Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Genexpressiestudies van neuronen onderscheiden in vitro van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) door ons 1 en anderen 2,3 geven aan dat iPSC neuronen lijken foetale eerder dan volwassen hersenweefsel. Momenteel kan iPSC-gebaseerde modellen geschikter voor de studie van aanleg voor, dan laat kenmerken van neurologische ziekte. We hebben eerder gemeld dat een aanzienlijke fractie van de genen profiel van schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen is geconserveerd in schizofrenie-iPSC afgeleide neurale progenitorcellen (NPC), wat aangeeft dat NPC nuttig celtype kan worden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die bijdragen tot schizofrenie 1 . Wij en anderen hebben afwijkende migratie, verhoogde oxidatieve stress en reactieve zuurstofverbindingen, gevoeligheid voor sub-threshold milieu stress en verminderde mitochondriale functie bij schizofrenie iPSC NPCs 1,4-6, evenals een verminderde neuronale c gemeldaansluitmogelijkheden en synaptische functie bij schizofrenie iPSC neuronen 5,7-10. Als de moleculaire factoren die bijdragen tot afwijkende migratie en / of oxidatieve stress bij schizofrenie iPSC NPC liggen ook aan de verminderde neuronale connectiviteit schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen kan NPC een robuust en zeer replicatieve neurale populatie waarmee de mechanismen verantwoordelijk voor de ziekte te bestuderen. Bovendien, omdat men snel kan genereren grote aantallen cellen en behoeft niet weken of maanden wachten neuronale rijping, NPC-gebaseerde assays zijn geschikt voor de studie van grotere patientencohorten en zijn meer vatbaar voor high throughput screening. Wij geloven dat iPSC NPC kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingspaden potentieel bijdragen aan pathogenese, zoals reeds aangetoond in diverse stoornissen schizofrenie 1 en Huntington's ziekte 11.

Om NPC's te onderscheiden van hiPSCs, eerste neurale inproductie wordt bereikt door het dual-SMAD inhibitie (0,1 mM LDN193189 en 10 mM SB431542) 12. Door antagoniseren van BMP en TGF signalering met deze kleine moleculen is endoderm en mesoderm specificatie geblokkeerd versnellen neuronale differentiatie en leidt tot de vorming van zichtbare neurale rozetten binnen een week van plating. Neurale patroonvorming optreedt vroeg in dit proces, vermoedelijk tijdens de neurale rozet vorming en onmiddellijk daarna. In afwezigheid van andere signalen, deze primitieve neurale cellen gaan uit van een anterieure voorhersenen-achtige lot 13. Onmiddellijk na neurale rozet vorming, en de lopende hele NPC expansie, voorhersenen NPC's zijn gekweekt met FGF2 8,14. Zij hebben een dubbele lijn potentieel en kan worden gedifferentieerd tot neurale populaties van 70-80% III-tubuline-positieve neuronen en 20-30% gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) -positieve astrocyten (figuur 1). De meeste voorhersenen iPSC neuronen VGLUT1 positieveEn dus zijn vermoedelijk glutamaat, hoewel ongeveer 30% van neuronen zijn GAD67-positief (GABAerge) 8.

NPC routinematig gepasseerd meer dan tien keer in vitro, met behoud differentiatie profielen zonder accumuleren karyotype afwijkingen. Groepen hebben passage NPCs meer dan 40 maal 15, vinden we echter dat voorbij tien passages, NPC's tonen verhoogde neiging tot astrocyten differentiatie gemeld. NPC goed verdragen meerdere vries-dooi en kan worden overgezet groeien als neurospheres door simpelweg kweken in niet-hechtende platen. NPC's worden efficiënt getransduceerd door virale vectoren, waardoor een snelle evaluatie van de moleculaire en cellulaire gevolgen van genetische verstoring, en eenvoudig uit te breiden om voldoende materiaal opleveren voor biochemische studies. Bovendien, omdat virale vectoren toe robuuste overexpressie en / of knockdown van ziekte-relevante genen in beide control of patiënt afgeleide NeurAl cellen, kan men dit platform gebruiken om het effect van genetische achtergrond van deze manipulaties testen. Hoewel niet geschikt voor synaptische of activity based assays die volwassen neuronen, kan NPC's een praktisch alternatief voor veel ongecompliceerd moleculaire of biochemische analyses van de patiënt afgeleide neurale cellen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. iPSC Differentiatie naar neurale progenitorcellen

  1. Groeien en uitbreiden hiPSCs in menselijke embryonale stamcellen (HES) media (tabel 1) samen gekweekt op een muis embryonale fibroblasten (MEF) voedingslaag tot grote (maar subconfluente) kolonies zijn klaar voor neurale differentiatie via een embryoid lichaam (EB) tussenliggende (Figuur 2). Routine iPSC kweekomstandigheden zijn goed elders 16,17 beschreven; kort, groeien hiPSCs in HES media op een MEF feeder laag tot samenvloeiing, vervolgens enzymatisch passage met collagenase (1 mg / ml in DMEM) en uitbreiden van ongeveer 1: 3 elke 7 dagen.
  2. Poly-L-ornithine / laminine beklede platen, laag petrischaal met 10 g / ml Poly-L-Ornithine in steriel water voor kunststof oppervlakken (50 g / ml voor glasoppervlakken) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-24 uur. Wassen ten minste een keer met steriel water en vervolgens jas met 5 g / ml Laminin in steriele PBS bij RT voor 3-24 uur.
    OPMERKING: Als verpakt in plastic, kunnen platen wordenbewaard gedurende zes maanden bij -20 ° C.
  3. Op dag 1, enzymatisch lift subconfluente hiPSCs (meestal gekweekt op MEFs of hiPSCs gekweekt in gedefinieerde media zoals TeSR 18 op Matrigel) van de plaat als grote kolonies met 1 mg / ml collagenase IV in DMEM / F12.
    OPMERKING: Na 1-2 uur incubatie bij 37 ° C, wordt kolonies drijven in de schaal.
  4. Voorzichtig wassen iPSC kolonies (door bezinking, niet centrifugeren) 1-2x met DMEM / F12, resuspendeer in 2 ml / putje van N2 / B27 medium (tabel 1) en overdracht naar niet-hechtende 6 putjes (combineer 3-putjes in 1 -goed) 19.
    OPMERKING: Overnachting, zullen kolonies zwevende bolvormige clusters te vormen aangeduid als "embryoid lichamen" (EBS). Verwachten aanzienlijke celdood.
  5. Op dag 2, tilt platen en laat EBS om zich te vestigen. Verwijder voorzichtig de media en een keer wassen met DMEM / F12 om vuil te verwijderen. Voeden met N2 / B27 media aangevuld met dubbele SMAD remmers (0,1M LDN193189 en 10M SB431542) 12
  6. Op dagen 3-7, zal neuralization voordoen in de context van dubbele SMAD remming; controleer of EBS zijn rond, maar niet cystic. Voeden EBS elke tweede dag met N2 / B27 media, aangevuld met 0,1 M LDN193189 en 10M SB431542.
  7. Op dagen 7-14, na plating van EBS te Poly-L-Ornithine / Laminin gecoate platen, te controleren met een helderveld microscoop die neurale rozetten beginnen te verschijnen binnen een paar dagen (gekarakteriseerd als ronde clusters van neuro-epitheliale cellen met apico-basale polariteit; Figuur 1). Doorgaan met aanhangend EBS elke tweede dag met N2 / B27 media, aangevuld met 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 en 1 g / ml laminin voeden.

2. Oogst van Neural rozetten

OPMERKING: Wij raden neurale rozetten enzymatisch worden geoogst met behulp van neurale Rosette Selectie Reagens 20 of soortgelijke selectie reagens. Hoewel neurale rozetten handmatig worden opgepikt in 6-well Poly-L-ornithine / laminine beklede platen, this methode houdt uitgebreide training te beheersen en, afhankelijk gebruiker vaardigheid kan een tweede plukken op dag 20 verder verrijken NPC en afbreken niet-neurale celtypen vereist.

  1. Voor enzymatische selectie van neurale rozetten op dag 14, aspireren media uit gehandeld EBS en voeg 1 ml van neurale rozet selectie reagens per goed voor een 6-wells plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  2. Met een P1000 Pipetman, verwijder voorzichtig enzym uit elk putje. Voeg 1 ml DMEM / F12 per putje te wassen.
  3. Met een P1000, verzamel de 1 ml DMEM / F12 en snel verdrijven de DMEM / F12 weer in de put, waardoor losmaken van de rozetten van de plaat. Verzamel de rozetten in een valk buis.
  4. Pipet nog eens 1 ml DMEM / F12 en snel te verdrijven in dezelfde put om de resterende rozetten los. (Niet vermaal. Probeer niet te breken rozet aggregaten). Verzamel de neurale rozetten in dezelfde falcon buis.
  5. Herhaal stap 2.4 als nodig. Als rozetten niet gemakkelijk los te maken, voeg moopnieuw enzym en herhaal het proces (stappen 2.1-2.4)
  6. Spin-cellen bij 300 g gedurende 3 min. Zuig het wassen, en opnieuw op te schorten rozetten in 2 ml van NPC media (tabel 1). Overdracht cellen (1: 1) in een poly-L-ornithine / laminine beklede plaat met 6 putjes.
  7. Van Dagen 15-21, zal de neurale rozetten uit te breiden; -feed rozetten elke tweede dag met NPC media.
  8. Evalueer de kwaliteit van de neurale rozetten en zorgen dat platte fibroblast-achtige cellen niet uitbreiden in de kweek.
    OPMERKING: Als niet-rozetten aanhouden, kan de NPC cultuur soms worden geborgen door manuele picking, het selecteren van alleen de beste van de geplukte rozetten in Accutase. Distantiëren 15 min bij 37 ° C. Pellet, wassen en plaat in NPC media op 24-goed Poly-L-Ornithine / Laminin gecoate plaat.

3. Uitbreiding van neurale progenitorcellen

OPMERKING: iPSC NPC kan worden gekweekt op beide Matrigel- of poly-L-ornithine / laminine beklede platen. We gebruiken meestal MATRIGEl-platen zij sneller kunnen worden bereid en goedkoper.

  1. Ter voorbereiding Matrigel beklede platen snel ontdooien en resuspendeer een 1 mg bevroren hoeveelheid van Matrigel in 24 ml koude DMEM / F12 en onmiddellijk distribueren 2 ml in elk putje van twee platen met zes putjes. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 * C.
    OPMERKING: Matrigel alleen nodig afgezogen, gewassen, onmiddellijk voor gebruik.
  2. Voeden NPC's om de dag en tegen zeer hoge dichtheid te behouden of ze zullen spontaan differentiëren tot neuronen.
    OPMERKING: Hoewel gevestigde NPC typisch gesplitst 1: 4 wekelijks, kan zeer lage passage NPC gesplitst 1: 2 zo weinig eenmaal per twee weken.
  3. Te splitsen, eerste aspireren media en voeg 1 ml warm Accutase (1X) per putje van de 6-well plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10-15 min.
  4. Zacht overdracht losgemaakte cellen in een 15 ml buis met DMEM / F12 met zo weinig mechanische belasting mogelijk. Niet cellen titreren terwijl in enzym. Pellet cellen door Spinning bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
  5. Zuig het wassen, en opnieuw op te schorten NPCs in ~ 1 ml NPC media per originele waterput van 6-well.
    OPMERKING: Verwacht dat een samenvloeiing putje van een 6-well gerecht heeft 5-10.000.000 cellen; Dit kan worden bevestigd door het tellen van een 10 l monster van cellen met een hematocytometer voor opnieuw plating.
  6. Volgende re-ophanging, re-plaat NPCs als NPC's, neuronen of neurosferen. Om NPC's te behouden, plaat ongeveer 1-2.000.000 cellen per putje van een 6-wells plaat. De efficiëntie van neurosphere vorming kan variëren experimenten en cellijnen, maar gebeurt meestal best als 200.000 tot 1.000.000 cellen per well van een niet-hechtende 6-well plaat; indien klonteren van de neurosferen optreedt, vermindering van het aantal cellen gezaaid. Om onderscheid te neuronen, plaat ongeveer 200.000 cellen per putje van een 6-wells plaat, ter vervanging van NPC media met Neuron media.
  7. Immunohistochemisch valideren elke vastgestelde NPC lijn. Zodra voldoende celmateriaal is geweest expanded, label NPCs met antilichamen voor nestine en SOX2. Bevestigd NPC lijnen moet worden gedifferentieerd tot neuronen gedurende 4-6 weken, en gelabeld met antilichamen voor III-tubuline en MAP2AB.
    1. Fix cellen in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C gedurende 10 min. Permeabilize NPC bij kamertemperatuur gedurende 15 min in 1,0% Triton in PBS en vervolgens geblokkeerd in 5% ezel serum met 0,1% Triton bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    2. Incubeer met primaire antilichaam in 5% ezel serum met 0,1% Triton, overnachting in 4C.
      OPMERKING: Wij raden de volgende antilichamen: geit anti-Sox2, 1: 200; muis-anti-humaan Nestin, 1: 200; konijn anti-βIII-tubuline, 1: 500; muis anti-βIII-tubuline, 1: 500; muis anti-MAP2AB, 1: 200. (Figuur 2).
    3. Na een wassing met PBS, geïncubeerd secundaire antilichamen cellen met het geschikte geconjugeerde tweede antilichaam aan geit, muis of konijn 1: 300, in in 5% ezel serum met 0,1% Triton gedurende 1-2 uur bij KT. Om kernen vlek cellen visualiseren met 0,5 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) en dan monteren met Vectashield.

4. NPC Transduction

  1. Gebruik spinfection (centrifugeren van celkweek platen in aanwezigheid van virus bij 1000 xg gedurende 1 uur) tot het percentage getransfecteerde cellen 21 verhogen. Zuig media vervangen door het desbetreffende overexpressie (controle) lentivirussen (of retrovirussen), getitreerd tot de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) (kenmerkend 1-10), verdund in NPC media. Gebruik 1,5 ml volume per putje van een 6-well plaat (of door een overeenkomstig geschaald volume voor andere vormen van weefselkweek platen). Spin op 1.000 xg en 37 ° C gedurende 1 uur in een plaat centrifuge.
    LET OP: In het ideale geval transduceren NPCs met lentivirale of retrovirale vectoren binnen 1-2 dagen te splitsen. Of het gebruik van commerciële of-laboratorium vervaardigde virussen, kan het nuttig zijn om adequaat te titreren batches van virus vooraf door seriële verdunning zijn. (Figuur 3).
  2. Om cel te verminderenlaire dood, vervang media binnen de 8 uur van spinfection.
    OPMERKING: Virale integratie en transgene expressie moet aantoonbaar binnen 24 uur met de reporter gen fluorescentie zijn. (Als het virus ontbreekt een fluorescerende reporter, dit is moeilijker te beoordelen succesvolle transfectie kan het best worden gevalideerd door immunoblot, immunohistochemie of qPCR voor overexpressie producten.) Vol expressie kan 3-7 dagen; herhaalde spinfections extra virus nodig zijn om het percentage getransfecteerde cellen verhogen. Terugkerende spinfections kunnen dagelijks plaatsvinden, maar hoeft niet zo frequent zijn. Idealiter, bij gebruik van een fluorescerende reporter,> 80% van de cellen worden gemerkt.

5. Neurosphere Migratie Assay

OPMERKING: Neurosferen vorm spontaan, na de enzymatische dissociatie van NPC's (door een wijze identiek aan die in NPC expansie - stappen 3,3-3,6), als cellen worden gekweekt in suspensie in NPC media.

  1. Kortom, groeien distantiërend NPCs in NPC media voor 48 uur in nonadherent platen om neurosferen genereren. (Figuur 4).
  2. Voor neurosphere migratie, vers bereid Matrigel platen met koud NPC media plaats DMEM, in een 96-well plaat, 1-2 uur voorafgaand aan neurosfeer plukken. Niet aspireren Matrigel van de putten.
  3. Zoals oorspronkelijk gepubliceerd voor embryonale stamcellen afgeleide neurosferen 22, handmatig pick NPC-afgeleid neurosferen onder een microscoop, na één keer wassen in NPC media om cellulaire vuil te verwijderen. Breng een neurosfeer aan elk putje van een Matrigel gecoate 96-well plaat.
  4. Voeg een extra 0,5 mg Matrigel, verdund in koude NPC media, de neurosferen in elke 96-well plaat.
  5. Handmatig te centreren elke individuele neurosphere in het midden van de put met behulp van een pipet tip.
    OPMERKING: Het is belangrijk om neurosferen van vergelijkbare grootte te plukken, om de variabiliteit te verminderen in de resultaten.
  6. Laat migratie optreden voor 48 uur en dan fix cellen wi 4% paraformaldehyde en vlek met gewenste immunohistochemische markers.
  7. Als radiale migratie te bepalen, foto neurosferen in hun geheel met een 4x microscoopobjectief. Exclusief eventuele neurosferen contact opnemen met de rand van de put of een tweede neurosphere uit de analyse.
    OPMERKING: Als de migratie plaatsvindt langer dan 48 uur, zal de resulterende radiale migratie waarschijnlijk te groot om de afbeelding te zijn met behulp van een 4x objectief.
  8. Meet gemiddelde migratie van elkaar neurosphere gebruik NIH ImageJ software (figuur 5). Dit kan worden gedaan met behulp van een van de analysemethoden die hieronder worden beschreven:
    1. Radial migratie:
      1. Handmatig traceren van de rand van het verst migrerende cellen met behulp van de vrije hand selectie gereedschap en gebruik dan de Measure (Ctrl + M) functie om de oppervlakte van de resulterende vorm te berekenen. Voordat het meten van het gebied zorgen ervoor dat de omgeving wordt gecontroleerd in de Set Metingen raam te vinden onder het tabblad Analyseren. Gebruik dewaarde van het gebied meting en de vergelijking voor de oppervlakte van een cirkel (A = πr 2) aan de radius (buitenste) te bepalen.
      2. Trace de rand van het origineel neurosphere, meet het gebied en het berekenen van de radius (innerlijke) op dezelfde manier. Bereken de totale radiale migratie als het verschil tussen de buitenste en binnenste stralen.
    2. Grootste cellulaire migratie:
      1. Meet de afstand verplaatst van de vijf verst cellen van de rand van de binnenste neurosphere met behulp van de lineaire selectie-instrument, gevolgd door de Measure (Ctrl + M) functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neurale rozetten kunnen morfologisch worden geïdentificeerd met een helderveld microscoop, door hun karakteristieke uiterlijk als ronde clusters van neuro-epitheelcellen met apico-basale polariteit (figuur 1). Hoewel NPC zijn meestal gekweekt bij zeer hoge celdichtheid, onmiddellijk na passage, enigszins piramidale vorm soma en neurieten bipolaire structuur zichtbaar (figuur 1D). Gevalideerde NPC express nestine en SOX2 in de meeste cellen, maar III tubuline kleuring zichtbaar in alle NPC populaties, wat aangeeft dat sommige percentage NPC voortdurend initiëren neuronale differentiatie in de kweek (Figuur 1F). Markers van neurale stamcellen, zoals SOX2 en PAX6 en voorhersenen neuronale voorlopercellen, zoals TBR2, ook uitgedrukt in NPC, terwijl middenhersenen merkers zoals LMX1A en FOXA2 niet (Figuur 1G-I). Een aanzienlijk deel van groot en vlak fibroblast-achtige cellen in een NPC populatie aan dat slechte kwaliteit NPC zijn gegenereerd die waarschijnlijk grote aantallen neuronen na neuronale differentiatie (figuur 2) verkregen zijn.

Na succesvolle transductie met een hoge titer lentivirale of retrovirale vector zou meer dan 80% van de cellen gelabeld met de fluorescente reporter in de vector opgenomen (figuur 3). Neurosfeer genereren moet een populatie neurosferen relatief homogene grootte (figuur 4), die met regelmatige voeding kan gezond kweek gedurende ongeveer een week verkregen. Neurosphere migratie gebeurt robuust bij gezonde neurosferen (figuur 5), en iPSC NPC's ondergaan een snelle differentiatie in de loop van een neurosphere migratie assay 1.

Figuur 1

tent "> Figuur 1. Patiënt-specifieke hiPSCs, NPC en neuronen. Helderveld afbeeldingen iPSC neurale differentiatie van hiPSCs (A), om embryoïde lichamen (B), neurale rozetten (C), NPC (D) en neuronen (E) ... 100x, schaal bar 100 micrometer FI iPSC NPC's zijn positief voor een aantal voorhersenen neurale stamcellen en neurale voorlopercellen cel marker, met inbegrip van de NPC marker nestin (groen) en de neuronale marker III-tubuline (rood) (F); de neurale stamcellen transcriptiefactoren SOX2 (groen) en PAX6 (rood) (G) en de voorhersenen voorlopercellen marker TBR2 (rood) (H), maar niet de middenhersenen markers LMX1A (groen) en FOXA2 (rood) (I). DAPI-gekleurde kernen (blauw). 100x, schaal bar 100 micrometer. J. NPCs kunnen differentiëren tot 70-80% III-tubuline-positieve neuronen (groen) en 20-30% gliale fibrillaire zuur eiwit (BVOP) -positieve astrocyten (rood). 200x, schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2

Figuur 2. valideren NPC Lines. Hoge kwaliteit (linksboven) iPSC NPCs uitdrukkelijke Nestin (rood) en SOX2 (groen). in de meeste cellen (kernen gekleurd met DAPI (blauw)), terwijl lage kwaliteit (linksonder) NPCs flarden van SOX2-negatief en nestine-negatieve cellen (rechts) hebben. 4 weken oude neuronen onderscheiden van hoge kwaliteit NPCs uiten MAP2AB (groen) en III-tubuline (rood) (rechts boven), maar die onderscheiden van lage kwaliteit NPCs niet (rechtsonder). 100x, schaal bar 100 micrometer. Klik hier om te bekijken een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3

Figuur 3. Virale transductie van NPCs. Helderveld (boven) en GFP fluorescentie (onder) beelden van iPSC NPCs voor (links) en na virale spinfection. 100x, schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4

Figuur 4. Neurosphere Vorming. Helderveld beelden van aanhangend NPCs (links) en de nieuw gevormde neurosferen (rechts). 100x, schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.

Figuur 5

Figuur 5. Neurosphere Migratie. AB. Helderveld beelden neurosferen vóór (A) en na (B) 48 uur migratie in Matrigel. 100x, schaal bar 100 micrometer. CG. Screen capture beelden aantonen van de methodologie voor het analyseren radiale neurale migratie met behulp van NIH ImageJ software. Klik op 'de vrije hand selecties' op ImageJ werkbalk (C). Trek de rand van het verste gemigreerde cellen rond de neurosferen (D). Zorg ervoor dat de omgeving wordt gecontroleerd in de Set Metingen venster (E). Gebruik de Measure-functie (Ctrl + M) (F). Trace de rand van het origineel neurosferen (G) en gebruik de Measure-functie (Ctrl + M). Metingen kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar Excel voor analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Media Onderdelen
HES media DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Serum Vervangende (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-mercapto-ethanol (55mm 1000x) (Life Technologies # 21985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13.256-029)
N2 / B27 media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
NPC media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml Natural Muis Laminin (Life Technologies # 23017-015)
Neuron media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
1 mg / ml Natural Muis Laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 mg / ml dibutyryl cyclisch AMP (Sigma # D0627)
200 nM L-ascorbinezuur (Sigma # A0278)

Tabel 1. Media recepten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben beschreven methoden om te differentiëren hiPSCs in NPCs, een neuraal celtype waarin een aanzienlijk deel van het gen handtekening van iPSC-afgeleide neuronen wordt behouden en dat kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingstrajecten potentieel bijdragen aan de ziekte pathogenese 8, 11. Bovendien, zoals we hebben beschreven, NPC's zijn een robuust replicatief en gemakkelijk getransduceerde neurale bevolking, die naar onze mening kan geschikt zijn voor moleculaire en biochemische studies van de ziekte aanleg zijn.

Hoewel we Methoden te differentiëren en cultuur-voorhersenen patroon NPC, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast aan NPC patroon andere celtypes te genereren. Als bijvoorbeeld drijvende EBS eerst behandeld met 0,5 mg / ml DKK1, 10 mM SB431542, 0,5 mg / ml Noggin en 1 mM cyclopamine, hippocampale NPC worden gegenereerd die kunnen worden uitgebreid NPC media en gedifferentieerde neuronale medium aangevuld met 20 ng / ml Wnt3a 7 12,23. Gezien het feit dat de meeste subtype specifieke neuronale differentiatie protocollen verlopen via een NESTIN- en SOX2-positve intermediair, we voorspellen dat gelijkaardige methodes aangepast kan worden voor GABAergic- 2,24 en glutamatergic- 3,25,26 specifieke NPC populaties.

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol vermeldenswaard. Ten eerste, als overexpressie of neerhalen endogene genexpressie, het beste een controlevector gebruikt expressie van een fluorescerend eiwit van dezelfde virale ruggengraat, zoals we aanzienlijke verschillen in fluorescentie zijn waargenomen wanneer reporters expressie van vectoren met variabele afmetingen (wegens verminderde verpakkingsefficiëntiemet vector-formaat) of met verschil promotors (als gevolg van verschillen in de promotor efficiëntie). Tweede, raden wij het invullen van virale transductie voorafgaand aan de vorming neurosphere, zoals we slechte penetratie van virale vectoren in de dichte neurosphere structuur hebben waargenomen. Ten derde, als de passage nummer van de NPC's verder toeneemt dan passage tien, zien we vaak aanzienlijk verminderde migratie in de neurosphere assay. In feite, gezien de neiging van NPC een groter percentage van astrocyten met een passage opleveren, is het cruciaal om de doorgang van NPC lijnen in elk experiment passen.

Tenslotte is het belangrijk om de biologische en technische beperkingen van de beschreven technieken overwegen. Hoewel NPC lijken morfologisch vergelijkbaar met oog, ze zijn een heterogene populatie bestond cellen kan genereren zowel glutamaat en GABA-erge neuronen. Terwijl we observeren opmerkelijk consistent voorhersenen patroonvorming van NPC lijnen tussen individuen met behulp van deze method 1, dit is alleen bij het ​​vergelijken volledig gevalideerd hoge kwaliteit NPC lijnen - zijn er aanzienlijke verschillen tussen goede en slechte kwaliteit NPC lijnen. Daarnaast virale transductie opbrengsten genetisch heterogene cellen, elk met een integratie van de virale vector een unieke genomische locatie; daarom zal individuele cellen variëren zowel de locatie en aantal genomische integratieplaatsen. Meer consistente veranderingen in genexpressie zal altijd optreden bij genetische manipulatie wordt gericht op een exacte en gedefinieerde locatie, of het gebeurt door zink vinger TALEN of CRISPR strategieën.

Patiënt iPSC afgeleide NPC kan worden gebruikt om zowel de globale genexpressie verstoringen voorkomen van neurologische ziekten en ook moleculaire en / of cellulaire effecten van het manipuleren kandidaatgenen of microRNA in de context van zowel gezonde of zieke patiënt afgeleide neurale cellen te bestuderen. Zo de gevolgen van het manipuleren één of meer essentiëlerisico allel (en) kan worden gekarakteriseerd in de context van verschillende genetische achtergronden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics