En guide til generering og brug hiPSC Afledte NPC'ere for Studiet af neurologiske sygdomme

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Genekspressionsstudier af neuroner differentierede in vitro fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) af os 1 og andre 2,3 angiver, at hiPSC neuroner ligne føtalt snarere end voksne hjernevæv. På nuværende tidspunkt kan hiPSC-baserede modeller være mere passende for studiet af disposition til, i stedet for sene træk, neurologisk sygdom. Vi har tidligere rapporteret, at en betydelig del af genet underskrift af skizofreni hiPSC afledt neuroner er konserveret i skizofreni hiPSC afledt neurale progenitorceller (NPCs), hvilket indikerer, at NPC kan være en nyttig celletype til undersøgelse af de molekylære veje bidrager til skizofreni 1 . Vi og andre har rapporteret afvigende migration, øget oxidativt stress og reaktive ilt arter, følsomhed over for sub-tærskel miljømæssige belastninger og nedsat mitokondriefunktion i skizofreni hiPSC NPC'ere 1,4-6, samt nedsat neuronal ctilslutningsmuligheder og synaptiske funktion i skizofreni hiPSC neuroner 5,7-10. Hvis de molekylære faktorer, der bidrager til afvigende migration og / eller oxidativt stress i skizofreni hiPSC NPC'ere ligger til grund også den reducerede neuronal tilslutningsmuligheder i skizofreni hiPSC-afledte neuroner, kan NPC'ere være en robust og yderst replikativ neurale population med til at undersøge de mekanismer, der er ansvarlige for sygdom. Endvidere, fordi man hurtigt kan frembringe et stort antal celler og behøver ikke vente uger eller måneder for neuronal modning, NPC-baserede assays er egnede til undersøgelse af større patientkohorter og er mere modtagelig for high throughput screening. Vi mener, at hiPSC NPC'ere kan tjene som målestok for de udviklingsmæssige veje potentielt bidrager til sygdommen patogenese, som det allerede er påvist i sygdomme så forskellige som skizofreni 1 og Huntingtons sygdom 11.

For at differentiere NPC'ere fra hiPSCs, indledende neurale iduktion opnås ved dual-SMAD hæmning (0,1 mM LDN193189 og 10 mM SB431542) 12. Ved at antagonisering BMP og TGF signalering med disse små molekyler, er endoderm og mesoderm specifikation blokeret, accelererende neuronal differentiering og fører til dannelsen af ​​synlige neurale rosetter inden for en uge plating. Neural mønsterdannelse forekommer tidligt i denne proces, formodentlig i løbet af neural roset-dannelse og umiddelbart derefter. I mangel af andre signaler, disse primitive neurale celler antager en forreste forhjerne-lignende skæbne 13. Umiddelbart efter neurale roset formation, og løbende i hele NPC ekspansion, forhjernen NPC'ere dyrkes med FGF2 8,14. De har dobbelt afstamning potentiale og kan differentieres til neurale populationer af 70-80% III-tubulin-positive neuroner og 20-30% glial fibrillært surt protein (GFAP) -positive astrocytter (figur 1). Størstedelen af ​​forhjernen hiPSC neuroner VGLUT1-positiveOg er således formentlig glutamaterge, selvom ca. 30% af neuroner er GAD67-positive (GABAergic) 8.

NPC rutinemæssigt passeret mere end ti gange in vitro, samtidig med at konsistente differentiering profiler og uden akkumulering karyotype abnormiteter. Grupper har rapporteret overførselsteknikker NPC'ere mere end 40 gange 15 dog finder vi, at ud over ti passager, viser NPC'ere øget tilbøjelighed til astrocyt differentiering. NPC'ere godt tåle flere fryse-tøs op og kan skiftet til vokse som neurosfærer ved blot at dyrke i ikke-klæbende plader. NPC effektivt transduceres af virale vektorer, der muliggør hurtig evaluering af de molekylære og cellulære konsekvenser af genetisk forstyrrelse, og let kan udvides til opnåelse tilstrækkeligt materiale til biokemiske undersøgelser. Endvidere, fordi virale vektorer tillader robust over-ekspression og / eller knockdown af sygdomstilstande relevante gener, enten kontrol eller patient afledt NEURAL-celler, kan man anvende denne platform til at teste virkningen af ​​genetisk baggrund på disse manipulationer. Selv om det ikke er egnet til synaptisk eller aktivitet assays kræver modne neuroner, kan NPC'ere være et praktisk alternativ for mange enkle molekylære eller biokemiske analyser af patient-afledte neurale celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC Differentiering til neurale progenitorceller

  1. Vokse og udvide hiPSCs i humane embryonale stamceller (HES) medier (tabel 1) co-dyrket på en mus embryonale fibroblast (MEF) fødelag indtil store (men subkonfluente) kolonier er klar til neural differentiering via en embryoid krop (EB) mellemliggende (figur 2). Rutinemæssige hiPSC dyrkningsbetingelser er godt beskrevet andetsteds 16,17; kort, vokser hiPSCs i HES medier på en MEF fødelag indtil sammenflydende, derefter enzymatisk passage med collagenase (1 mg / ml i DMEM) og udvide ca. 1: 3 hver 7 dage.
  2. For at fremstille poly-L-ornithin / laminin coatede plader, coat plader med 10 g / ml poly-L-ornithin i sterilt vand til plastoverflader (50 g / ml for glasoverflader) og inkuberes ved stuetemperatur i 3-24 timer. Vask mindst en gang med sterilt vand og smøre med 5 g / ml Laminin i sterilt PBS ved stuetemperatur i 3-24 timer.
    BEMÆRK: Hvis indpakket i plastik, kan plader væreopbevares i op til seks måneder ved -20 ºC.
  3. På dag 1, løft enzymatisk subkonfluente hiPSCs (almindeligvis dyrket på MEF'er eller hiPSCs dyrket i definerede medier såsom TeSR 18 på Matrigel) fra pladen som store kolonier ved hjælp af 1 mg / ml collagenase IV i DMEM / F12.
    BEMÆRK: Efter 1-2 timers inkubation ved 37 ºC, vil kolonier at svæve i skålen.
  4. Vask forsigtigt hiPSC kolonier (ved aflejring ikke centrifugering) 1-2x med DMEM / F12, resuspender i 2 ml / brønd af N2 / B27 medium (tabel 1) og overføres til ikke-klæbende 6-brønds skåle (kombinere 3-brønde i 1 brønds) 19.
    BEMÆRK: Overnight vil kolonier danne flydende sfæriske klynger betegnes "embryoide organer" (EbS). Forvent betydelig celledød.
  5. På dag 2, tilt plader og lad EB'er at sætte sig. Fjern forsigtigt medier og vask en gang med DMEM / F12 for at fjerne debris. Foder med N2 / B27 medier suppleret med dobbelt Smad hæmmere (0,1 M LDN193189 og 10M SB431542) 12
  6. På Days 3-7, vil neuralization forekommer i forbindelse med dobbelt SMAD hæmning; kontrollere, at EBS er runde, men ikke cystisk. Feed EB'er hver anden dag med N2 / B27 medier suppleret med 0,1 M LDN193189 og 10M SB431542.
  7. På dage 7-14, efter plating i EBS til poly-L-ornithin / Laminin coatede plader, tjek at bruge en brightfield mikroskop at neurale rosetter begynder at dukke inden for få dage (karakteriseret som runde klynger af neuroepitelceller med apico-basal polaritet; figur 1). Fortsæt med at fodre adhærente EB'er hver anden dag med N2 / B27 medium suppleret med 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 og 1 g / ml laminin.

2. Høst af Neural rosetter

BEMÆRK: Vi anbefaler, at neurale rosetter enzymatisk høstet ved hjælp Neural Rosette selektionsreagens 20 eller lignende valg reagens. Selvom neurale rosetter kan manuelt opsamlet i 6-brønds poly-L-ornithin / Laminin coated plade, this metode tager omfattende uddannelse at mestre, og, afhængig af brugerens dygtighed, kan kræve en anden runde af plukke på dag 20 for yderligere at berige for NPC'ere og nedbryder ikke-neurale celletyper.

  1. For enzymatisk udvalg af neurale rosetter på dag 14, Aspirer medier fra adhærerede EB'er og tilsættes 1 ml neural roset selektionsreagens per godt for en 6-brønds plade. Der inkuberes ved 37 * C i 1 time.
  2. Med en P1000 Pipetman, forsigtigt fjerne enzym fra hver brønd. Tilsæt 1 ml af DMEM / F12 per brønd at vaske.
  3. Med en P1000, indsamle 1 ml DMEM / F12 og hurtigt udvise DMEM / F12 tilbage i brønden, hvorved afmontering af rosetter fra pladen. Saml rosetter i et Falcon-rør.
  4. Pipetter anden 1 ml DMEM / F12 og hurtigt udvise i den samme brønd til at frigøre de resterende rosetter. (Må ikke udriv. Prøv ikke at bryde op roset aggregater). Saml de neurale rosetter i samme falk rør.
  5. Gentag trin 2.4 som nødvendigt. Hvis rosetter ikke løsrive let, tilsæt more enzym og gentag processen (trin 2,1-2,4)
  6. Spin celler ved 300 xg i 3 min. Aspirer vask, og re-suspendere rosetter i 2 ml NPC medier (tabel 1). Overfør celler (1: 1) i en poly-L-ornithin / Laminin coated 6-brønds plade.
  7. Fra dage 15-21, vil de neurale rosetter udvide; foder rosetter hver anden dag med NPC medier.
  8. Evaluere kvaliteten af ​​de neurale rosetter og sikre, at flade fibroblastlignende celler ikke ekspanderer i kulturen.
    BEMÆRK: Hvis ikke-rosetter fortsætter, kan NPC kultur undertiden reddes ved manuel plukning, kun at vælge de bedste af de plukkede rosetter i Accutase. Dissociér 15 minutter ved 37 ºC. Pellet, vaske og pladen i NPC medier på 24-brønds poly-L-ornithin / Laminin coated plade.

3. Udvidelse af neurale progenitorceller

BEMÆRK: hiPSC NPC'ere kan dyrkes på enten Matrigel- eller poly-L-ornithin / laminin-overtrukne plader. Vi bruger typisk MatrigeL-plader som de kan fremstilles hurtigere og med lavere omkostninger.

  1. Til fremstilling Matrigel coatede plader hurtigt optø og resuspender en 1 mg frosset portion af Matrigel på 24 ml kold DMEM / F12 og straks distribuere 2 ml til hver brønd af to seks-brønds plader. Der inkuberes i mindst 1 time ved 37 * C.
    BEMÆRK: Matrigel skal kun aspireret, vasket, umiddelbart før brug.
  2. Feed NPC hver anden dag og holdes ved meget høj tæthed, eller de vil spontant differentiere til neuroner.
    BEMÆRK: Selvom mere etablerede NPC er typisk opdelt 1: 4 hver uge, kan meget lave passage NPC deles 1: 2 så sjældent som en gang hver anden uge.
  3. For at opdele, første aspiratprøver medier og tilsæt 1 ml varm Accutase (1x) per brønd af 6-brønds plade. Der inkuberes ved 37 ºC i 10-15 min.
  4. Overføre forsigtigt løsnede celler i et 15 ml rør indeholdende DMEM / F12 med så lidt mekanisk belastning som muligt. Må ikke titrere celler, mens i enzym. Pellet celler ved Spinning ved 1000 xg i 5 min.
  5. Aspirer vask, og re-suspendere NPC'ere i ~ 1 ml NPC medier pr original godt af 6-godt.
    BEMÆRK: forvente, at en sammenflydende brønd i en 6-brønds skål har 5-10 mio celler; dette kan bekræftes ved at tælle en 10L prøve af celler under anvendelse af en hematocytometer inden re-plating.
  6. Efter resuspension, re-plade NPC'ere som NPCs, neuroner eller neurosfærer. For at opretholde NPC, plade ca. 1-2 millioner celler pr brønd i en 6-brønds plade. Effektiviteten af ​​neurosfære dannelse kan variere mellem forsøg og cellelinier, men generelt sker bedst, hvis mellem 200.000 og 1.000.000 celler podes pr brønd af en ikke-klæbende plade med 6 brønde; hvis sammenklumpning af neurosfærerne opstår, at reducere antallet af celler podet. At differentiere til neuroner, plade ca. 200.000 celler pr brønd i en 6-brønds plade, der erstatter NPC medier med Neuron medier.
  7. Immunhistokemisk validere hver etableret NPC linje. Når tilstrækkelig cellemateriale er blevet expanded, label NPC'ere med antistoffer til nestin og SOX2. Valideret NPC linjer bør også differentieres til neuroner i 4-6 uger, og mærket med antistoffer for III-tubulin og MAP2AB.
    1. Fix celler i 4% paraformaldehyd i PBS ved 4 ° C i 10 min. Permeabilisere NPC ved stuetemperatur i 15 minutter i 1,0% Triton i PBS, og derefter blokeret 5% donkey serum med 0,1% Triton ved stuetemperatur i 30 min.
    2. Inkuber med primært antistof i 5% donkey serum med 0,1% Triton, natten over ved 4C.
      BEMÆRK: Vi anbefaler følgende antistoffer: gede anti-Sox2, 1: 200; muse-anti-humant Nestin, 1: 200; kanin-anti-βIII-tubulin 1: 500; muse-anti-βIII-tubulin 1: 500; muse-anti-MAP2AB, 1: 200. (Figur 2).
    3. Efter en vask med PBS, inkuberes sekundære antistoffer celler med passende konjugeret sekundært antistof til ged, mus eller kanin ved 1: 300 i i 5% donkey serum med 0,1% Triton i 1-2 timer ved stuetemperatur. For at visualisere kerner, bejdse celler med 0,5 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) og derefter montere med Vectashield.

4. NPC Transduktion

  1. Brug spinfection (centrifugering af cellekultur plader i nærværelse af virus ved 1.000 xg i 1 time) for at øge andelen af transficerede celler 21. Aspirer medier og erstatte med den relevante overekspression (eller kontrol) lentivirus (eller retrovirus), titrerede til den ønskede infektionsmultiplicitet (MOI) (typisk 1-10) fortyndet i NPC medier. Brug 1,5 ml volumen pr brønd af en 6-brønds plade (eller en passende skaleret volumen for andre typer af vævskulturplader). Spin på 1.000 xg og 37 ºC i 1 time i en plade centrifuge.
    BEMÆRK: Ideelt set transducere NPC'ere med lentiviral eller retrovirusvektorer indenfor 1-2 dage efter opdelingen. Uanset om brug af kommercielle eller laboratorie-fremstillet virus, kan det være nyttigt at passende titrere partier af virus på forhånd af seriel fortynding. (Figur 3).
  2. For at reducere cellastet, død, erstatter medier inden 8 timer af spinfection.
    BEMÆRK: Viral integration og transgenekspression skal være påviselig inden 24 timer ved reportergen fluorescens. (Hvis virus mangler en fluorescerende reporter, det er mere vanskeligt at vurdere, vellykket transfektion kan bedst valideres ved immunoblot, immunhistokemi eller qPCR for overekspression produkter.) Fuldt udtryk kan tage 3-7 dage; gentagne spinfections med ekstra virus kan være nødvendigt at øge andelen af ​​transficerede celler. Tilbagevendende spinfections kan forekomme dagligt, men behøver ikke at være så hyppige. Ideelt, hvis du bruger en fluorescerende reporter,> 80% af cellerne må mærkes.

5. neurosfære Migration Assay

BEMÆRK: Neurosfærer dannes spontant efter enzymatisk dissociering af NPC (ved en måde identisk med den, der anvendes i NPC ekspansion - trin 3,3-3,6), hvis cellerne dyrkes i suspension i NPC medier.

  1. Kort fortalt, vokser dissociered NPC'ere i NPC medier i 48 timer i ikke-adhærerende plader for at generere neurosfærer. (Figur 4).
  2. For neurosfære migration, forberede friske Matrigel plader ved hjælp af kolde NPC medier, snarere end DMEM i en 96-brønds plade, 1-2 timer før neurosfære plukning. Må ikke aspireres Matrigel fra brøndene.
  3. Som oprindeligt udgivet for embryonale stamceller-afledte neurosfærer 22, manuelt vælge NPC-afledte neurosfærer under et mikroskop, efter vask en gang i NPC medier for at fjerne cellerester. Overfør en neurosfære til hver brønd i en Matrigel-coatede 96-brønds plade.
  4. Tilføj yderligere 0,5 mg Matrigel, fortyndet i koldt NPC medier, neurosfærerne i hver 96-brønds plade.
  5. Manuelt centrum enkelte neurosfære i midten af ​​brønden ved hjælp af en pipettespids.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at plukke neurosfærer af samme størrelse, for at reducere variation i resultaterne.
  6. Tillad migration at forekomme i 48 timer og derefter reparere celler wed 4% paraformaldehyd og plet med ønskede immunhistokemiske markører.
  7. Hvis radial migration skal bestemmes, foto neurosfærer i deres helt ved hjælp af en 4x mikroskop mål. Udelukke enhver neurosfærer kontakt kanten af ​​brønden eller en anden neurosfære fra analysen.
    BEMÆRK: Hvis der opstår migration i længere tid end 48 timer, vil den resulterende radiale migration sandsynligvis være for stor til billedet ved hjælp en 4x mål.
  8. Mål gennemsnitlige migration fra hver neurosfære hjælp NIH ImageJ software (figur 5). Dette kan gøres enten ved hjælp af de analysemetoder, der er beskrevet nedenfor:
    1. Radial migration:
      1. Manuelt spore kant længst migrerende celler under anvendelse af frihånd markeringsværktøjet derefter bruge Measure (Ctrl + M) til at beregne arealet af den resulterende form. Før måling af området sørge for, at området er markeret i sættet Målinger vinduet under fanen Analyser. Brugværdien af måling området og ligningen for arealet af en cirkel (A = πr 2) for at bestemme radius (ydre).
      2. Trace kanten af ​​den oprindelige neurosfære, måle området og beregne radius (indre) på samme måde. Beregn den samlede radiale migration som forskellen mellem det ydre og indre radier.
    2. Største cellulære migration:
      1. Mål afstanden flyttet af de fem længst celler fra kanten af ​​den indre neurosfære hjælp af lineære markeringsværktøj efterfulgt af Measure (Ctrl + M) funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neurale rosetter kan identificeres morfologisk ved hjælp af en brightfield mikroskop, ved deres karakteristiske udseende som runde klynger af neuroepitelceller med apico-basal polaritet (figur 1). Selvom NPC er typisk dyrket ved meget høj celledensitet, umiddelbart efter passage, let pyramideformet-formet soma og neurit bipolar struktur er synlig (figur 1D). Validerede NPCs udtrykke nestin og SOX2 i de fleste celler, men III-tubulin farvning er også synlig i alle NPC populationer, hvilket indikerer, at nogle del af NPC konstant indlede neuronal differentiering i kultur (figur 1F). Markører af neurale stamceller, såsom SOX2 og Pax6 og forhjerne neuronale stamceller, såsom TBR2 er også udtrykt i NPC, mens midthjernen markører, såsom LMX1A og FOXA2 ikke (figur 1G-I). En væsentlig del af de store og flade fibroblastlignende celler i en NPC population viser, at der er blevet genereret af dårlig kvalitet NPC, som sandsynligvis ikke vil give et stort antal neuroner efter neuronal differentiering (figur 2).

Efter en vellykket transduktion med en høj titer lentiviral eller retroviral vektor, bør mere end 80% af cellerne mærkes med fluorescerende reporter indbefattet i vektoren (figur 3). Neurosfære generation bør give en population af neurosfærer relativt homogen størrelse (figur 4), som, med regelmæssig fodring, kan forblive sunde i kultur i cirka en uge. Neurosfæren migration forekommer robust raske neurosfærer (figur 5), og hiPSC NPC undergå hurtig differentiering i løbet af en neurosfære migration assay 1.

Figur 1

telt "> Figur 1. patientspecifikke hiPSCs, NPC'ere og neuroner. brightfield billeder af hiPSC neural differentiering, fra hiPSCs (A), til embryoide organer (B), neurale rosetter (C), NPC'ere (D) og neuroner (E) ... 100x, skala bar 100 um FI hiPSC NPC er positive for en række forhjerne neural stamcelle og neural progenitorcelle markering, herunder NPC markør nestin (grøn) og det neuronale markør III-tubulin (rød) (F); den neurale transkription stamcelle faktorer SOX2 (grøn) og Pax6 (rød) (G) og forhjernen progenitor markør TBR2 (rød) (H), men ikke midthjernen markører LMX1A (grøn) og FOXA2 (rød) (I). DAPI-farvede kerner (blå). 100x, Målestokken 100 um. J. NPC'ere kan differentiere til 70-80% III-tubulin-positive neuroner (grøn) og 20-30% glial fibrillært surt protein (GFAP) -positive astrocytter (rød). 200x, skala bar 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2

Figur 2. validering NPC Lines. Høj kvalitet (øverst til venstre) hiPSC NPC'ere Express nestin (rød) og SOX2 (grøn). i de fleste celler (kerner farvet med DAPI (blå)), mens lav kvalitet (nederst til venstre) NPC har pletter af SOX2-negative og nestin-negative celler (højre). 4 uger gamle neuroner differentieret fra kvalitet NPC'ere høj udtrykker MAP2AB (grøn) og III-tubulin (rød) (øverst til højre), men dem differentieret fra lav kvalitet NPC'ere ikke (nederst til højre). 100x, skala bar 100 um. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 3

Figur 3. Viral transduktion af NPC'ere. Lysfelt (øverst) og GFP fluorescerende (nederst) billeder af hiPSC NPC'ere før (til venstre) og efter viral spinfection. 100x, skala bar 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4

Figur 4. neurosfære Formation. Brightfield billeder af vedhængende NPC'ere (venstre) og nydannede neurosfærer (til højre). 100x, skala bar 100 um. Klik her for at se et larGER version af denne figur.

Figur 5

Figur 5. neurosfære Migration. AB. Brightfield billeder af neurosfærer før (A) og efter (B) 48 timer for migration i Matrigel. 100x, skala bar 100 um. CG. Screen capture billeder demonstrerer analysemetoden for radial neurale migration ved hjælp NIH ImageJ software. Klik på "frihånd valg 'på ImageJ værktøjslinje (C). Trace kanten af længst migreret celler omkring neurosfærerne (D). Sørg for, at området er markeret i sættet Målinger vinduet (E). Brug Mål funktion (Ctrl + M) (F). Trace kanten af de oprindelige neurosfærer (G) og bruge Measure funktion (Ctrl + M). Målinger kan derefter eksporteres til Excel til analyse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Medier Komponenter
HES medier DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Serum Replacement (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-mercaptoethanol (55MM 1000x) (Life Technologies # 21985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13256-029)
N2 / B27 medier DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
NPC medier DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml Natural Mouse Laminin (Life Technologies # 23017-015)
Neuron medier DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
1 mg / ml Natural Mouse laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 ug / ml dibutyryl cyklisk-AMP (Sigma # D0627)
200 nM L-ascorbinsyre (Sigma # A0278)

Tabel 1. Media opskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet metoder, som at differentiere hiPSCs til NPC'ere, en neural celletype, hvor en betydelig del af genet underskrift hiPSC-afledte neuroner er bevaret, og som kan fungere som en målestok for de udviklingsmæssige veje potentielt bidrager til sygdommen patogenese 8, 11. Derudover som vi har beskrevet, NPC'ere er en robust replikativ og nemt transducerede neurale befolkning, som vi mener kan være egnet til molekylære og biokemiske studier af sygdom disposition.

Selvom vi har detaljerede metoder til at differentiere og kultur forhjernen-mønstrede NPC'ere, kan de let tilpasses til at generere NPC'ere mønstrede til andre celle skæbner. For eksempel, hvis flydende EB'er først behandles med 0,5 mg / ml DKK1, 10 mM SB431542, 0,5 mg / ml Noggin og 1 mM cyclopamin vil hippocampus NPC'ere blive genereret som kan udvides i NPC medier og differentieret i neuronale medier suppleret med 20 ng / ml Wnt3a 7 12,23. I betragtning af at de fleste subtype specifikke neuronal differentiering protokoller fortsætte via en NESTIN- og SOX2-positve mellemprodukt, forudser vi, at lignende metoder kan være passende til GABAergic- 2,24 og glutamatergic- 3,25,26 specifikke NPC populationer.

Der er flere kritiske trin i protokollen værd at bemærke. Først, hvis over-ekspression eller vælte endogen genekspression, er det bedst at bruge en kontrol vektor, der udtrykker et fluorescerende protein fra den samme viral backbone, som vi har observeret væsentlige forskelle i fluorescens, når reportere udtrykt fra vektorer af variable størrelser (på grund nedsat emballage effektivitetmed vektor størrelse) eller med forskellen promotorer (på grund af forskelle i promotor effektivitet). For det andet anbefaler vi færdiggøre viral transduktion før neurosfære dannelse, som vi har observeret dårlig penetrans af virale vektorer i den tætte neurosfære struktur. Det tredje, som passagen antal NPC'erne stiger uden passage ti vi ofte observere væsentligt forringet migration i neurosfæren assay. Faktisk får tilbøjelighed NPC til opnåelse af en større procentdel af astrocytter med passage, er det afgørende at matche passage af NPC linier i hvert eksperiment.

Endelig er det vigtigt at overveje de biologiske og tekniske begrænsninger i de beskrevne teknikker. Selvom NPC'ere synes at være morfologisk lignende med det blotte øje, er de en heterogen population består af celler i stand til at generere både glutamaterge og GABAerge neuroner. Mens vi observere bemærkelsesværdigt konsekvent forhjernen mønster af NPC linjer mellem enkeltpersoner ved hjælp af denne method 1, det er kun, når man sammenligner fuldt validerede høj kvalitet NPC linjer - der er væsentlige forskelle mellem gode og dårlige kvalitet NPC linjer. Derudover virustransduktion udbytter genetisk heterogene celler, hver med en integration af den virale vektor en unik genomisk placering; derfor vil de enkelte celler varierer både i placering og antal af genomiske integration sites. Mere ensartede ændringer i genekspression vil altid ske, når genetisk manipulation er målrettet til en præcis og defineret sted, uanset om det sker ved zink finger, talen eller CRISPR-baserede strategier.

Patient hiPSC afledt NPC kan anvendes til at undersøge både den globale genekspression forstyrrelser forekommer i neurologiske sygdomme og også de molekylære og / eller cellulære virkninger manipulere kandidatgener eller microRNA i forbindelse med enten raske eller syge patient-afledte nerveceller. På denne måde konsekvenserne af at manipulere en eller flere nøglerisiko allel (er) kan karakteriseres i forbindelse med forskellige genetiske baggrunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics