عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الجلد البشري لديه وظيفة حاجز الهامة ويحتوي على العديد من الخلايا المناعية التي تساهم في توازن الأنسجة والحماية من مسببات الأمراض. وبما أن الجلد هو سهل نسبيا للوصول إلى ذلك، فإنه يوفر منصة مثالية لدراسة الآليات التنظيمية المناعة الطرفية. خلايا مناعية المقيمين في صحي سلوك الجلد الترصد المناعي، ولكن أيضا تلعب دورا هاما في تطوير الأمراض الجلدية الالتهابية، مثل مرض الصدفية. وعلى الرغم من الأفكار الناشئة، فهمنا للبيولوجيا الكامنة وراء العديد من الأمراض التهابات الجلد لا تزال محدودة. هناك حاجة لنوعية جيدة السكان (واحد) خلية معزولة من عينات الجلد تحتاج فحص. وحتى الآن، إجراءات العزل قد يعرقل بشكل خطير بسبب عدم الحصول على عدد كاف من خلايا قابلة للحياة. كما تأثرت العزلة وتحليلها لاحقا من قبل ضياع معالم خلية نسب المناعة، ويرجع ذلك إلى إجهاد ميكانيكي والكيميائية الناجمة عن إجراءات التفكك الحالية للحصول علىتعليق خلية واحدة. هنا، نحن تصف طريقة تعديلها لعزل الخلايا التائية من كلا صحي وتشارك جلد الإنسان الصدفي عن طريق الجمع بين الميكانيكية التفكك الجلد باستخدام dissociator النسيج الآلي والعلاج كولاجيناز. هذه المنهجية يحافظ على التعبير عن معظم علامات النسب المناعة مثل CD4، CD8، Foxp3 وCD11c وعلى إعداد تعليق خلية واحدة. وترد أمثلة ناجحة عزل خلايا CD4 + T والمظهرية لاحق والتحليل الوظيفي.

Introduction

الجلد، مثل الواجهة الأساسية بين الجسم والبيئة، ويوفر خط الدفاع الأول ضد المادية الخارجية والكيميائية والبيولوجية الشتائم مثل جرح والأشعة فوق البنفسجية والكائنات الحية الدقيقة. يتألف الجلد قسمين رئيسيين، البشرة والأدمة، ويحتوي على مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك خلايا لانغرهانس، الضامة، والخلايا الجذعية (DCS)، وحوالي 20 مليار خلية التائية الذاكرة، ما يقرب من ضعف العدد الحالي في حجم الدم كله 1 ، 2. وهناك مجموعة متزايدة من البيانات يدعم الفكرة القائلة بأن الجلد لديه وظائف مناعية أساسية، سواء خلال توازن الأنسجة وفي مختلف الحالات المرضية. ويعتقد أن الخلايا المناعية المقيمين في الجلد الطبيعي لإجراء الترصد المناعي (3) ولقد ثبت أنها تلعب دورا في تطور الاضطرابات الالتهابية مثل الصدفية 4. في جلد الآفات الصدفي، تسلل على حد سواء CD4 + و CD8 + وكانت خلايا تي التوليدerved وتبين أن نسبة CD4 و CD8 يختلف باختلاف الحالة المرضية 5. ومع ذلك، هؤلاء السكان من خلايا يصعب دراسة لتقنيات الحالية تسمح للعزل الخلايا قليلة فقط.

التقنيات المستخدمة حاليا على نطاق واسع لتي زنزانة انفرادية من الجلد البشري الجمع الميكانيكي تفكك الجلد مع العلاج الأنزيمية. ومفروم خزعات الجلد البشري على نطاق واسع وحضنت مع الانزيمات مثل التربسين، كولاجيناز و / أو EDTA 6-8. وبالنظر إلى أن الجلد هو الأنسجة الحاجز الذي هو مقاومة عالية للقوات الشد وتفصيل الميكانيكية، والأساليب المتبعة في تي العزلة خلية تنتج عدد قليل جدا من الخلايا، وحتى انخفاض أعداد خلايا قابلة للحياة، الأمر الذي يجعل فيفو السابقين الثقافة خلية من هؤلاء السكان خلية صعبة و التحدي.

هنا، ونحن التقرير طريقة تعديلها لعزل الخلايا الليمفاوية من كلا صحي وتشارك جلد الإنسان الصدفي عن طريق الجمع بين ميكانالتفكك كال من الجلد باستخدام dissociator النسيج الآلي بدلا من الأسلوب المعمول بها تنميق على نطاق واسع، جنبا إلى جنب مع عملية الهضم الأنزيمي تستخدم كولاجيناز. وقد لوحظت مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية قابلة للحياة بما في ذلك البلدان النامية وخلايا T بعد إعداد تعليق وحيد الخلية. أهمية التعبير عن علامات سطح CD3، CD4 و CD8 والحفاظ عليها جيدا. خلايا أعدت وبالتالي، نحن على استعداد لاستخدامها في السابق مزارع الخلايا الحية أو تحليل تدفق cytometric. واستخدمت هذا البروتوكول بنجاح لتحليل خزعات الجلد واحدة (4 مم) المستمدة من جلد الآفات من مرضى الصدفية. وأظهرت النتائج أن الجلد المقيمين خلايا المريض تي تنتج السيتوكينات الالتهابية أكثر مثل IL-17 و IFNγ بالمقارنة مع المتطوعين الأصحاء 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على خزعات الجلد من أشخاص أصحاء من بقايا الجلد في منطقة البطن من الأفراد يخضعون لجراحة التجميل الانتخابية بعد موافقة شفهية أو مكتوبة علم للاستخدام العلمي. وتمت الموافقة على استخدام جلد الإنسان وفقا للأنظمة من قبل اللجان الطبية الأخلاقية المحددة للبحوث البشري من المركز الطبي في جامعة رادبود، نيميغن، وهولندا، وجامعة إيسن، ألمانيا.

1. إعداد تعليق خلية واحدة من الجلد البشري (العمل العقيمة في تدفق مجلس الوزراء إذا خلية ثقافة اللاحقة هو مطلوب)

  1. إعداد خلية ثقافة المتوسط: وأضاف RPMI 1640 + البنسلين / الستربتومايسين (تركيزات النهائي 100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل على التوالي) + البيروفات (0.02 ملم) وglutamax (0.02 ملم)، مع عدم وجود مصل.
  2. إعداد مستنبت الكامل: مستنبت أعدت في الخطوة 1.1 + 10٪ البشرية تجميع المصل (HPS)؛ تخزين عند 4 درجات مئوية. جلب المتوسط ​​إلى 20 درجة مئوية ± 2 قبل لناجي.
  3. الحصول على خزعة الجلد باستخدام 4mm جولة أداة خزعة لكمة وابقائه في RPMI1640 مستنبت الكامل عند 20 درجة مئوية ± 2 لمدة تصل إلى 4 ساعات أو عند 4 درجات مئوية ON. معالجة خزعة في أقرب وقت ممكن عند وصولهم في المختبر.
    ملاحظة: أطول تخزين الجلد تؤثر على العائد الخلية وبقاء الخلية.
  4. تسمية أنبوب تفارق توج الأزرق وإضافة 5 مل مستنبت الكامل في أنبوب المسمى.
  5. إضافة 2 مل من مستنبت الكامل في كل بئر (من مجموع 3 آبار) من المعقمة لوحة الثقافة 6 جيدا. استخدام أدوات معقمة لوضع خزعة في بئر واحدة، شطف، وتحريكه لأكثر من البئر الثانية وكرر هذه الخطوة واحدة لمزيد من الوقت، وبالتالي تحقيق ما مجموعه ثلاثة يشطف.
  6. نقل خزعة الجلد تشطف جيدا إلى طبق بتري معقمة، إضافة 100 ميكرولتر من مستنبت كامل على الجزء العلوي من خزعة، وكشط قبالة بعناية النسيج الدهني تحت الجلد باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ المتاح مشرط معقم.
    ملاحظة: تهو هو خطوة حاسمة.
  7. قطع كل خزعة الجلد إلى 4 قطع صغيرة على طبق بتري معقمة. بنقل العينات (ما يصل إلى أربعة من 4 الخزعات ملم في أنبوب) إلى أنبوب تفارق استعداد تحتوي على 5 مل من مستنبت كاملة.
  8. بإحكام إغلاق أنابيب مع غطاء، وإرفاق رأسا على عقب لكم من dissociator النسيج الآلي. تأكد من أن جميع المواد عينة يقع في منطقة الدوار.
  9. بدء عملية التفكك عن طريق تشغيل "_01 m_spleen برنامج" (برنامج محدد مسبقا المقدمة من الذاكرة الداخلية الصك أو عن طريق بطاقة برنامج رافق) لفصل خزعة في سرعة الدوران المناسبة لمدة 56 ثانية.
  10. بعد المعالجة، فصل أنبوب تفارق من dissociator والتأكد من أن جميع المواد فصلها يتم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب.
  11. إضافة 150 ميكرولتر كولاجيناز IA (80 ملغ / مل) في أنبوب التفكك واحتضان العينة في حمام ماء اهتزاز في 37° مئوية لمدة 60 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من الدناز الأول (5 MU / مل) في أنبوب thedissociation، وتخلط جيدا.
    ملاحظة: التركيز العالي للكولاجيناز أو أطول فترة حضانة ستغير بقاء الخلية.
  12. نعلق أنبوب التفكك إلى كم من dissociator النسيج الآلي وتشغيل "M_ برنامج الطحال _01" لفصل خزعة واحدة لمزيد من الوقت.
  13. وضع 70 ميكرومتر الخلية النايلون مصفاة على الجزء العلوي من أنبوب فالكون 50 مل. تطبيق المواد عينة نأت إلى هذا مصفاة خلية لإزالة كتل خلية / الحطام الأنسجة.
  14. غسل مصفاة الخلية مرة واحدة مع 5 مل من مستنبت كاملة. الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 10 دقيقة، وطاف نضح.
  15. كرر الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت. الكريات الخلايا resuspend في 300 ميكرولتر من مستنبت كاملة. وحيدة الخلية تعليق على استعداد لمزيد من التحليل. تواصل مع بروتوكولات لالسابقين زراعة الخلايا الحية أو التدفق الخلوي التحليل.
  16. في حالة حدوث مزيد من طntracellular خلوى تلطيخ، وتحفيز الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية (12.5 نانوغرام / مل)، Ionomycin (500 نانوغرام / مل)، وBrefeldine ألف (5 ميكروغرام / مل) لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 4 ساعة قبل تنفيذ تدفق تحليل الخلوي.

2. بولكلونل تنشيط الخلايا T-الجلد المقيم (فيفو السابقين الثقافة الخلية)

  1. قسامة 100 ميكرولتر وحيدة الخلية تعليق (المعد في الخطوة 1.15) في لوحة الجولة القاع 96-جيدا.
    ملاحظة: للحصول على كل 4 ملم خزعة الجلد، وحيدة الخلية تعليق المكتسبة ويمكن تقسيمها إلى اثنين على الأقل من الآبار لوحة 96-جيدا.
  2. إضافة مكافحة CD3 / مكافحة CD28 ميكروبيدات المغلفة ماب (25000 الخرز لكل بئر)، المؤتلف خلوى البشري ريلاينس اندستريز-2 (تركيز النهائي 25 U / مل)، وريلاينس اندستريز-1β (النهائي تركيز 50 نانوغرام / مل).
  3. تغطية لوحة الثقافة مع غطاء لوحة المسمى جيدا، واحتضان في 5٪ CO 100٪ الرطوبة، 37 ° مئوية الحاضنة. تغيير المتوسطة عندما يتحول اللون متوسطة إلى الأصفر.

3. تحليل التدفق الخلوي الابتدائي / مثقف خلايا الجلد مقيم T

  1. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة: برنامج تلفزيوني + 0.2٪ BSA.
  2. نقل خلايا الفائدة إلى لوحة 96-جيدا ضد القاع. الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  3. Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  4. خلايا وصمة عار مع 100 ميكرولتر من eFluorescence780 استعداد مترافق صبغ الجدوى قابل للتثبيت (1: 1000 تخفيف باستخدام برنامج تلفزيوني) في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  5. اختر المطلوبة سطح الخلية MABS علامة، على سبيل المثال: CD45-BV421 (HI30، 01:20)، CD3-تنمية الطفولة المبكرة (UCHT1، 01:50)، CD4-PC5.5 (1388.2، 1: 200)، CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11، 1: 400)، CD14-FITC (TUK4، 01:50)، CD19-APC-AlexFluo750 (13-119، 1:50)، CD56-PE (MEM-188، 01:50)، CD25-PeCy7 (BC96، 01:50)، CD11c و-PeCy7 (BU15، 01:10)، وCD1c-APC (AD5-8E7، 01:10)، وإعداد خليط MABS باستخدام FACS العازلة وفقا لكل عامل التخفيف ماب اختبارها. تحديد إعدادات بوابة باستخدام isotype السيطرة من الأجسام المضادة مع عينة غير وصمة عار.
  6. إضافة 25 ميكرولتر من استعداد MABS-الخليط في كل بئر. احتضان 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية ± 2، بعيدا عن الضوء.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  8. للعينات التي لا تتطلب سوى خلية تلطيخ السطح، تابع الخطوة 3.16.
  9. في حالة تلطيخ Foxp3 داخل الخلوي:
    1. إعداد وتثبيت العازلة permeabilization عن طريق خلط جزء واحد من التركيز مع 3 أجزاء من منظفة.
    2. إعداد العازلة permeabilization 1X: 1 جزء من 10X permeabilization عازلة + 9 أجزاء من H 2 O. تعقيم
  10. الكريات Resuspend في 100 ميكرولتر من تثبيت وpermeabiliعازلة اإلثيوبية، وتخلط جيدا، واحتضان عند 4 ° مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. إضافة 100 العازلة permeabilization ميكرولتر إلى كل بئر، الطرد المركزي في 450 x ج في RT لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  12. غسل الخلايا مع العازلة permeabilization احد مزيد من الوقت.
  13. اختر المطلوبة MABS داخل الخلايا، على سبيل المثال، Foxp3-eFluo450 (PCH101، 01:50)، IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1، 01:50) وIFNγ-PeCy7 (4S.B3، 1: 400). تحضير خليط MABS باستخدام العازلة permeabilization تحتوي على 2٪ الفئران العادية المصل وفقا لكل عامل ماب تخفيف اختبارها. تحديد إعدادات بوابة باستخدام isotype السيطرة من الأجسام المضادة مع عينة غير وصمة عار.
  14. إضافة 20 ميكرولتر من استعداد ماب-الخليط في كل بئر. احتضان عند 4 ° مئوية لمدة 30 دقيقة، بعيدا عن الضوء.
  15. بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization في كل بئر. الطرد المركزي عند 20 درجة مئوية ± 2، 450 x ج لمدة 2 دقيقة، وطاف نضح.
  16. غسل الخلايا مع العازله permeabilizationص واحد مزيد من الوقت. بيليه resuspend في 110 ميكرولتر من FACS العازلة، وتعليق خلية نقل في أنبوب microFACS.
    ملاحظة: نموذج جاهز للقياس باستخدام 10 ألوان قياس التدفق الخلوي.
  17. في حالة عدد الخلايا المحدد المطلوبة، إضافة 10 ميكرولتر من تعليق موحد مختلطة جيدا fluorospheres في كل عينة على الفور قبل تنفيذ القياسات باستخدام التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فإن بروتوكول المعروضة هنا تسفر بين 2200 ± 615 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، والجلد من المتطوعين الأصحاء) ما يصل إلى 178،000 ± 760 (يعني ± SEM، جلد الآفات من مرضى الصدفية) الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة من الجلد البشري عند استخدام واحد 4 ملم خزعة الجلد.

وقد تم تحديد أنواع مختلفة من CD45 + الخلايا في تعليق وحيد الخلية المستمدة من الجلد من أشخاص أصحاء بما في ذلك CD4 + T-الخلايا (~ 45٪)، CD8 + الخلايا التائية (~ 30٪)، وCD11c و+ البلدان النامية (~ 5٪ )، في حين أن عدد قليل من الخلايا البائية (CD19 +)، الخلايا القاتلة الطبيعية (CD56 + CD3 -)، أو وحيدات / الضامة (CD14 + أو CD1c +) لوحظت (الشكل 1A). منهجية يسمح أيضا لتحليل CD4 + CD25 + Foxp3 + الخلايا في خزعات الجلد البشري. باستخدام تلطيخ داخل الخلوي بعد تحديد وpermeabilization، فمن الممكن لإظهار تعبير عن القوات المسلحة الكونغولية النسختور Foxp3 في الخلايا CD25 + T (الشكل 1A).

وأظهرت وحيدة الخلية تعليق المستمدة من خزعات الجلد البشري خلفية عالية تألق ذاتي في FL1 (FITC)، FL2 (PE)، FL3 (تنمية الطفولة المبكرة)، FL9 (باسيفيك بلو) وFL10 (الكروم البرتقال) القنوات باستخدام عداد الكريات (لا تظهر البيانات) . لتحليل سليم من السكان الخلايا اللمفاوية، وبالتالي فإننا نوصي باستخدام لCD45 ماب مكافحة الإنسان مترافق مع بريليانت البنفسج 421 تألقي لالنابضة من السكان لمفاوية واستبعاد السكان خلية autofluorescent (الشكل 1B). وكانت غالبية خلايا المقيمين في جلد الإنسان CD3 + الخلايا التائية (الشكل 1C). لتحليل بقاء الخلية فمن المستحسن استخدام صبغة الجدوى قابل للتثبيت على التمييز قابلة للحياة من القتلى يموتون خلايا / (الشكل 1C). عادة هذه النتائج البروتوكول في 65.3٪ ± 7.7 (متوسط ​​± SD) خلايا قابلة للحياة. لمزيد من التحليل التدفق الخلوي البيانات، فمن ADVISإد إلى بوابة على السكان خلية قابلة للحياة، لأن الخلايا الميتة أو التي تحتضر تفقد سلامة غشاء الخلية بهم، ويمكن غير تحديدا ربط الأجسام المضادة مترافق، وبالتالي زيادة تلوين الخلفية.

تي خلايا معزولة من هذا البروتوكول هي مناسبة تماما لمزيد من التحليل الوظيفي. باستخدام واحد خزعة 4 ملم من جلد الآفات من مرضى الصدفية، فقد تبين أن خزعة المستمدة خلايا T أنتجت IL-17A وIFNγ التالية 4 تحفيز الموارد البشرية مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin بحضور Brefeldin ألف (الشكل 2).

الطازجة تعليق الجلد خلية واحدة من آفات الجلد الصدفي المعنية يمكن أن تستخدم أيضا لمزيد من خارج الحي زراعة الخلايا والتحليل الوظيفي لاحق. وبعد التوسع بعد التحفيز بولكلونل مع ميكروبيدات مكافحة CD3 / مكافحة CD28 المغلفة ماب في وجود السيتوكينات الموالية للالتهابات IL-1β أو IL-23 لمدة 8 أيام، والخلايا على سبيل المثال يمكن أن تحلل لcytok بهمالمعهد الوطني للإحصاء إنتاج قدرة (الشكل 3). من خلال القيام بذلك، لوحظ وجود فرق واضح بين إمكانية إنتاج السيتوكينات من الخلايا المشتقة من الجلد من أشخاص أصحاء والصدفي. وأظهرت الخلايا التائية من الأفراد الصدفي قدرة أعلى بكثير لإنتاج الصدفية المرتبطة IL17A السيتوكينات وIFNγ. وهذا يعني أنه حتى بعد ثقافة فيفو السابقين وحافظت على prototypic النمط الظاهري الصدفية خلوى، غائبة في حالة من الاصحاء.

الشكل 1
كانت ملطخة يتم تحديد أنواع مختلفة من الكريات البيض في تعليق وحيد الخلية المستمدة من الجلد من أشخاص أصحاء الخلايا الليمفاوية المقيمين الجلد معزولة باستخدام بروتوكول وصفها في النص مع MABS-تألقي مترافق من الفائدة زائد قابل للتثبيت الصبغة الحيوية وعلى الفور تحليلها بواسطة: الرقم 1. التدفق الخلوي. (A) تدفق قبرصيكشف tometric من وحيدات (CD14)، البلدان النامية (CD11c و)، الخلايا البائية (CD19)، الخلايا القاتلة الطبيعية (CD56 + CD3 -)، CD4 CD8 + وCD25 + Foxp3 + مجموعات فرعية داخل الخلايا الليمفاوية المقيمين الجلد. CD45 مكافحة البشري / BV421 ماب يميز الخلايا الليمفاوية من الخلايا autofluorescent. يظهر استراتيجيات النابضة تستخدم لCD45 + الخلايا في (ب). (ج) نسبة CD45 + قابلة للحياة الخلايا CD3 + T بعد العزلة. عدد يبين النسبة المئوية للخلايا إيجابية. ويرد تجربة تمثيلية من ثلاثة مختلفة التجارب / المانحين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: خلايا T مستمدة من جلد الآفات من مرضى الصدفية يمكن أن الم Ùم IL-17A وIFNγ. أجري واحد 4 ملم خزعة الجلد من جلد الآفات المريض الصدفية على شفويا أو كتابة الموافقة المسبقة للاستخدام العلمي. تم عزل خلايا T مقيم الجلد باستخدام بروتوكول صفها في النص. إنتاج IL-17A وIFNγ الخلايا T مقيم الجلد. وقد تم قياس تراكم الخلايا من السيتوكينات في الاستجابة إلى 4 تحفيز الموارد البشرية مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin بحضور Brefeldin والتدفق الخلوي. وأظهرت النسبة المئوية للخلايا خلوى إيجابي. وأظهرت بيانات من ثلاثة مرضى مختلفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): خلايا T-الجلد المقيمين قادرة على إنتاج IL-17A وIFNγ التالية خارج الجسم الحي A) أو IL-23 (50 نانوغرام / مل، B) لمدة 8 أيام. بعد ذلك، تم حفز الخلايا لمدة 4 ساعات مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin بحضور Brefeldin ألف وتحليلها بعد ذلك لإنتاج السيتوكينات داخل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. ويرد مثال تمثيلية من ثلاث تجارب / المانحين مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نقدم بروتوكول لعزل كفاءة خلايا T مقيم الجلد من خزعات الجلد البشري. وميزة هذا البروتوكول هو عزل أعداد كبيرة نسبيا من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة، ومعربا عن علامات سطح ذات الصلة. وكانت مجموعات فرعية الخلايا التي تم تحديدها: CD11c و+ البلدان النامية، وخلايا CD4 + والخلايا CD8 + T وFoxp3 + CD25 +. الأهم من ذلك، كانت خارج الحي ثقافة خلايا T معزولة المقيمين الجلد جدا مجدية بشكل جيد وسمحت للتحليل وظيفي لاحق.

يمكن فصلها الجلد البشري في تعليق وحيد الخلية من خلال الجمع بين التفكك الميكانيكية مع تدهور الأنزيمية للبروتينات التصاق الخلية التي تعمل للحفاظ على السلامة الهيكلية للأنسجة. على الرغم من dispase فصل طبقة أساس من البشرة والأدمة هي الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتحديد تسلل خلية في هذه طبقات الجلد منها، لاحظنا أن dispase العلاج أدت رالزراعة العضوية خفض كبير في التعبير سطح الخلية من CD25 و CD27 (لا يظهر). ولما كانت هذه علامات هامة لتمييز مجموعات فرعية لمفاوية، ونحن نعتقد أن dispase تأثيرات العلاج المناعي لاحق. ومن غير المحتمل أن إزالة الأدمة هي المسؤولة عن خفض لوحظت في CD25 أو CD27 الخلايا معربا، منذ ذلك الحين في الجلد من أشخاص أصحاء المترجمة غالبية خلايا T في الأدمة في حين موجودة في البشرة 10 أرقام الهواتف المحمولة دقيقة T -12. وقد تم الإبلاغ عن تأثير ضار من dispase على قدرة انتشار الخلايا الكيراتينية منعزلة في السابق 13. لذلك، هناك ما يبرر استخدام الحكمة من dispase إذا ظيفة الخلية هي الهدف من هذه الدراسة. في بروتوكول لدينا لقد تم استخدام نوع كولاجيناز الأول للحصول على تعليق خلية واحدة من خزعات الجلد. على الرغم من كولاجيناز أنا قد النشاط زيتية عالية مقارنة مع كولاجيناز الرابع وبالتالي هو أكثر قاسية، اخترنا هذا كولاجيناز خاصة لأنها كانت الشركة المصرية للاتصالاتSTED لمدى ملاءمتها لزراعة الخلايا. استخدام كولاجيناز الرابع التي هي مناسبة لزراعة الخلايا قد يكون خطوة في المستقبل لمواصلة تحسين البروتوكول الحالي.

نظرا لطبيعتها، والجلد شديدة المقاومة لقوى الشد وتفصيل الميكانيكية. حتى الآن، وقد أعاق تحليل شامل للخلايا المناعية في جلد الإنسان من التحديات التقنية في الحصول على أرقام الخلية كافية عند استخدام بروتوكولات الهضم قاسية نسبيا. ونتيجة لذلك، فإن معظم الدراسات التي نشرت حتى الآن تعتمد على تحليلات المناعى. يعتبر العزل مباشرة من خلايا CD4 + T من خزعات الجلد عموما مرهقة. وسيكون البديل استخدام يزدرع الجلد الزحف من الثقافات 10. ومع ذلك، هذه تأخذ 2-3 أسابيع للثقافة، والثقافة المتوسطة يزدرع الجلد يحتوي على مجموعة مختارة من السيتوكينات و chemokines، والتي قد تؤدي إلى الزحف تفضيلية من مجموعات فرعية محددة الخلايا التائية. وبالإضافة إلى ذلك قد affec الفترة الثقافةتي النمط الظاهري للخلايا. البروتوكول الحالي لا يجعل استخدام السيتوكينات إضافية أو كيموكينات، والتعبير عن CD4 (وأيضا علامات أخرى من الخلايا) وحفظت جيدا بعد العزلة، وتمكين كل المظهرية ودراسة وظيفية من السكان الخلايا التائية مباشرة بعد العزلة.

ويستخدم المتاحة تجاريا dissociator النسيج الآلي لتفكك أجزاء الجلد قبل الحضانة مع كولاجيناز، المطلوبة لتدهور المصفوفة خارج الخلية. من أجل إطلاق سراح لاحق من الخلايا من المصفوفة خارج الخلية، يتم استخدام dissociator الآلي مرة أخرى. على الرغم من واسع التقطيع اليدوي من الجلد يمكن أن تسفر عن أرقام الهواتف المحمولة مماثلة (لا تظهر البيانات)، فإن النتائج تكون أقل اتساقا وأكثر اعتمادا على تجربة فنان الأداء. سوف تفكك الجلد باستخدام الإجراء محدد مسبقا التي توفرها أداة تسفر عن نتائج أكثر استنساخه من ذلك بكثير. وتمشيا مع الدراسات السابقة تبين أن الجلد يحتوي على مختلف لeukocytes فرعية 2،14، CD11c و+ البلدان النامية، CD8 + وCD4 + T الخلايا، ولوحظت Foxp3 خلايا + في السكان وحيدة الخلية بواسطة بروتوكول المقدمة هنا على استعداد. وجدير بالذكر أن بروتوكول غلة العائد المرتفع نسبيا من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة. ويرجع ذلك إلى كفاءة البروتوكول، فإنه مفيد بشكل خاص عند دراسة المواد المريض، حيث غالبا ما يمكن الحصول على واحد فقط 4 مم خزعة الجلد. باستخدام الأسلوب، كنا قادرين على إظهار أن الخلايا التائية معزولة عن جلد الآفات من مرضى الصدفية أظهرت قدرة أعلى لإنتاج IL-17A وIFNγ بالمقارنة مع بشرة صحية 9.

اعتمادا على سؤال البحث، قد يكون من الضروري لمواصلة تنقية بعض مجموعات فرعية من الخلايا بعد وإعداد تعليق خلية واحدة. في هذه الحالة، أكبر قطعة من الجلد يمكن استخدامها لضمان العائد من خلايا كافية لتحليل فرعية. عند القيام بذلك، تأكد من أن الجلد يجب أن يقتطع بي أصغراللجنة الاقتصادية لأوروبا من حوالي 2 مم × 2 مم قبل البدء في بروتوكول العزلة.

في الختام، هذا البروتوكول يوفر طريقة محسنة لعزل الخلايا المقيمين الجلد، وتسهيل المظهرية ذات مغزى والتحليل الوظيفي على مستوى خلية واحدة، وبالتالي تحسين الرؤية لدينا في الجلد الاستجابات المناعية.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي هي إزالة المناسبة من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وقطع الجلد إلى أجزاء أصغر، وخصوصا عند معالجة خزعة أكثر من واحد في أنبوب التفكك. سوف الأنسجة الدهنية و / أو قطعة نسيج كبيرة تتسبب في dissociator للعمل بشكل غير صحيح، طلب إعادة تشغيل. هذا وسوف تلحق ضررا بالغا بقاء الخلية. الحد من هذه التقنية هو أن أعداد الخلايا المستمدة من واحد 4 ملم خزعة الجلد ليست كافية لعزل اللاحقة من مجموعات فرعية من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

تفضلت خزعات الجلد من مرضى الصدفية الدكتور أندرياس Koerber (قسم الأمراض الجلدية في جامعة إيسن، ألمانيا) بعد موافقة شفهية أو مكتوبة علم للاستخدام العلمي.

ويدعم XH أيضا NSFC 61263039 و11101321 NSFC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics