신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

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Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

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Abstract

Introduction

우리 (1)에 의해 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 시험 관내에서 차별화 된 신경 세포 등, 3의 유전자 발현 연구는 hiPSC 신경 세포가 태아보다는 성인 뇌 조직을 닮은 것을 나타냅니다. 현재, hiPSC 기반 모델은 오히려 늦은 기능, 신경 학적 질병보다에 경향의 연구에 더 적합 할 수있다. 우리는 이전의 NPC 분열증 기여 분자 경로를 연구하는데 유용한 세포 유형이 될 수 있다는 것을 나타내는, 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 전구 세포 (NPC들)에 보존되었다고보고했다 . 우리와 다른 비정상적인 이주 증가 산화 스트레스 및 반응성 산소 종, 서브 - 임계 환경 스트레스 및 정신 분열증에서 미토콘드리아 기능 부전의 NPC hiPSC 1,4-6 민감도뿐만 아니라 C를 감소 신경 신고되었습니다연 결 성 및 정신 분열증 hiPSC 신경 5,7-10에서 시냅스 기능. 정신 분열증 hiPSC의 NPC에서 벗어난 마이그레이션 및 / 또는 산화 스트레스에 기여하는 분자 요인 또한 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 감소 된 신경 세포의 연결을 기초 경우, NPC의 질병을 담당하는 메커니즘을 연구하는과 강력하고 매우 복제 성 신경 인구 수 있습니다. 하나는 신속하게 많은 수의 세포를 생성 할 수 있습니다 및 신경 세포의 성숙을 위해 몇 주 또는 몇 달을 기다릴 필요가 있기 때문에 또한, NPC 기반의 분석은 큰 환자 코호트 연구에 적합하며 높은 처리량 검사에 더 의무가 있습니다. 우리는 이미 정신 분열증 1 헌팅턴 병 (11) 등 다양한 질환에서 입증 된 바와 같이 hiPSC의 NPC, 잠재적으로 질병의 발병에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수 있다고 생각합니다.

hiPSCs에서 초기 신경에서의 NPC를 구분하기 위해duction 듀얼 SMAD 억제 (위하여 0.1mM LDN193189 및 10 mM이 SB431542) (12)에 의해 달성된다. 이러한 작은 분자 신호 BMP 및 TGF 반감으로 내배엽과 중배엽 사양은 신경 세포의 분화를 가속화하고 도금의 1 주일 이내에 볼 신경 로제트의 형성을 선도 차단됩니다. 신경 패터닝 아마도 그 후 즉시 신경 로제트 형성 및 기간 동안, 초기에이 과정에서 발생한다. 다른 단서가없는 경우, 이들 신경 원시 세포는 전뇌 전방 형상 (13)의 운명을 가정한다. 즉시 신경 로제트 형성을 다음과 NPC 확장에 걸쳐 진행, 전뇌의 NPC FGF2 8, 14 배양한다. 그들은 이중 혈통 잠재력을 가지고 70~80% III-tubulin에 양성 신경 세포와 20 ~ 30 % glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 양성 성상 세포 (그림 1)의 신경 인구로 구분 될 수있다. 전뇌 hiPSC 뉴런의 대부분 VGLUT1 양성신경 세포의 약 30 %가 GAD67 양성 (GABA 성) 있지만, 그래서, 아마도 글루탐산이다 (8).

NPC가 일상적으로 일관된 차별화 프로파일을 유지하고, 염색체 이상을 축적하지 않고있는 동안, 시험관 내에서 10 배 이상 계대. 그룹 계대 엔피씨 (15)는, 그러나, 우리 10 구절을 넘어, 엔피씨가 성상 세포 분화 경향이 커지고있다 찾을보다 40 배 신고되었습니다. NPC의 여러 동결 해빙을 잘 견딜 단순히 비 접착 성 판에서 배양하여 neurosphere를로 성장으로 전환 할 수 있습니다. NPC가 효율적 생화학 연구를 위해 충분한 물질을 수득 신속한 유전 섭동 분자 세포의 평가 결과, 쉽게 확장을 가능 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 또한, 때문에 바이러스 벡터는 허용 강력한 과발현 제어 또는 환자 파생 neur 중 및 / 또는 질병 관련 유전자의 최저,알 세포는 하나의 이러한 유전 적 조작에 대한 배경의 영향을 테스트하기 위해이 플랫폼을 사용할 수있다. 시냅스 또는 성숙한 뉴런을 필요로하는 활동 기반의 분석에 적합하지 않지만, NPC의 환자 유래 신경 세포의 많은 간단한 분자 또는 생화학 적 분석을위한 실용적인 대안이 될 수있다.

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Protocol

1. hiPSC 차별화 신경 전구 세포에

  1. 성장과 인간 배아 줄기 세포에서 hiPSCs을 확장 (HES) 미디어 (표 1) 공동 배양 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 큰 (그러나 subconfluent) 식민지가 배아 체 (EB) 중간 통해 신경 차별화를위한 준비가 될 때까지 세포층에 (그림 2). 루틴 hiPSC 배양 조건은 다른 웰 (16, 17) 기재되어 있고; 3 매 7 일마다 : 잠깐, 합류 할 때까지 MEF 피더 레이어에 HES 미디어에서 hiPSCs 성장, 후 효소 콜라게나 제 (DMEM에 1 ㎎ / ㎖)와 통로는 약 1 확장합니다.
  2. 폴리 -L- 오르니 틴 (유리 표면에 50 ㎍ / ㎖) 플라스틱 표면에 대한 멸균 ㎖ / 10g과 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 플레이트, 코팅 플레이트를 준비하고, 3-24 시간 동안 RT에서 배양. 3-24 시간 동안 실온에서 멸균 PBS에 5g / ml의 라​​미닌과 멸균 후 코트에 한 번 이상 세척 할 것.
    참고 : 플라스틱에 싸여 경우, 플레이트가 될 수 있습니다6 개월까지 -20 ºC 저장.
  3. 1 일에, 효소 DMEM / F12에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV를 사용하여 플레이트 큰 식민지에서 (예를 Matrigel에 TeSR 18 정의 미디어에서 재배 일반적으로 MEFs에 성장, 또는 hiPSCs) subconfluent hiPSCs를 들어 올립니다.
    참고 : 37 ºC에서 배양 1-2 시간 후, 식민지는 접시에 떠있는 것입니다.
  4. 조심스럽게 DMEM / F12, 2 ㎖ / 웰의 N2 / B27 미디어 (표 1)과 비 부착 6 잘 요리로 전송에 재현 탁과 1-2X를 (안 원심 분리, 침전에 의해) hiPSC 식민지를 씻어 (1으로 3 우물을 결합 - 음) 19.
    참고 : 숙박, 식민지 부동 구형 클러스터를 형성 할 것이다 "는 배아 체"(사채)를 지칭. 상당한 세포 죽음을 기대합니다.
  5. 그리고 2 일, 틸트 판에하는 사채가 정착 할 수 있습니다. 조심스럽게 미디어를 제거하고 이물질을 제거하는 DMEM / F12 한 번 씻는다. N2와 피드 / 듀얼 SMAD 억제제 (0.1M LDN193189 및 10M SB431542) (12)로 보충 B27 미디어를
  6. 3-7 일에, neuralization 듀얼 SMAD 억제의 맥락에서 발생합니다; 사채 라운드 만 낭포 성이 아닌지 확인합니다. 사채 0.1M LDN193189과 10M SB431542 보충 N2 / B27 미디어를 격일로 공급.
  7. 신경 로제트는 (apico - 기초 극성 neuroepithelial 세포의 원형 클러스터 특징 몇 일 이내에 나타나기 시작하는 일 7-14에서 코팅 된 플레이트 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌에 사채의 도금 다음, 시야 현미경을 이용하여 확인; 그림 1). 부착 사채 0.1M LDN193189, 10M SB431542 및 1g / ㎖ 라미닌 보충 N2 / B27 미디어를 격일로 먹이를 계속합니다.

신경 근엽 2. 수확

참고 : 우리는 신경 근엽이 효소 신경 장미 선택 시약 (20) 또는 유사한 선택 시약을 사용하여 수확하는 것이 좋습니다. 신경 로제트 수동 6 자 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 플레이트, 생에 뽑힐 수 있지만의 방법론은 더 NPC들에 대한 풍부하고 비 신경 세포 유형을 고갈 하루 20 따기의 두 번째 라운드가 필요할 수 있습니다, 사용자의 기술에 의존, 마스터에 광범위한 교육을 받아,.

  1. 14 일에 신경 로제트의 효소 선택, 접착 사채에서 흡인 미디어는 6 웰 플레이트에 잘 당 신경 장미 선택 시약 1 ㎖를 추가합니다. 1 시간 37 ºC에서 품어.
  2. P1000의 pipetman으로, 부드럽게 각 우물에서 효소를 제거합니다. 씻어 잘 당 DMEM / F12 1 ML을 추가합니다.
  3. P1000과 함께, DMEM / F12의 1 ㎖의를 수집하고 신속 따라서 판에서 로제트를 분리, 우물에 다시 DMEM / F12을 추방. 팔콘 튜브에 로제트를 수집합니다.
  4. 피펫 다른 한 DMEM / F12 ml의 신속 남은 로제트를 분리하기 위해 같은 우물에 추방. (씹다하지 마십시오. 장미 집계를 나누는 않도록한다). 같은 팔콘 튜브에 신경 로제트를 수집합니다.
  5. 단계를 반복하여 필요에 따라 2.4. 로제트가 쉽게 분리되지 않는 경우, 미주리 추가효소를 다시하고 같은 과정을 반복 (2.1-2.4 단계)
  6. 3 분 동안 300 XG에서 세포를 스핀. 기음 세척 및 NPC 미디어 (표 1) 2 ㎖에 로제트를 다시 일시 중지합니다. 전송 세포 (1 : 1)로 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌로 6 웰 플레이트를 코팅.
  7. 일 15-21에서 신경 근엽은 확장됩니다; 공급 로제트 NPC 미디어와 격일.
  8. 신경 로제트의 품질을 평가하고 평평한 섬유 아세포와 같은 세포가 문화 내에서 확장되지 않도록.
    참고 : 비 로제트가 지속되면, NPC 문화 때때로 Accutase에 집어 근엽 만 최선을 선택, 수동 따기에 의해 회수 할 수있다. 37 ºC에서 15 분을 떼어 놓다. 펠렛, 세척 및 NPC의 미디어 판 (24) 웰 폴리 - L - 오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 판에.

신경 전구 세포의 3. 확장

참고 : hiPSC의 NPC Matrigel- 또는 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 플레이트 중 하나에 성장시킬 수있다. 우리는 일반적으로 Matrige를 사용L 플레이트들이보다 신속하게 준비하고 저렴한 비용으로 할 수있다.

  1. 빨리, 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 준비 해동 24 ml의 마트 리겔의 1mg의 냉동 나누어지는을 재현 탁 차가운 DMEM / F12을 즉시 2 ~ 6 웰 플레이트의 각 웰에 2 ㎖를 배포합니다. 37 ºC에서 적어도 1 시간 동안 품어.
    참고 : 마트 리겔은 사용하기 직전에, 세척하지, 흡입 될 필요가있다.
  2. 격일의 NPC를 공급하고 매우 높은 밀도로 유지하거나 자발적으로 신경 세포로 분화됩니다.
    참고 : 비록 더 설립의 NPC는 일반적으로 1 분할 : 2로 자주으로 2 주에 1 회 : 매주 4, 매우 낮은 통로의 NPC 1을 분할 할 수있다.
  3. 분할 먼저 대기음 미디어와 6 웰 플레이트의 웰 당 1 ml의 따뜻한 Accutase (1X)를 추가합니다. 10 ~ 15 분 동안 37 ºC에서 품어.
  4. 부드럽게 가능한 적은 기계적 스트레스 DMEM / F12를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 분리 된 세포를 옮긴다. 효소에있는 동안 세포를 적정하지 마십시오. spinni에 의해 펠렛 세포5 분 동안 1,000 XG에 ng를.
  5. 세척을 대기음, 원래 잘 당 ~ 1 ml의 NPC 미디어에서 NPC가 다시 중단의 6 자.
    참고 : 6 잘 접시의 합류 우물 5-10000000 세포를 가지고 기대; 이것은 종래 hematocytometer를 재 도금을 이용하여 세포의 분취 량은 10L를 카운팅함으로써 확인 될 수있다.
  6. NPC의 신경 세포 또는 neurosphere를 같이 다시 정지, 재 판 NPC가 다음. 6 웰 플레이트의 웰 당 약 1-2000000 세포를 플레이트, 엔피씨을 유지합니다. neurosphere 형성의 효율은 실험 세포주 사이에서 다양하지만, 200,000 내지 1,000,000 세포를 미부착 된 6- 웰 플레이트의 웰 당 시딩하는 경우 가장 일반적으로 발생할 수있다; neurosphere를의 응집이 발생하는 경우, 시드 세포의 수를 감소시킨다. 신경 매체와 NPC 미디어를 교체 6 웰 플레이트의 웰 당 신경 세포로 분화하는, 판 약 20 만 세포.
  7. 면역 조직 화학 염색 모든 설립 NPC 라인을 확인합니다. 일단 충분한 세포 물질이있다 EXPAN네 스틴 및 SOX2에 대한 항체 DED, 라벨의 NPC. 검증 NPC 라인도 4-6주에 대한 신경 세포로 분화, 및 III-튜 불린과 MAP2AB에 대한 항체로 표시되어야합니다.
    1. 10 분 동안 4C으로 PBS 중의 4 % 파라 포름 세포를 고정. PBS 중 1.0 % 트리톤 15 분 동안 RT에서의 NPC를 Permeabilize 하시려면 다음 실온에서 30 분 동안 0.1 % 트리톤으로 5 % 당나귀 혈청 차단.
    2. 밤새 4C에서 0.1 % 트리톤 (Triton)와 5 % 당나귀 혈청 차 항체로 품어.
      참고 : 우리는 다음과 같은 항체를 추천 : 염소 항 - SOX2, 1 : 200; 마우스 항 인간 네 스틴, 1 : 200; 토끼 항 - 튜 불린 βIII, 1 : 500; 마우스 항 - 튜 불린 βIII, 1 : 500; 마우스 항 MAP2AB, 1 : 200. (그림 2).
    3. 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 0.1 % 트리톤과 5 %의 당나귀 혈청, 300 : PBS로 세척 후, 1 염소, 마우스 또는 토끼에 대한 적절한 결합 된 이차 항체와 이차 항체 세포를 배양한다. 0.5 ㎍ / ㎖의 DAPI (4 '와 핵, 얼룩 세포를 시각화, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 다음)과 Vectashield에 마운트합니다.

4. NPC 형질 도입

  1. 형질 감염된 세포 (21)의 비율을 증가시키는 (1 시간 동안 1,000 XG에서 바이러스의 존재하에 세포 배양 판을 원심 분리)을 사용 spinfection. NPC 미디어에 희석 감염 원하는 다중성 (일반적으로 1 ~ 10) (MOI)에 titered 대기음 매체와 관련 과발현 (또는 제어) 렌티 바이러스 (또는 레트로 바이러스)로 교체합니다. 1.5 ml의 6 웰 플레이트의 웰 당 볼륨 (또는 조직 배양 접시의 다른 유형에 대한 적절한 규모의 볼륨)를 사용합니다. 1000 XG에 스핀과 접시 원심 분리기에서 1 시간 37 ºC.
    참고 : 이상적으로, 분할 1 ~ 2 일 이내에 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터와 NPC의 형질 도입. 상업적 또는 실험실 준비 바이러스를 사용하든, 적절 용액을 희석하여 사전에 바이러스의 배치를 역가하는 것이 도움이 될 수 있습니다. (그림 3).
  2. CEL을 줄이기 위해하여 세포 죽음, spinfection의 8 시간 내에서 미디어를 교체합니다.
    참고 : 바이러스 성 통합 및 유전자 발현은 리포터 유전자 형광 24 시간 이내에 검출 할 수 있어야합니다. (바이러스가 형광 기자 부족하면,이 평가하기 어렵다; 성공적으로 형질이 가장 과발현 제품에 대한 면역, 면역 조직 화학 또는 qPCR에 의해 검증 될 수있다.) 전체 표현 3-7 일이 소요될 수 있습니다; 추가적인 바이러스 반복 spinfections는 형질 감염된 세포의 백분율을 증가시키기 위해 필요할 수있다. 재발 spinfections 매일 발생할 수 있지만, 너무 자주 할 필요는 없다. 이상적으로, 형광 기자를 사용하는 경우,> 세포의 80 %가 표시되어야합니다.

5. Neurosphere 마이그레이션 분석

참고 : 엔피씨의 효소 분해 다음 자발적으로 neurosphere를 양식 - 세포 NPC 미디어에 정지에서 배양하는 경우, (NPC 확장에 사용되는 것과 동일한 방식으로는 3.3-3.6 단계).

  1. 간단히, 해리 성장neurosphere를 생성하기 위해 비 접착 성 판에서 48 시간 동안 NPC 미디어에서 D의 NPC. (그림 4).
  2. neurosphere 마이그레이션의 경우, 96 웰 플레이트에, 오히려 DMEM보다 따기 neurosphere하기 전에 1-2 시간을 초기 NPC 미디어를 사용하여 신선한 마트 리젤 판을 준비합니다. 우물에서 마트 리젤을 대기음하지 마십시오.
  3. 원래 배아 줄기 세포 유래 neurosphere를 22 용으로 제작 된 바와 같이, 수동으로 세포 파편을 제거하기 위해 NPC 미디어에 한 번 세척 후, 현미경으로 NPC 파생 neurosphere를을 선택합니다. 마트 리겔 - 코팅 된 96- 웰 플레이트의 각 웰에 하나 neurosphere 전송.
  4. 각 96 웰 플레이트에 neurosphere를에, 차가운 NPC 미디어에 희석 추가로 0.5 mg의 마트 리젤을 추가합니다.
  5. 수동 웰 피펫 팁을 사용하는 도중에 각 neurosphere 중앙.
    주 : 결과에 변동을 감소시키기 위해, 유사한 크기를 neurosphere를 선택하는 것이 중요하다.
  6. 마이그레이션이 48 시간 동안 발생하고 w 세포를 고정 할 수 있도록 허용원하는 면역 마커 번째 4 % 파라 포름 알데히드와 얼룩.
  7. 방사상 이동은 완전히 4X 현미경 대물 렌즈를 사용하는데, 사진 neurosphere를 결정해야하는 경우. 우물의 가장자리 또는 분석에서 두 번째 neurosphere 연락 어떤 neurosphere를 제외.
    참고 : 마이그레이션 이상 48 시간 동안 발생하는 경우, 결과 방사형 마이그레이션 가능성이 4 배 목표를 사용하여 이미지에 너무 큰 것입니다.
  8. NIH ImageJ에 소프트웨어 (그림 5)를 사용하여 각 neurosphere에서 평균 이동을 측정한다. 이는 후술하는 분석 방법 중 하나를 사용하여 수행 할 수있다 :
    1. 방사형 마이그레이션 :
      1. 수동 후 얻어진 도형의 면적을 계산하기 위해 측정 (Ctrl 키 + M) 함수를 사용하여 자유 선택 도구를 사용하여 마이그레이션 먼 셀 가장자리를 추적. 측정하기 전에 지역은 면적이 분석 탭에서 볼 수있는 설정 측정 창에서 선택되어 있는지 확인합니다. 사용면적 측정과 원 (A = πr 2)의 영역에 대한 방정식의 값은 반경 (외부)을 결정합니다.
      2. 원래의 에지 neurosphere 추적 면적을 측정하고 같은 방법으로 반경 (내측)을 계산한다. 외부 및 내부 반경 사이의 차이로서 총 방사상 이동을 계산한다.
    2. 최고의 휴대 마이그레이션 :
      1. 측정 (Ctrl 키 + M) 함수 다음에 직선 선택 도구를 사용하여 내부 neurosphere의 가장자리로부터 먼 다섯 셀로 이동 거리를 측정한다.

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Representative Results

신경 로제트는 apico - 기초 극성 (그림 1)와 neuroepithelial 세포의 원형 클러스터로서의 특성 외관에 의해, 시야 현미경을 사용하여, 형태 학적으로 식별 할 수 있습니다. NPC가 매우 높은 세포 밀도에서 일반적으로 배양 있지만, 바로 계대에 따라 약간 피라미드 모양의 소마와 바이폴라 신경 돌기 구조는 볼 (그림 1D)입니다. III-tubulin의 얼룩은 NPC들 중 일부 비율이 지속적으로 문화 (그림 1 층)에서 신경 세포의 분화를 시작하는 것을 나타내는 모든 NPC 인구도 볼 수 있지만 검증의 NPC, 세포의 대부분에 네 스틴 및 SOX2을 표현한다. 이러한 LMX1A 및 FOXA2으로 중뇌 마커 (그림 1G-I)하지 않는 상태에서 이러한 SOX2 및 PAX6, 및 TBR2 같은 전뇌 신경 전구 세포 등의 신경 줄기 세포의 마커는, 또한, NPC들로 표현된다. 크고 평평한 섬유 아세포 유사 세포의 상당한 부분 내의 NPC 인구는 낮은 품질의 NPC가 신경 세포 분화 (그림 2) 다음 뉴런의 큰 숫자를 얻을 가능성이있는, 생성 된 것을 나타냅니다.

형광 기자 벡터 (그림 3)에 포함하여 고역가의 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터를 성공적으로 전달에 이어, 세포의 80 % 이상을 표시하여야한다. Neurosphere 세대는 일반 공급으로 약 1 주일 동안 문화에서 건강을 유지 할 수 있습니다, 상대적으로 균일 한 크기의 neurosphere를 (그림 4)의 인구를 산출한다. Neurosphere 마이그레이션 건강 neurosphere를 (그림 5)에 견고하게 발생하고 hiPSC 엔피씨는 neurosphere 마이그레이션 분석 과정에서 급속한 분화를 겪게.

그림 1

십t "> 그림 1. 환자 별 hiPSCs, NPC의 뉴런. hiPSC 신경 분화의 명 시야 이미지, 배아 체 (B), 신경 로제트 (C), 엔피씨 (D)과 뉴런 hiPSCs (A)에서 (E) ... 100 배, 스케일 바 100 μm의 FI hiPSC의 NPC NPC 마커 네 스틴 (녹색)과 신경 세포 마커 III-tubulin의 (적색) (F)를 포함하는 전뇌 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포 마커의 수에 긍정적이다 하지만 중뇌 마커 LMX1A (녹색) 및 FOXA2 (적색) (I) 및 전뇌 선조 마커 TBR2 (적색) (H), 신경 줄기 세포의 전사는 SOX2 (녹색) 및 PAX6 (적색) (G)을 인자. DAPI 염색 핵 (파란색). 100 배, 스케일 바 100 μm의. J.의 NPC (70-80% III-tubulin에 양성 신경 세포 (녹색) 및 20 ~ 30 % 아교 섬유 성 산성 단백질에 GFA를 차별화 할 수P) 양성 성상 세포 (빨간색). 200X, 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2

그림 2. 유효성 검사 NPC 라인. 고품질 (왼쪽) hiPSC의 NPC 명시 네 스틴 (적색) 및 SOX2 (녹색). SOX2 음성 및 네 스틴 - 음성 세포 (오른쪽)의 패치가 품질이 낮은 (왼쪽 아래)의 NPC 반면 대부분의 세포 (DAPI (파란색)로 염색 핵)에서. 높은 품질의 NPC들과 차별화 4 주 된 신경 세포는 MAP2AB (녹색) 및 III-튜 불린 (적색) (오른쪽 위) 표현하지만, 낮은 품질의 NPC들과 차별화 사람들은 (오른쪽 아래)하지 않습니다. 100 배, 스케일 바 100 μm의. 더 큰 VE를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rsion.

그림 3

NPC들. 브라이트 (위) 그림 3. 바이러스 성 형질 도입 및 GFP의 형광 (아래) 전 (왼쪽)과 바이러스 성 spinfection 후 hiPSC의 NPC의 이미지. 100 배, 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4

그림 4. Neurosphere 형성. 자기편의 NPC (왼쪽)과 새로 형성된 neurosphere를 (오른쪽)의 명 시야 이미지. 100 배, 스케일 바 100 μm의. LAR를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 게르 버전.

그림 5

5. Neurosphere 마이그레이션 그림. AB. 브라이트 전에 neurosphere를의 이미지 (A)과(B) 마트 리겔에서 마이그레이션의 48 시간. NIH ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 방사형 신경 마이그레이션을 분석하는 방법을 보여 100 배, 스케일 바 100 μm의. CG. 화면 캡처 이미지. ImageJ에 도구 모음에서 '자유 선택'(C)을 클릭합니다. neurosphere를 (D)의 주위 이주 먼 셀 가장자리 추적. 영역이 설정 측정 창 (E)에 체크되어 있는지 확인합니다. 측정 기능 (Ctrl 키 + M) (F)를 사용합니다. ((G) 원래 neurosphere를의 가장자리를 추적 및 측정 기능을 사용Ctrl + M). 측정 후 분석을 위해 Excel로 내보낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미디어 구성 요소들
HES 미디어 DMEM / F12 (Life 기술 # 11330)
20 % KO-세럼 교체 (Life 기술 # 10828)
1 배 루타 (Life 기술 # 35050)
1 배 NEAA (Life 기술 # 11140)
1X 2- 머 캅토 에탄올 (55MM의 1000 배) (Life 기술 # 21985-023)
20ng / ㎖의 FGF2 (Life 기술 13256-029)를
N2 / B27 미디어 DMEM / F12 (Life 기술 # 10565)
1 배 N2 (Life 기술 # 17502-048)
1 배 B27-RA (Life 기술 # 12587-010)
NPC 미디어 DMEM / F12 (Life 기술 # 10565)
1 배 N2 (Life 기술 # 17502-048)
1 배 B27-RA (Life 기술 # 12587-010)
20 NG / ㎖ FGF2 (생명 기술)
1 ㎎ / ㎖ 자연 마우스 라미닌 (Life 기술 # 23017-015)
신경 미디어 DMEM / F12 (Life 기술 # 10565)
1 배 N2 (Life 기술 # 17502-048)
1 배 B27-RA (Life 기술 # 12587-010)
1 ㎎ / ㎖ 자연 마우스 라미닌 (생명 기술)
20 NG / ml의 BDNF (Peprotech # 450-02)
20 NG / ㎖ GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 ㎍ / ㎖의 Dibutyryl 사이 클릭 AMP (시그마 D0627 # 1)
200 nM의 L- 아스 코르 빈산 (시그마 # A0278)

표 1. 미디어 조리법.

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Discussion

우리는 NPC들에 hiPSCs는 신경 세포의 종류가있는 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 보존되고 그 잠재적으로 질병의 발병 기전 (8)에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수있다 구별하는 기준에 방법을 설명했다 (11). 우리가 자세히 것처럼 또한, NPC가 우리가 질병 소인의 분자 생화학 적 연구에 적합 할 수있다 생각 견고 복제 성 쉽게 형질 신경 인구입니다.

우리가 분화하는 상세한 방법 및 배양 전뇌 무늬의 NPC를 갖지만, 그들은 쉽게 다른 세포 운명으로 패터닝의 NPC를 생성하도록 구성 될 수있다. 예를 들어, 부동 사채 먼저 NPC 미디어의 확장과 20 ng의 보충 신경 미디어에서 차별화 할 수 있습니다 0.5 ㎎ / ㎖의 DKK1, 10 mM의 SB431542, 0.5 ㎎ / ㎖ 소량과, 해마의 NPC가 생성됩니다 1mM의 cyclopamine로 치료하는 경우 / ㎖ WNT3A 7 12, 23을 신경. 가장 하위 특정 신경 세포 분화 프로토콜이 NESTIN-를 통해 진행 및 SOX2-positve 중간, 우리는 유사한 방법이 GABAergic- 2,24에 대한 적응력과 3,25,26 특정 NPC 인구를 glutamatergic- 수 있다는 예측 감안할.

주목할만한 프로토콜 내에서 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 과발현 또는 내인성 유전자 발현을 쓰러 뜨린,이 기자가 변수 크기의 벡터로부터 발현 될 때 우리가 개화에 상당한 차이를 관찰로, 동일한 바이러스 백본에서 형광 단백질을 발현 제어 벡터를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다 경우, 최초로 (때문에 감소 포장 효율성벡터 크기) 또는 차 발기인 (발기인 효율의 차이) 때문에와. 둘째, 우리는 우리가 조밀 neurosphere 구조로 바이러스 벡터의 가난한 투과도를 관찰 한 바이러스 성 전달 전에, 형성을 neurosphere하기 완료하시기 바랍니다. 셋째, 통로 열 이후의 NPC 증가 통로 번호로서, 우리는 종종 neurosphere 분석에서 실질적으로 손상 마이그레이션을 관찰한다. 실제로, 통로와 성상 세포의 큰 비율을 수득의 NPC의 성향을 주어, 각 실험에서 NPC 라인의 통로와 일치하는 것이 중요하다.

마지막으로, 설명 된 기술의 생물학적 및 기술적 한계를 고려하는 것이 중요하다. NPC의 눈에 의해 형태 학적으로 유사한 것으로 나타나 있지만, 그들은 글루타메이트 및 GABA 성 뉴런 모두를 생성 할 수있는 세포로 구성된 이종 집단이다. 우리는이 방식 운전 방식을 사용하여 개인 사이 NPC 라인의 매우 일관된 전뇌 패턴을 관찰하는 동안D 1,이 경우에만 완벽하게 검증 된 고품질의 NPC 라인을 비교 - 좋은 품질이 좋지 NPC 라인 사이에 상당한 차이가 있습니다. 또한, 바이러스 유전자 전달 수율 이종 세포의 게놈 위치에서 고유 바이러스 벡터의 각 통합; 따라서, 각각의 세포는 유전자 삽입 부위의 위치와 수에 모두 다릅니다. 유전자 조작은 (는) 아연 손가락, TALEN 또는 CRISPR 기반 전략에 의해 발생하는지, 정확하고 정의 위치를​​ 대상으로 할 때 유전자 발현에 더 일관성있는 변화는 항상 발생합니다.

환자 hiPSC 유래의 NPC는 신경 질환에서 발생하는 전체 유전자 발현 섭동 또한 건강 또는 질병 환자 유래의 신경 세포 중 하나의 컨텍스트에서 후보 유전자 또는 마이크로 RNA를 조작 분자 및 / 또는 셀룰러 효과 모두를 연구하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법의 결과는 하나 이상의 키를 조작위험 대립 유전자 (들)은 다양한 유전 적 배경의 맥락에서 특성화 될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

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References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
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