microenvironment अक्सर 3,4 बदल नहीं कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि यह टिशू कल्चर तकनीक पर भरोसा करने के लिए मुश्किल है। आईएससी क्षेत्र में एक बड़ी प्रगति को बनाए रखने और सामान्य आंत्र आला संकेतों को बदलने के लिए परिभाषित वृद्धि कारकों का उपयोग कर व्यक्ति murine ISCs विस्तार करने के लिए टिशू कल्चर तकनीक की स्थापना की थी। लंबे समय तक संस्कृति शर्तों सातो एट अल द्वारा वर्णित किया गया।, जिसमें एक तहखाने या आंतों उपकला से पृथक स्टेम कोशिकाओं कई तहखाना-जैसे डोमेन 5-7 सहित तीन आयामी उपकला संरचनाओं फार्म विकसित करने के लिए। ये निरीक्षण संरचनाओं लगातार विस्तार करने के विखंडन की घटनाओं से गुजरना। दिलचस्प है, मूल के ऊतक के लिए विशिष्ट सभी आंतों प्रकार की कोशिकाओं का उत्पादन कर रहे हैं और साथ ही एक लुमेन 8 में चली जाती हैं। इस प्रणाली के संशोधनों का प्रयोग, उपकलाorganoids पेट, छोटी आंत और पेट से उत्पन्न हो सकता है। अधिक विशेष रूप से, छोटी आंत से उपकला organoids enteroids 9 कर रहे हैं, और पेट से उन colonoids 9,10 हैं। ये उपकला organoid संस्कृति प्रणालियों इस प्रकार अलग कक्षों 5,6,10-15 की "stemness" परीक्षण, इन विट्रो में स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य करने के लिए पृथक एकल कक्षों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। अन्य जांचकर्ताओं व्यक्ति उपकला कोशिकाओं 16-21 के समारोह में अध्ययन करने के लिए enteroids और colonoids दोनों का इस्तेमाल किया है। इस प्रकार, enteroid और colonoid संस्कृतियों दोनों स्टेम और गैर स्टेम सेल कार्यों का मूल्यांकन करने और आंतों के भीतर मौलिक सेलुलर बातचीत में नई जानकारी देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2011 में, सातो और उनके सहयोगियों ने मानव छोटी आंत और पेट 22,23 से निकाली गई उपकला organoids के दीर्घकालिक संस्कृति उत्पन्न। मीडिया संरचना, मानव उपकला enteroids में मतभेद के अलावाऔर colonoids उनके murine समकक्ष के रूप में एक ही सुविधाओं दिखा रहे हैं। इसके अलावा, वे इस तरह के बैरेट घेघा, ग्रंथ्यर्बुद या ग्रंथिकर्कटता, और सिस्टिक फाइब्रोसिस 22,24 के रूप में रोगग्रस्त ऊतकों से उत्पन्न किया जा सकता है। मानव enteroids आंतों स्टेम सेल और उपकला श्लैष्मिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और सामान्य और असामान्य दोनों जठरांत्र फिजियोलॉजी तीन अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास प्रायोगिक प्रणाली के रूप में काम करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का गठन।

यहाँ हम मानव छोटी आंत और पेट के तहखाने (चित्रा 1) से enteroids और colonoids स्थापित करने की विधियों का वर्णन। इस पद्धति की समीक्षा में, हम पूरे ऊतक और बायोप्सी से तहखाना संग्रह पर जोर। हम सफल विकास और मानव enteroids और colonoids और इस मॉडल से बाहर किए गए संभव प्रयोगात्मक रणनीतियों के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं कि संस्कृति के तौर तरीकों पुनरावृत्ति।

Protocol

नोट: आचार कथन: CCHMC पर एक आईआरबी द्वारा अनुमोदित किया गया था के साथ साथ वर्णित मानव ऊतकों का उपयोग करते समय प्रयोग (आईआरबी # 2012-2858; # 2014-0427)। ऊतक संग्रह, भंडारण, और नमूने के उपयोग के लिए सूचित सहमति CCHMC पर दानदाताओं से प्राप्त हुई थी।

संस्कृति के लिए 1. तैयारी

नोट: सभी अभिकर्मकों 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।

  1. इस प्रकार के रूप EDTA के शेयर समाधान तैयार: 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड, ultrapure एच 2 हे, 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल फिल्टर में पीएच 8 (EDTA) तैयार करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अनिश्चित काल के लिए आरटी पर EDTA के शेयर समाधान की दुकान।
  2. इस प्रकार के रूप chelating बफर तैयार: 2% सोर्बिटोल, 1% सुक्रोज, 1% गोजातीय सीरम albumin अंश वी (बीएसए) मिश्रण और 1x Gentamicin / है Dulbecco फास्फेट में Amphotericin समाधान सीए के बिना खारा बफर 2 + और ​​2 मिलीग्राम + (DPBS), फिल्टर निष्फल 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ। Chelating buf तैयार करेंfer ताजा।
  3. Wnt -3 ए-वातानुकूलित मध्यम निर्माता के निर्देशों (ATCC, सीआरएल-2647) के अनुसार सेल लाइन एल Wnt -3 ए का उपयोग कर घर में किया जाता है इस प्रकार है: मध्यम Wnt -3 ए-वातानुकूलित तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल 2 मिमी glutamine, 10 मिमी HEPES, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एन 2 पूरक, एक B27 पूरक, 1% BSA और फिल्टर के साथ मध्यम अनुपूरक।
    नोट: टेस्ट एक TOPflash परख का उपयोग Wnt गतिविधि के लिए हर बैच। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Renilla luciferase परख किट के साथ एक स्थिर HEK293 TOPflash सेल लाइन (हंस Clevers लैब) का प्रयोग करें। 100 एनजी / एमएल मानव पुनः संयोजक Wnt -3 ए के साथ TOPflash परख मानक के अनुसार। नियंत्रण की तुलना में वातानुकूलित मीडिया के कम से कम एक 10 गुना-परिवर्तन गतिविधि की पुष्टि करें। अप करने के लिए 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और फ्रीज में 10 मिलीलीटर aliquots में ताजा Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम फूट डालो। स्टोर गतिविधि की हानि के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए aliquots के ऊपर thawed।
  4. पीआर0.22 के साथ निष्फल 2 मिमी glutamine, 10 मिमी HEPES, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 ग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एन 2 पूरक, एक B27 पूरक, 1% BSA और फिल्टर के साथ पूरक उन्नत DMEM / F12 मध्यम प्रकार है: मानव minigut मध्यम epare माइक्रोन फिल्टर।
    नोट: ऊपर से 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और फ्रीज में 10 मिलीलीटर aliquots में ताजा मानव minigut मध्यम फूट डालो। स्टोर गतिविधि की हानि के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए aliquots के ऊपर thawed।
  5. के रूप में निम्नानुसार पूर्ण मानव minigut मध्यम तैयार: तहखाना संस्कृति या 50% Wnt -3 ए-वातानुकूलित मध्यम (1.3 देखें), एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / आर-spondin 1 (1 के साथ पूरक मध्यम परिवर्तन मानव minigut मध्यम (1.4 देखें) से पहले ताजा तैयार: 1000 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर), 100 एनजी / एमएल नोगिन के कमजोर पड़ने (1: 1000 100 ग्राम / एमएल शेयर), 50 एनजी / एमएल EGF (1 के कमजोर पड़ने: 500 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल शेयर) के 10,000 कमजोर पड़ने, 500 एनएम एक-83 -01: ​​10 माइक्रोन SB202190 (1 1,000 कमजोर पड़ने 500 मीटर शेयर की) (1: 3000 कमजोर पड़ने 30 मिमी शेयर की), 10 एनएम [लियू] 15-Gastrin 1 (1: 100 माइक्रोन के 10,000 कमजोर पड़नेशेयर), 10 मिमी Nicotinamide (1: 100 कमजोर पड़ने 1 एम के शेयर) और (1 1 मिमी एन एसिटाइलसिस्टीन: 1,000 कमजोर पड़ने 1 एम शेयर की)।
    नोट: गतिविधि की हानि के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए स्टोर पूरा मानव minigut मीडिया।

पूरे ऊतक से 2. तहखाना अलगाव

नोट: ऊतक संग्रह से, यह खारा में नमूना बनाए रखने के लिए आवश्यक है। यह परिवहन के दौरान बर्फ पर ऊतक रखने के लिए सिफारिश की है। तहखाना के अलगाव के लिए नमूने की तैयारी के रूप में जल्द से जल्द किया जाना चाहिए।
नोट: सभी अभिकर्मकों तालिका 1, औजार, उपकरण में सूचीबद्ध हैं, और उपभोग्य 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं।

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले सभी अभिकर्मकों तैयार करें। बर्फ और पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना पूर्व सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली।
    नोट: वैकल्पिक रूप से अच्छी तरह से एक 24 के केंद्र में / 15 μl का उपयोग कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक पतली परत बना-well प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह और। यह ऐच्छिक कदम polymerization के दौरान एक बूंद के रूप में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रहता है।
  2. साथ ऊतक धोएं ठंडा है Dulbecco फास्फेट सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + (DPBS) के बिना खारा buffered। DPBS के सामग्री स्पष्ट है जब तक आगे बढ़ें।
  3. 0.2 मिमी व्यास minutien पिन का उपयोग कर, बर्फ ठंड DPBS के साथ भरा एक सिलिकॉन लेपित गिलास पेट्री डिश पर ऊतक सुरक्षित। खिंचाव और mucosal पक्ष का सामना करना पड़ के साथ फ्लैट ऊतक पिन।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, सूक्ष्म विदारक कैंची और अच्छी बात घुमावदार संदंश का उपयोग submucosa और संयोजी ऊतक से overlying म्यूकोसा हटाने के लिए (चित्रा 2A, बी)।
  5. खिंचाव और mucosal पक्ष का सामना करना पड़ के साथ सिलिकॉन लेपित गिलास पेट्री डिश पर विच्छेदित म्यूकोसा फ्लैट पिन। शेष submucosa और संयोजी ऊतक त्याग या आगे के प्रयोगों (चित्रा -2) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. धीरेघुमावदार संदंश के साथ म्यूकोसा की सतह परिमार्जन। यह कदम तैयारी की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक है।
    1. छोटी आंत के लिए, धीरे विल्ली दूर करने के लिए म्यूकोसा परिमार्जन।
    2. पेट के लिए, धीरे श्लेष्मा और मलबे को हटाने के लिए म्यूकोसा परिमार्जन।
  7. विल्ली और मलबे को हटाने के लिए बर्फ ठंड केलेशन बफर के साथ म्यूकोसा 3-4 बार धोएं।
  8. (49.6 मिलीलीटर केलेशन बफर में 200 μl 0.5 एम EDTA) हौसले से तैयार 2mm EDTA के केलेशन बफर के साथ म्यूकोसा कवर।
  9. बर्फ पर पेट्री डिश प्लेस और एक क्षैतिज कक्षीय प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए धीरे हिला।
  10. EDTA के बिना ऊतक ठंडा केलेशन बफर के साथ 3-4 बार धोएं। धोने के बाद, बहुत ठंडा केलेशन बफर में म्यूकोसा छोड़ दें।
  11. घुमावदार और ठीक संदंश का उपयोग कर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत म्यूकोसा की प्रक्रिया। धीरे घुमावदार संदंश का उपयोग आंतों तहखाने को रिहा करने म्यूकोसा परिमार्जन।
  12. धीरे से एक गड़बड़ी का उपयोग कर पेट्री डिश से तहखाना निलंबन हटा देंpette एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में यह हस्तांतरण और।
    नोट: लगभग सभी तहखाने म्यूकोसा से हटा दिया गया है कि सुनिश्चित करने के लिए ऊतक की जाँच करें।
  13. 2 बार जाल एक 150 माइक्रोन के माध्यम से तहखाने निलंबन फ़िल्टर।
    नोट: एक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 डी) के तहत प्रवाह के माध्यम से तहखाना संवर्धन के लिए जाँच करें।
  14. 50 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर तहखाना निलंबन 5 मिनट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  15. 5 मिलीलीटर बर्फ ठंड केलेशन बफर में गोली resuspend।
  16. कदम 2.15 से निलंबन से 10 μl ड्रॉप प्रति तहखाने की संख्या की गणना। एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब को चढ़ाना के लिए आवश्यक तहखाने की संख्या स्थानांतरण। Enteroids या colonoids स्थापित करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से पकवान के प्रति अच्छी तरह से 200 से 500 तहखाने का उपयोग करें।
  17. अपकेंद्रित्र 150 ग्राम पर 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए तहखाना अंश। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  18. बाद में संस्कृति के लिए तहखाने का उपयोग करें।

बायोप्सी से 3. तहखाना अलगाव

  1. पहले सभी अभिकर्मकों तैयार करेंप्रयोग की शुरुआत। बर्फ और पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना पूर्व सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली।
  2. साथ बायोप्सी धोएं ठंडा है Dulbecco फास्फेट सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + (DPBS) के बिना खारा buffered।
  3. 0.1 मिमी व्यास minutien पिन का उपयोग कर, बर्फ ठंड DPBS के साथ भरा एक सिलिकॉन लेपित गिलास पेट्री डिश पर बायोप्सी सुरक्षित। खिंचाव और mucosal पक्ष (चित्रा 2 ई) का सामना करना पड़ के साथ फ्लैट म्यूकोसा पिन।
  4. धीरे विल्ली और मलबे को हटाने के लिए घुमावदार संदंश के साथ म्यूकोसा की सतह परिमार्जन। यह कदम तैयारी की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक है।
  5. विल्ली और मलबे को हटाने के लिए बर्फ ठंड केलेशन बफर के साथ बायोप्सी 3-4 बार धोएं।
  6. (49.8 मिलीलीटर केलेशन बफर में 200 μl 0.5 एम EDTA) हौसले से तैयार 2mm EDTA के केलेशन बफर के साथ बायोप्सी कवर।
  7. बर्फ पर पेट्री डिश प्लेस और एक क्षैतिज कक्षीय प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए धीरे हिला।
  8. <ली> EDTA के बिना बायोप्सी ठंडा केलेशन बफर के साथ 3-4 बार धोएं। धोने के बाद, बहुत ठंडा केलेशन बफर में बायोप्सी के लिए छोड़ दें।
  9. घुमावदार और ठीक संदंश का उपयोग कर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत बायोप्सी प्रक्रिया। धीरे म्यूकोसा घुमावदार संदंश का उपयोग आंतों तहखाने जारी करने के लिए परिमार्जन।
  10. धीरे एक विंदुक का उपयोग पेट्री डिश से तहखाना निलंबन हटाने और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण।
    नोट: लगभग सभी तहखाने म्यूकोसा से हटा दिया गया है कि सुनिश्चित करने के लिए ऊतक की जाँच करें।
  11. एक 150 माइक्रोन नायलॉन के माध्यम से तहखाना निलंबन 2 बार जाल फिल्टर।
    नोट: एक खुर्दबीन के नीचे प्रवाह के माध्यम से तहखाना संवर्धन के लिए जाँच करें।
  12. 50 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर तहखाना निलंबन 5 मिनट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड केलेशन बफर में गोली resuspend। एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब तहखाना निलंबन स्थानांतरण।
  14. अपकेंद्रित्र 150 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए तहखाना अंश। सतह पर तैरनेवाला निकालें। </ ली>
  15. बाद में संस्कृति के लिए तहखाने का उपयोग करें।

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 4. तहखाना संस्कृति

  1. पूर्व ठंडा pipet सुझावों का प्रयोग, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (200 से 500 तहखाने / 50 μl तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) में (कदम 2.18 या 3.15 से) तहखाना गोली resuspend।
  2. पूर्व गर्म थाली पर अच्छी तरह से प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में तहखाना निलंबन के 50 μl लागू करें। धीरे-धीरे अच्छी तरह के केंद्र में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बेदखल।
  3. 30 मिनट के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक पूरी polymerization की अनुमति देने के लिए के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
  4. 2.5 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक पूरा मानव minigut माध्यम के 500 μl के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ओवरले (1: 4000 कमजोर पड़ने 10 मिमी शेयर की) और 2.5 माइक्रोन Thiazovivin (1: 4000 कमजोर पड़ने 10 मिमी शेयर की)।
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
  6. ताजा पूरा हुमा के साथ मध्यम बदलेंएन minigut मध्यम हर 2 दिन।

संवर्धित Enteroids और Colonoids 5. Passaging।

नोट: पैसेज Enteroids और Colonoids प्रारंभिक चढ़ाना के बाद हर 7 से 10 दिनों के लिए। आम तौर पर, 3 से 4 कुओं में अच्छी तरह से एक विभाजित।

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले सभी अभिकर्मकों तैयार करें। बर्फ और पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना पूर्व सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली।
  2. बर्फ ठंड DPBS के 1 एमएल के साथ बाँझ सुझावों और ओवरले का उपयोग कर मीडिया निकालें।
  3. आगे और पीछे एक 1000 μl टिप के साथ पिपेट। एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में समाधान स्थानांतरण।
  4. मध्यम के 1 मिलीलीटर प्रति 5% FBS के साथ पूरक मानव minigut माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. 50 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. (: 10 मिमी शेयर के 1,000 कमजोर पड़ने 1) 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक सेल हदबंदी एंजाइम के 2 मिलीलीटर के साथ गोली Resuspend। 5 मीटर के लिए सेतेएक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस से कम में।
  7. एक 18-जी भरण / कुंद सुई से लैस एक 3 एमएल Luer ताला सिरिंज का उपयोग सेल clumps अलग कर देना। धीरे सिरिंज 10 बार उपयोग करते हुए आगे और पीछे समाधान विंदुक।
  8. 500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. पूर्व ठंडा pipet सुझावों का प्रयोग, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सेल गोली resuspend।
  10. पूर्व गर्म थाली पर अच्छी तरह से प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में तहखाना निलंबन के 50 μl लागू करें। धीरे-धीरे अच्छी तरह के केंद्र में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बेदखल।
  11. 20 मिनट के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक पूरी polymerization की अनुमति देने के लिए के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
  12. (: 10 मिमी शेयर के 1,000 कमजोर पड़ने 1) 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक पूरा मानव minigut माध्यम के 500 μl के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ओवरले।
  13. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
  14. 2 दिन बाद, 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक ताजा पूरा मानव minigut मध्यम के साथ मध्यम जगह (1: 1000 कमजोर पड़ने 10 मिमी शेयर की)। इसके बाद, हर दूसरे दिन ताजा, पूरी मानव minigut मध्यम के साथ मध्यम बदलें।

संवर्धित Enteroids और Colonoids 6. बर्फ़ीली

नोट: आमतौर पर 2-3 cryovials में एक अच्छी तरह से नहीं हिलेगा।

  1. दोहराएँ 5.1-5.8 कदम।
  2. ठंड ठंड मध्यम के साथ गोली resuspend। स्थानांतरण एक लेबल cryovial में समाधान ठंड के 1 मिलीलीटर। Isopropyl शराब की 500 मिलीलीटर युक्त ठंड कंटेनर में cryovial रखें।
  3. फिर तरल नाइट्रोजन भंडारण करने के लिए cryovial हस्तांतरण, 24 घंटे के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ठंड कंटेनर स्थानांतरण।
    अप करने के लिए एक वर्ष के लिए स्टोर Enteroids और Colonoids: ध्यान दें।

Representative Results

चित्रा 2 डी पूरे ऊतक (चित्रा 2 डी) से हौसले से अलग तहखाने का एक विशिष्ट उदाहरण दिखाता है। एक बायोप्सी से अलग तहखाने की संख्या पूरे ऊतक की तुलना में कम है। सुई के साथ मानक क्षमता बायोप्सी संदंश का प्रयोग, हम आम तौर पर एक भी पास पर दो बायोप्सी के काटने प्रदर्शन करते हैं। बायोप्सी के अनुसार 50 से 100 तहखाने के एक औसत (चित्रा 2 एफ) के साथ एक 10 मिमी 2 सतह में प्रत्येक बायोप्सी काटने का परिणाम है।

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में संस्कृति के बाद, तहखाने पेट के लिए छोटी आंत और colonospheres के लिए enterospheres के लिए फार्म का दौर। आम तौर पर नवोदित तहखाना बोने के बाद, 5 से 6 दिनों के भीतर होता है। (; मूवी 1 चित्रा 3 ए-सी) हालांकि यह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में क्षेत्रों के गठन या तो enteroids (enteroids) या colonoids (colonoids) को देखने के लिए असामान्य नहीं है। passaging के enteroids के आकार पर निर्भर करता है, 7 दिनों के बाद किया जा सकता है। enteroids या colonoids establबायोप्सी से दंडित संस्कृति में ही विकास से गुजरना। बोने पर तहखाना घनत्व कम है लेकिन, जैसा कि passaging आमतौर पर संस्कृति में 10 से 12 दिनों के बाद किया जाता है (चित्रा -4 ए, बी)। Enteroids और colonoids संस्कृतियों एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से विस्तार।

दोनों enteroids और colonoids एक luminal पक्ष को वर्तमान और एक उपकला के साथ लाइन में खड़ा कर रहे हैं (चित्रा 5 ए, बी)। Proliferative कोशिकाओं enteroids भीतर देखा जा सकता है और कली सुझावों (चित्रा 5C, डी) के भीतर स्थित हैं। ई cadherin (Ecad) के साथ दाग enteroids की confocal इमेजिंग उपकला कोशिकाओं (चित्रा 5E) से पता चलता है।

Enteroids और colonoids दोनों आनुवंशिक / जन्मजात बीमारियों के साथ रोगियों से प्राप्त ऊतक से स्थापित किया जा सकता है। चित्रा 6 कारण उपकला कोशिका विज्ञापन में एक जन्मजात उत्परिवर्तन के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस (चित्रा 6A) और एक tufting enteropathy के साथ एक रोगी से बढ़ रही प्रतिनिधि enteroids से पता चलता हैhesion अणु जीन (EpCAM) (चित्रा 6B)। आनुवंशिक दोष के अलावा, enteroids बेसल हालत में मतभेद प्रदर्शन नहीं करते।

चित्र 1
तहखाने हदबंदी और मानव enteroids और संस्कृति में colonoids की पीढ़ी की चित्रा 1. कार्यप्रवाह। तहखाने (मानव छोटी आंत या पेट से) EDTA के केलेशन से अलग कर रहे हैं। संवर्धित तहखाने पेट के लिए छोटी आंत और colonoids के लिए enteroids के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
तहखाना अलगाव के लिए चित्रा 2. विच्छेदन प्रक्रिया। (ए) छोटी आंत specimeएन फैला रहे हैं और एक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में फ्लैट टिकी है। (बी) म्यूकोसा अंतर्निहित submucosa से अलग है। (सी) विच्छेदित म्यूकोसा फैला रहे हैं और एक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में फ्लैट टिकी है। EDTA के केलेशन के बाद (डी), तहखाने ऊतक से अलग कर रहे हैं। (ई) एक बायोप्सी फैला रहे हैं और एक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में फ्लैट टिकी है। (एफ) EDTA के केलेशन के बाद, तहखाने बायोप्सी से अलग कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. तहखाना संस्कृति और पूरे ऊतक से मानव enteroid और colonoid पीढ़ी। (ए) के अलगाव के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया मध्यांत्रीय तहखाने। तहखाने 3-4 घंटा के बाद बंद करने और इस समय परे enterospheres फार्म करने के लिए गुब्बारे के लिए शुरू कर रहे हैं। 7 दिन में, मध्यांत्रीय enteroids गठन कर रहे हैं। अलगाव और संस्कृति के बाद (बी), ileal तहखाने मध्यांत्रीय तहखाने की तरह व्यवहार करते हैं और ileal enteroids के रूप में। (सी) Colonic तहखाने अलगाव के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है। 7 दिन (स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन) के बाद तहखाने करीब है और फार्म colonoids। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
बायोप्सी से चित्रा 4. तहखाना संस्कृति और मानव enteroid और colonoid पीढ़ी। (ए) के अलगाव के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया ग्रहणी तहखाने। तहखाने 4 घंटे के लिए 3 के बाद बंद करने और beyo गुब्बारे के लिए शुरू कर रहे हैंएन डी इस समय enterospheres बनाने के लिए। 7 दिन में, enteroids गठन कर रहे हैं। (बी) के अलगाव और संस्कृति के बाद, colonic तहखाने तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है। ।: तहखाने तो सात दिनों (100 माइक्रोन स्केल सलाखों) के बाद colonoids colonospheres फार्म को बंद इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
संस्कृति में छह दिनों के बाद चित्रा 5. मानव enteroids की आंतों प्रजातियों। (ए) मानव enteroid। (बी) (ए) अस्तर उपकला का प्रदर्शन में enteroids की Hematoxylin-eosin वर्गों (स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन)। (सीडी) edu धुंधला (मैजंटा) के बाद enteroids की confocal इमेजिंग proliferative कोशिकाओं की मौजूदगी से पता चलता है। (ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
रोगग्रस्त ऊतकों से 6 चित्रा तहखाना संस्कृति और मानव enteroid पीढ़ी। (ए) एक सिस्टिक फाइब्रोसिस नमूना से स्थापित Enteroids। (बी) Enteroids एक जन्मजात tufting enteropathy नमूना से स्थापित (स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1. Enterosphere संस्कृति में मानव enteroid बनाने। 32 घंटा समय-गोदई फिल्म संस्कृति में एक enteroid के लिए फार्म retracting मानव छोटी आंत से स्थापित एक enterosphere पता चलता है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक के नाम कंपनी सूची की संख्या विलायक शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता कमेंट
है Dulbecco फास्फेट खारा सीए 2 +, 2 मिलीग्राम + मुक्त (DPBS) बफर जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 14190-144 - - 1x
Ethylenediamine
tetraacetic एसिड (EDTA)
सिग्मा Aldrich 431,788 Ultrapure DH 2 हे 2 मिमी
Sorbitol फिशर साइंटिफिक BP439-500 DPBS पाउडर 2%
सुक्रोज फिशर साइंटिफिक BP220-1 DPBS पाउडर 1%
गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अंश वी फिशर साइंटिफिक BP1600-100 DPBS पाउडर 1%
Gzntamycin / Amphotericin बी समाधान जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco आर-015-10 - 500x 1x
WNT -3 ए मध्यम conditionned घर में - - - -
उन्नत DMEM / F12 जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 12634-028 - - -
HEPES के 1M जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 15630-080 - 1 एम 10 मिमी
GlutaMAX (glutamine) जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 35050-061 - 100X 1X
पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 15140-148 - 100X 1X
एन 2 अनुपूरक जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 17502-048 - 100X 1X
B27 पूरक जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 17504-044 - 50X 1X
एन एसिटाइलसिस्टीन सिग्मा Aldrich A9165-5G DPBS 1 एम 1 मिमी </ टीडी>
Nicotidamide सिग्मा Aldrich N0636 DPBS 1 एम 10 मिमी
Matrigel, जीएफआर, Phenol मुक्त (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) Corning है 356,231 - - - आवश्यक
मानव पुनः संयोजक नोगिन अनुसंधान एवं विकास 6057-एनजी / सीएफ DPBS 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 100 एनजी / एमएल अन्य आपूर्तिकर्ताओं: अनुसंधान एवं विकास; Anaspec और Preprotech
मानव पुनः संयोजक आर-Spondin Preprotech 120-38 DPBS 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /
मानव पुनः संयोजक EGF सिग्मा Aldrich E9644-.2MG DBPS 500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 50 एनजी / एमएल
वाई 27,632 सिग्मा Aldrich Y0503-1MG DPBS 10 मिमी 10 माइक्रोन
एक-83-01 Tocris 2939 DMSO के 500 माइक्रोन 500 एनएम
SB202190 सिग्मा Aldrich S7067-5MG DMSO के 30 मिमी 10 माइक्रोन
मानव [लियू] 15-Gastrin 1 सिग्मा Aldrich G9145-.1MG DPBS 100 माइक्रोन 10 एनएम
CHIR99021 Stemgent 04-0004 DMSO के 10 मिमी 2.5 माइक्रोन
Thiazovivin Stemgent 04-0017 DMSO के 10 मिमी 2.5 माइक्रोन
TrypLE एक्सप्रेस एंजाइम (1x), फिनोल लाल (सेल हदबंदी एंजाइम) जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 12605-010 - - - Passaging के लिए
भ्रूण गोजातीय सीरम जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco 10082-147 - - - Passaging के लिए
सीटीएस Synth-ए-रुक मध्यम (ठंड मध्यम) जीवन टेक्नोलॉजीज; Gibco A13713-01 - - - ठंड के लिए
एल Wnt -3 ए सेल लाइन ATCC सीआरएल-2647 - - - WNT -3 ए मीडिया उत्पादन conditionned
Renilla luciferase परख Promega E2710 - - - WNT -3 ए मीडिया गतिविधि conditionned
मानव पुनः संयोजक Wnt -3 ए अनुसंधान एवं विकास 5036-WN / सीएफ DPBS 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 100 एनजी / एमएल
HEK293 TOPflash सेल लाइन - - - - - WNT -3 ए मीडिया गतिविधि conditionned; हंस Clevers प्रयोगशाला से उपहार

पसंदीदा निर्माता और सूची संख्या के साथ तालिका 1. विस्तृत अभिकर्मक सूची।

अपकेंद्रित्र
उपकरण उपभोज्य उपकरण
पर्णदलीय प्रवाह शिरोवेष्टन 15 और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ड्यूमॉन्ट # 5 मानक संदंश (एफ एस टी; # 11251-20)
सीओ 2 इनक्यूबेटर Microfuge ट्यूबों ड्यूमॉन्ट # 7, घुमावदार ठीक संदंश (एफ एस टी; # 11274-20)
स्टीरियो माइक्रोस्कोप 24 अच्छी तरह प्लेटें ठीक कैंची (एफ एस टी; # 14060-09)
0.22 माइक्रोन फिल्टर (Sartorius) Vannas वसंत कैंची (एफ एस टी; # 15018-10)
कक्षीय प्रकार के बरतन सीरम विज्ञानी pipettes 0.2 मिमी व्यास minutien पिंस (एफ एस टी; # 26002-20)
बर्फ़ीली कंटेनर (Nalgene) Micropipette सुझावों 0.1 मिमी व्यास minutien पिंस (एफ एस टी; # 26002-10)
184 Sylgard सिलिकॉन (डॉव Corning) 150 माइक्रोन जाल उद्घाटन, नायलॉन स्क्रीनिंग (गतिशील एक्वा-आपूर्ति)
ग्लास पेट्री डिश 5 मिलीलीटर दौर नीचे polypropylene ट्यूब (फाल्कन)
सीरम विज्ञानी pipettor 18G कुंद भरने सुई (बी)
Micropipette Luer ताला सुझावों के साथ 3 मिलीग्राम lsyringes (बी)
Cryovials

Discussion

इस विधि आंतों उपकला जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का गठन जो आंतों उपकला प्रजातियों और उपकला गतिशीलता reproducing एक पूरी प्रणाली प्रदान करता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि कुशलतापूर्वक मानव enteroids और colonoids में यह परिणाम है कि सातो और Clevers 22 से मूल murine अध्ययन से अनुकूलित किया गया था। यहाँ, हम स्वयं किसी भी सेलुलर contaminants को बचने के लिए microdissection के द्वारा तहखाने उठाया। इस विधि के तहखाने के एक प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है और "मिलाते हुए" द्वारा मूल तहखाना संग्रह की तुलना में स्थिरता ओवरटाइम की ओर जाता है। अन्य समूहों के लिए विशेष रूप से कोलैजिनेज 25 के साथ EDTA के द्वारा केलेशन की जगह से थोड़ा अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर इसी तरह की शब्दावली का विकास किया। तहखाना संग्रह में मतभेद इसके अलावा, उन टेकनीक संस्कृति 22 में मानव enteroids विकसित करने के लिए आवश्यक है कि एक परिभाषित मीडिया का उपयोग करें। तहखाना बोने में वृद्धि की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम (CHIR99021) एक GSK3 अवरोध करनेवाला जोड़नेपहले दो दिनों में 12 के लिए।

ऊतक या बायोप्सी की हैंडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है और तहखाना अलगाव के रूप में जल्द ही ऊतक प्रयोगशाला में आता है के रूप में किया जाना चाहिए। हालांकि, देरी तहखाना अलगाव और संस्कृति ऊतक संग्रह के बाद 24 घंटे तक का प्रदर्शन किया जा सकता है कि पहले murine ऊतक 26 के लिए के रूप में वर्णित (डेटा) नहीं दिखाया। आंतों ऊतक पूरी तरह से ऊतक व्यवधान से बचने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए DPBS के साथ भरा एक शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाना चाहिए। देरी तैयारी ऊतक शिपिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन तापमान परिवर्तन परिवहन के दौरान से बचा जाना चाहिए। प्रारंभिक तहखाना चढ़ाना के लिए आवश्यक कुल समय अलग और तहखाना थाली करने के लिए ऊतक और 1 घंटा 2 को संसाधित करने के लिए 15 से 30 मिनट के साथ लगभग दो घंटा है। ऊतक के microdissection के लिए एक साफ तहखाना तैयारी का एक महत्वपूर्ण निर्धारक और विधेय है। हालांकि, विभिन्न प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हाथ-झटकों से तहखाना रिहाई संभव है 22,23।

Murine enteroid (enteroids) प्रणाली के साथ समानता के बावजूद, मानव enteroids बढ़ाने के लिए और समय के साथ उनके विकास को बनाए रखने के लिए विशिष्ट अणुओं की आवश्यकता होती है। वृद्धि कारकों, EGF, नोगिन, आर spondin murine उपकला organoids को इसी तरह से किया जाता है। हालांकि, Wnt -3 ए के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। हम गठन के साथ ही विकास दक्षता मानव पुनः संयोजक प्रोटीन की तुलना में एक Wnt -3 ए वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर अधिक से अधिक है कि उल्लेख किया। समन्वित रूप से, हम ग्लाइकोजन सिन्थेज़ काइनेज 3 (CHIR99021) 12 के एक अवरोध करनेवाला के प्रयोग से उन्नत संस्कृति की स्थिति का प्रदर्शन किया। संयोजक वृद्धि कारकों Wnt -3 ए, आर spondin, और नोगिन वातानुकूलित मीडिया द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक Wnt -3 ए व्यक्त एल सेल लाइन (ATCC) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। अन्य समूहों के आर-spondin 1- 23,27, Noggin- 19 विकसित की है, और Wnt-3 ए / आर-spondin3 / Noggin- 28 सेल लाइनों को व्यक्त किया है। दो छोटे अणु अवरोधकों संस्कृति में किया जाता है मुझेव्यास और संस्कृति 29 के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। एक-83-01 वृद्धि कारक β और Activin / नोडल रिसेप्टर्स को बदलने का एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला है (activin तरह काइनेज 4, 5, 7) और SB202190 एक p38 माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase अवरोध (MAPK) है। दोनों अवरोधकों मानव प्रेरित स्टेम सेल आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए और मानव भोले स्टेम सेल 30-32 स्थापित करने के लिए क्रमशः इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, निकोटिनामाइड, निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड के अग्रदूत, एक लंबी अवधि के तरीके 22,29 में enteroids और colonoids विस्तार बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

यह तहखाना तैयारी से उपज को निर्धारित करता है के रूप में EDTA के केलेशन एक महत्वपूर्ण कदम है। हम 2 मिमी EDTA उपचार के साथ सफल रहे हैं। हालांकि, EDTA के एकाग्रता ऊतक के प्रकार के बारे में 15 मिमी 2 मिमी से संशोधित किया जा सकता है। उस मामले में, ऊष्मायन के समय अनुभव से निर्धारित किया जाना है। प्रारंभिक चढ़ाना के बाद, तहखाना दौर-यू जाएगापी और अंततः enteroids के रूप में। हालांकि, enteroids या colonoids अक्सर कोई विभेदित कोशिकाओं लिए थोड़ा के साथ क्षेत्रों के गठन से एक "स्टेम" फेनोटाइप प्रदर्शित करता है। उस मामले में, भेदभाव Wnt -3 ए, निकोटिनामाइड और p38 MAPK अवरोध करनेवाला वापस लेने के द्वारा शुरू किया जा सकता है। ऐसे DAPT या DBZ रूप पायदान अवरोध करनेवाला का उपयोग enteroids 22 भीतर भेदभाव को बढ़ाने में मदद करता है।

इस मॉडल अवशोषण और स्रावी विभेदित प्रजातियों दोनों युक्त स्टेम सेल डिब्बे से उत्पन्न होने वाली नित्य तहखाना-नवोदित घटनाओं के रूप में अच्छी तरह से अंकुर की तरह उपकला डोमेन के साथ आंतों फिजियोलॉजी स्मरण दिलाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस प्रणाली के किसी भी mesenchymal कोशिकाओं होते हैं और आला संकेत आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विशिष्ट मीडिया शर्तों का उपयोग करता है नहीं करता है।

Murine मॉडल की तरह, मानव enteroids एक स्टेम सेल के रूप में कार्य करने के लिए उन कोशिकाओं की क्षमता का परीक्षण करने के लिए पृथक आंतों उपकला कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकता है। SeveRAL पढ़ाई स्टेम गुण 12,23,33 के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए भेदभाव मार्कर (CD44, CD24 या CD166) और EPHB2 सकारात्मक कोशिकाओं के समूह का इस्तेमाल किया है। साथ में, इन अध्ययनों stemness के परीक्षण के लिए मानव enteroids संस्कृतियों की उपयोगिता प्रदर्शित करता है। अन्य जांचकर्ताओं ऐसी संक्रामक अतिसार रोग, सिस्टिक फाइब्रोसिस, या कोलोरेक्टल कैंसर 22,34-37 के रूप में आंतों के रोगों की जांच के लिए इस मॉडल का उपयोग कर रहे हैं। इन अध्ययनों से मानव enteroids एक व्यक्तिगत स्क्रीनिंग की ओर ले जाने के लिए एक संभावना के साथ एक विश्वसनीय मानव रोग मॉडल का गठन कि प्रदर्शित करता है। मानव enteroids आनुवंशिक रूप से वायरल कणों 38 के साथ डीएनए अभिकर्मक या संक्रमण का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है। यह मानव उपकला organoids या सही आनुवंशिक परिवर्तन के भीतर जीन विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। हाल ही में, शेवांक और उनके सहयोगियों CFTR जीन के कारण एसी पर उत्परिवर्तन CRISPR / Cas9 प्रणाली के साथ जीनोम को संपादित करें और सही करने के लिए संभावना का प्रदर्शनystic फाइब्रोसिस 24। मानव enteroids आंतों स्टेम सेल और उपकला श्लैष्मिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और सामान्य और असामान्य दोनों जठरांत्र शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास प्रायोगिक प्रणाली के रूप में काम करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का गठन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) Life technologies; Gibco 14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 431788
Sorbitol Fischer Scientific BP439-500
Sucrose Fischer Scientific BP220-1
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Fischer Scientific BP1600-100
Gzntamycin/Amphotericin B solution Life technologies; Gibco R-015-10
Wnt-3A conditioned medium in house
Advanced DMEM/F12 Life technologies; Gibco 12634-028
HEPES 1M Life technologies; Gibco 15630-080
GlutaMAX (glutamine) Life technologies; Gibco 35050-061
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life technologies; Gibco 15140-148
N2 Supplement Life technologies; Gibco 17502-048
B27 Supplement Life technologies; Gibco 17504-044
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
human recombinant Noggin R&D 6057-NG/CF
human recombinant R-Spondin Preprotech 120-38
human recombinant EGF Sigma-Aldrich E9644-.2MG
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
A-83-01 Tocris 2939
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG
human [Leu]15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG
CHIR99021 Stemgent 04-0004
Thiazovivin Stemgent 04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) Life technologies; Gibco 12605-010
Fetal Bovine Serum Life technologies; Gibco 10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) Life technologies; Gibco A13713-01
L Wnt-3A cell line ATCC CRL-2647
Renilla luciferase assay Promega E2710
human recombinant Wnt-3A R&D 5036-WN/CF
HEK293 TOPflash cell line

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