בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יש עור אדם תפקיד מחסום חשוב ומכיל תאים חיסוניים שונים שתורמים הומאוסטזיס רקמות והגנה מפני פתוגנים. כפי שהעור הוא יחסית קל לגשת, הוא מספק פלטפורמה אידיאלית ללמוד מנגנוני ויסות היקפיים חיסוניים. תאי תושב חיסון immunosurveillance התנהגות עור הבריא, אלא גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של מחלות עור דלקתיות, כגון פסוריאזיס. למרות תובנות מתעוררים, הבנתנו את הביולוגיה שבבסיס מחלות עור שונות דלקתי עדיין מוגבלת. יש צורך באיכות טובה (יחיד) אוכלוסיות תאים שבודדו דגימות עור ביופסיה. עד כה, נהלי בידוד כבר הקשו ברצינות על ידי חוסר קבלת מספר מספיק של תאי קיימא. בידוד לניתוח שלאחר מכן גם הושפעו אובדן סמני שושלת תא חיסון, בשל הלחץ המכאני וכימיות נגרם על ידי נהלי דיסוציאציה הנוכחיים להשיגהשעית תא בודדת. כאן, אנו מתארים שיטה שונה כדי לבודד תאי T משני בריא מעורב עור אנושי פסוריאטית ידי שילוב דיסוציאציה עור מכאני באמצעות Dissociator רקמות אוטומטי וטיפול collagenase. מתודולוגיה זו שומרת ביטוי של סמני שושלת החיסוניים ביותר כגון CD4, CD8, Foxp3 ו CD11c רק בעת הכנה של השעיות תא בודדות. דוגמאות של בידוד תא מוצלח CD4 + T ו פנוטיפי עתידי אנליזה פונקציונלית מוצגות.

Introduction

העור, כממשק העיקרי בין הגוף לסביבה, מספקת את קו ההגנה הראשון נגד פיזי חיצוני, כימיים ועלבונות ביולוגיים כגון פציעה, קרינה אולטרה סגולה ו מיקרואורגניזמים. העור מורכב משני תאים העיקרי, האפידרמיס הדרמיס, ומכיל מגוון של תאי מערכת החיסון כולל תאי לנגרהנס, מקרופאגים, תאים דנדריטים (DCS), וכ -20 מיליארד תאי זיכרון T, כמעט פי שניים בהווה מספר בהיקף הדם כולו 1 , 2. גוף גדל והולך של נתונים תומך ברעיון כי העור יש פונקציות חיסוניות חיוניות, הן במהלך הומאוסטזיס רקמות במצבים פתולוגיים שונים. תאים חיסוניים תושב בעור רגיל נחשבים לנהל immunosurveillance 3 הוכחו לשחק תפקיד בהתפתחות של מחלות דלקתיות כגון פסוריאזיס 4. בשנת העור lesional פסוריאטית, הן CD4 + ו- CD8 + הסתננו תאי T היו observed וזה היה הראה כי היחס בין CD4 ו- CD8 משתנה בהתאם למצב המחלה 5. עם זאת, אוכלוסיות אלה של תאים שקשה ללמוד בגלל הטכניקות הקיימות לאפשר בידוד של תאים בודדים בלבד.

הטכניקות בשימוש כיום נרחב עבור בידוד תא T מעור אדם לשלב ניתוק העור מכני עם טיפול אנזימטי. ביופסיות עור אדם הם טחונים בהרחבה וטופחו עם אנזימים כמו טריפסין, collagenase ו / או EDTA 6-8. עור בהתחשב בכך הוא רקם מחסום אשר עמיד מאוד לכוחות מתיחת חלוקה מכאנית, השיטות הוקמו של בידוד תא T המיוצר בתאים מעט מאוד, ואפילו מספרים נמוכים יותר של תאי קיימא, מה שהופך תרבות vivo לשעבר לתא של אוכלוסיות תאים אלה קשים מאתגר.

כאן אנו מדווחים על שיטה שונה לבודד לימפוציטים הן מעור אדם פסוריאטית בריא מעורב ידי שילוב mechanדיסוציאציה iCal של העור באמצעות Dissociator רקמות אוטומטיות במקום השיטה הוקמה ממינסינג בהרחבה, יחד עם עיכול אנזימטי באמצעות collagenase. תת תא חיסון קיימא שונה כולל DCs ותאי T נצפו לאחר הכנת השעית תא בודד. חשוב לציין את הביטוי של סמני המשטח CD3, CD4 ו CD8 השתמר היטב. תאים ובכך מוכן, מוכנים לשימוש בתרביות תאים vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometric. פרוטוקול זה הועסק בהצלחה לניתוח ביופסיות עור יחידות (4 מ"מ) נגזרות עור lesional של חולי פסוריאזיס. תוצאות המחקר הראו כי תושב העור המטופל בתאי T מיוצר יותר ציטוקינים דלקתיים כמו IL-17 ו IFNγ בהשוואה למתנדבים בריאים 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: עור ביופסיות מיחידים בריאים התקבלו שאריות עור בטן של אנשים שעברו ניתוחים פלסטיים אלקטיבי לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. שימוש עור אנושי אושרה ובהתאם לתקנות שקבעו הוועדות האתיות הרפואיות למחקר האדם של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, ניימיכן, הולנד אונ' אסן, גרמניה.

1. הכנת תרחיפים תא יחיד מעור אדם (עבודה סטרילית בתוך ארון-Flow אם תרבית תאים לאחר נדרש)

  1. הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 + פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי 100 יחידות / מ"ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) + פירובט (0.02 מ"מ) ו Glutamax (0.02 מ"מ), ללא בסרום הוסיף.
  2. כן בינוני תרבות שלם: בינוני התרבות מוכן בשלב 1.1 + 10% בסרום נקווה אדם (HPS); לאחסן ב 4 ° C.. תביאו בינוני עד 20 ° C ± 2 לפנינוing.
  3. השג את ביופסיה של העור באמצעות מכשיר ביופסיה סיבוב 4 מ"מ ולשמור אותו במדיום תרבות שלמה RPMI1640 ב 20 ° C ± 2 עד 4 שעות או 4 ° C ON. לעבד הביופסיה בהקדם האפשרי עם ההגעה במעבדה.
    הערה: ארוכה יותר אחסון של עור ישפיע על תשואת התא כדאי תא.
  4. לייבל צינור דיסוציאציה כחול הכתיר ולהוסיף 5 מ"ל בינוני תרבות שלמה לתוך הצינור שכותרתו.
  5. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות שלמה לבאר כל (ב 3 בארות בסך הכל) של צלחת תרבות 6-גם סטרילי. השתמש בכלים סטריליים להציב הביופסיה לתוך באר אחת, לשטוף, תזיז אותה אל באר שני וחזור על שלב זה עוד פעם אחת, ובכך להשיג סכום כולל של שלוש שטיפות.
  6. מעבירים את ביופסיה של העור שטוף היטב את צלחת פטרי סטרילית, להוסיף 100 μl של המדיום תרבות שלמה על החלק העליון של ביופסיה, ובזהירות לגרד רקמת שומן תת עורי באמצעות אזמל סטרילי חד פעמי נירוסטה.
    הערה: Thהוא הוא שלב קריטי.
  7. חותך כל ביופסיה של עור ל -4 חתיכות קטנות על צלחת פטרי סטרילית. דגימות העברה (עד ארבעה 4 ביופסיות מ"מ לכל צינור) אל הצינור דיסוציאציה מוכן המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבות שלמה.
  8. הבשר ומהדקים את הצינורות עם כובע, ולצרף במהופך לשרוול של Dissociator רקמות אוטומטיות. ודא כי כל חומר המדגם ממוקם באזור של הרוטור.
  9. התחל את תהליך הניתוק ידי ההפעלה "תכנית m_spleen _01" (תכנית מוגדרת מראש שמספקת בזיכרון הפנימי של המכשיר או על ידי כרטיס התכנית המלווה) כדי לנתק את הביופסיה במהירות הסיבוב המתאימה 56 שניות.
  10. לאחר עיבוד, לנתק את הצינור דיסוציאציה מן Dissociator ולוודא שכל החומר ניתק נאסף בתחתית של התחתית.
  11. להוסיף 150 μl collagenase IA (80 מ"ג / מ"ל) לתוך הצינור דיסוציאציה דגירה המדגם באמבט מים רועד ב 37° צלזיוס למשך 60 דקות. הוספת 100 μl של DNase אני (5 MU / מ"ל) לתוך צינור thedissociation, ומערבבים היטב.
    הערה: ריכוז גבוה של collagenase או זמן הדגירה כבר תשנה כדאיות התא.
  12. צרף הצינור דיסוציאציה לשרוול של Dissociator הרקמות האוטומטיות ולהפעיל את "_01 טחול תכנית m_" כדי לנתק את הביופסיה עוד פעם אחת.
  13. מניחים מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר על גבי צינור פלקון 50 מ"ל. החל חומר המדגם ניתק מסננת תא זה כדי להסיר גושי תא / פסולת רקמות.
  14. לשטוף מסננת תא פעם אחת עם 5 מ"ל של מדיום תרבות שלמה. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 10 דקות ו supernatant לשאוב.
  15. חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת. Resuspend כדורי תא 300 μl של מדיום תרבות השלם. המתלים תא יחיד מוכנים לניתוח נוסף; להמשיך עם פרוטוקולי תרבית תאי vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometry.
  16. במקרה של i הנוספתמכתים ציטוקינים ntracellular, לעורר תאים עם PMA (12.5 ng / ml), ionomycin (500 ng / ml) ו Brefeldine A (5 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 4 שעות לפני ביצוע זרימת ניתוח cytometry.

2. הפעלת Polyclonal של תאי T עור-Resident (תרבית תאי Ex Vivo)

  1. Aliquot 100 תא בודד השעיות μl (מוכן בשלב 1.15) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית.
    הערה: לכל אחד מ -4 מ"מ ביופסיה של העור, השעיות תא בודד רכשה ניתן לפצל לפחות שתי בארות של צלחת 96-היטב.
  2. להוסיף microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 מב-מצופה (25,000 חרוזים לכל טוב), ציטוקינים אנושי רקומביננטי RIL-2 (הריכוז הסופי 25 U / ml) ו RIL-1β (מ"ל / הריכוז הסופי 50 נ"ג).
  3. מכסים את הצלחת תרבות עם מכסה צלחת גם שכותרתו, דגירה 5% CO 2, 100% לחות, 37 ° C חממה. שנה בינונית כאשר הצבע הבינוני פונה צהוב.

3. ניתוח cytometry זרימה של הראשים / עור-Resident בתרבית תאי T

  1. הכן חיץ FACS: PBS + 0.2% BSA.
  2. עבר תאי עניין לתוך צלחת 96-גם נ-תחתון. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  3. Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  4. הכתם התאים עם 100 μl של eFluorescence780 מוכן מצומדות צבע הכדאיות ניתן לתקן (1: דילול 1,000 באמצעות PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  5. בחר מבז סמן פני התא הנדרש, למשל: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), ואת CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), להכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ FACS על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם.
  6. הוסף 25 μl של מבז-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. דגירה 20 דק 'ב 20 ° C ± 2, להגן מפני אור.
  7. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  8. לקבלת דוגמיות שרק דורשים מכתים פני התא, המשך לסעיף 3.16.
  9. במקרה של מכתים Foxp3 תוך תאי:
    1. כן קיבעון חיץ permeabilization ידי ערבוב חלק אחד של תרכיז עם 3 חלקים של מדלל.
    2. הכן חיץ permeabilization 1x: 1 חלק 10x permeabilization חיץ + 9 חלקים של H 2 O. לעקר
  10. כדורי Resuspend ב 100 μl של קיבעון permeabiliחיץ zation, ומערבבים היטב, דגירה על 4 ° C למשך 30 דקות.
  11. הוספת 100 חיץ permeabilization μl היטב כל, צנטריפוגות ב 450 XG ב RT במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  12. שטפו תאים עם חיץ permeabilization עוד פעם אחת.
  13. בחר נדרש מבז תאיים, למשל, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ו IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). מכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ permeabilization המכיל סרום עכברוש נורמלי 2% על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם.
  14. הוסף 20 μl של מב-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. לדגור על 4 ° C למשך 30 דקות, להגן מפני אור.
  15. לאחר 30 דקות דגירה, להוסיף 100 μl של חיץ permeabilization לבאר כל אחד. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  16. שטפו תאים עם permeabilization buffer עוד פעם אחת. Resuspend גלולה ב 110 μl של חיץ FACS, השעיות תא העברה לתוך צינור microFACS.
    הערה: Sample מוכן למדידה באמצעות 10 צבעים cytometry זרימה.
  17. במקרה של מספר סלולארי מדויק הנדרש, להוסיף 10 μl של השעיה אחידה מוּרבָּך של fluorospheres לתוך מדגם זה מייד לפני ביצוע מדידות באמצעות cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המובא כאן יניב בין 2,200 ± 615 (ממוצע ± SEM, עור של מתנדבים בריאים) עד 178,000 ± 760 (ממוצע ± SEM, עור lesional של חולי פסוריאזיס) לימפוציטים קיימא מעור אדם בעת שימוש ביופסיה של עור יחידה 4 מ"מ.

סוגים שונים של CD45 + תאים אותרו תא בודד השעיות נגזר העור של אנשים בריאים כולל CD4 + T-תאים (~ 45%), CD8 + T תאים (~ 30%), ו CD11c + DCS (~ 5% ), בעוד כמה B תאים (CD19 +), NK תאים (CD56 + CD3 -), או מונוציטים / מאקרופאגים (CD14 + או CD1c +) נצפו (איור 1 א). המתודולוגיה מאפשרת גם הניתוח של CD4 + CD25 + Foxp3 + תאי ביופסיות עור אדם. באמצעות מכתים תוך תאי לאחר תיקון ו permeabilization, אפשר להפגין ביטוי fac השעתוקטור Foxp3 ב CD25 + T תאים (איור 1 א).

תא בודד השעיות נגזרו ביופסיות עור אדם הראו רקע autofluorescence גבוה FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (פסיפיק כחול) FL10 (כתום כרום) ערוצים באמצעות cytometer (מידע לא מוצג) . לקבלת ניתוח נכון של אוכלוסיית הלימפוציטים, ולכן אנו ממליצים על שימוש של מב CD45 אנטי אנושי מצומדות עם fluorochrome מבריק ויולט 421 עבור gating של אוכלוסיית הלימפוציטים והדרה של האוכלוסייה התא autofluorescent (איור 1B). רוב תאי תושב בעור האדם היו תאי CD3 + T (איור 1 ג). לניתוח כדאיות התא מומלץ להשתמש לצבוע הכדאיות fixable להבחין קיימא מן המתים / תאים מתים (איור 1 ג). בדרך כלל תוצאות בפרוטוקול זה ב 65.3% ± 7.7 (ממוצע ± סטיית תקן) קיימא תאים. לניתוח נוסף של זרימת cytometry נתונים, זה Advisאד השער על אוכלוסיית תא קיימא, מאז תאים מתים או גוססים לאבד שלמות קרום התא שלהם, ויכולים הלא במיוחד לאגד נוגדנים מצומדות, ובכך להגדיל מכתים רקע.

T תאים מבודדים על ידי פרוטוקול זה הם גם מתאים אנליזה פונקציונלית נוספת. באמצעות ביופסיה 4 מ"מ יחיד של העור lesional של חולי פסוריאזיס, זה היה הראו כי תאי T נגזר ביופסיה מיוצר IL-17A ו IFNγ הבאים 4 גירוי hr עם PMA / ionomycin בנוכחות Brefeldin A (איור 2).

מוכנות טרי תא בודד השעיות עור מפני נגעים בעור פסוריאטית מעורבים יכולות לשמש גם עבור תרבית תאי vivo לשעבר נוספת וניתוח פונקציונלי שלאחר מכן. בעקבות התרחבות לאחר גירוי polyclonal עם microbeads מב מצופה אנטי CD3 / אנטי CD28 בנוכחות של ציטוקינים פרו-דלקתיים IL-1β או IL-23 במשך 8 ימים, התאים יכולים למשל להיות מנותח עבור cytok שלהםine יכולת ייצור (איור 3). בעשותם כך, הבדל ברור בין פוטנציאל ייצור ציטוקינים של תאים שמקורם בעור של אנשים בריאים פסוריאטית נצפה. T תאים מאנשים פסוריאטית הראה יכולת גבוהה בהרבה כדי לייצר את IL17A ציטוקינים הקשורים פסוריאזיס IFNγ. משמעות דבר הוא כי גם לאחר תרבות vivo לשעבר פנוטיפ ציטוקינים פסוריאזיס אב-טיפוס נשמר, נעדר במקרה של ביקורת בריאה.

איור 1
איור 1:. סוגים שונים של leucocytes מזוהים תא בודד השעיות נגזר העור של אנשים בריאים לימפוציטים תושב עור המבודד באמצעות הפרוטוקול המתוארים בטקסט הוכתם מבז fluorochrome מצומדות עניין בתוספת צבע כדאיות ניתן לתקן ומייד ונותח על ידי cytometry זרימה. (א) תזרים CYזיהוי tometric של מונוציטים (CD14), DCS (CD11c), תאי B (CD19), תאי NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + ו- CD25 + Foxp3 + תת בתוך לימפוציטים תושב העור. אנטי אנושי CD45 / BV421 מב מבדיל לימפוציטים מתאי autofluorescent. אסטרטגיות gating המשמשות תאי CD45 + מוצגת (B). (ג) אחוז CD45 קיימא + תאי CD3 + T לאחר בידוד. מספר מראה את אחוז התאים החיוביים. ניסוי נציג מתוך שלושה ניסויים / תורמים שונים מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תאי T נגזרו עור lesional של חולי פסוריאזיס יכולים produce IL-17A ו IFNγ. ביופסית עור יחידה 4 מ"מ נלקחה מן העור lesional של מטופל פסוריאזיס על בעל-פה או בכתב הסכמה מדעת לשימוש מדעי. תאי T עור התושב בודדו באמצעות הפרוטוקול המתוארים בטקסט. הפקה של IL-17A ו IFNγ בתאי עור תושב T. הצטברות תאית ציטוקינים בתגובת 4 גירוי hr עם PMA / ionomycin בנוכחות Brefeldin נמדדה באמצעות flow cytometry. אחוז התאים ציטוקינים-חיובי מוצג. נתונים של שלושה חולים שונים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תאי T עור-תושב מסוגלים לייצר IL-17A ו IFNγ הבאים vivo לשעבר א) או IL-23 (50 ng / ml, B) במשך 8 ימים. לאחר מכן, התאים היו מגורה עבור 4 שעות עם PMA / ionomycin בנוכחות Brefeldin A ו- ניתח ואילך לייצור ציטוקינים תאיים על ידי cytometry הזרימה. דוגמא מייצגת מתוך שלושה ניסויים עצמאיים / תורמים מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאי T תושב העור ביעילות ביופסיות עור האדם. היתרון של פרוטוקול זה הוא הבידוד של מספרים גבוהים יחסית של לימפוציטים קיימא, מבקש להביע סמני משטח רלוונטיים. תת תא מזוהה היו: CD11c + DCS, CD4 + ו- CD8 + T תאים Foxp3 + CD25 + תאים. חשוב לציין, לשעבר vivo התרבות של תאים מבודד עור תושב T הייתה טוב מאוד ריאלית ואפשר אנליזה פונקציונלית שלאחר מכן.

עור האדם ניתן ניתק לתוך תא בודד השעיות ידי שילוב ניתוק מכני עם השפלה אנזימטי של חלבונים תאיים הידבקות לאיזו פונקציה לשמור על השלמות המבנית של רקמות. למרות dispase הפרדת שכבה מבוססת של האפידרמיס הדרמיס היא שיטה בשימוש נרחבת כדי לקבוע חדירת תא בשכבות עור בהתאמה אלה, הבחנו כי dispase טיפול הוביל tOA ירידה גדולה של הביטוי על פני קרום התא של CD25 ו CD27 (לא מוצג). כסמנים האלה חשובים לאפיין תת הלימפוציטים, אנו מאמינים כי immunophenotyping הבא dispase שפעות טיפול. זה לא סביר כי הסרת הדרמיס אחראית לירידה שנצפתה CD25 או CD27 תאי מבטאים, שכן עור של אנשים בריאים רוב תאי T הוא מקומי בדרמיס בעוד מספר תאי T דקות נמצאות האפידרמיס 10 -12. ההשפעה המזיקה של dispase על יכולת ההתפשטות של קרטינוציטים מבודדים דווחה בעבר 13. לכן, שימוש נבון של dispase היא מוצדקת אם תפקוד התא הוא מטרת המחקר. בפרוטוקול שלנו אנו עושים שימוש בסוג Collagenase לי להשיג השעית תא בודדת של ביופסיות עור. למרות Collagenase לי יש פעילות tryptic גבוהה לעומת Collagenase IV ובכך הוא יותר קשה, בחרנו Collagenase המסוים הזה כי זה כבר tested לתרבות והתאמת תא שלה. שימוש IV Collagenase כי הוא מתאים תרבית תאים עשוי להיות צעד עתידי נוסף לייעל הפרוטוקול הנוכחי שלנו.

בשל האופי שלה, העור עמיד מאוד לכוחות מתיחת חלוקה מכאנית. עד כה, ניתוח מקיף של תאים חיסוניים עור אנושי כבר הקשה על ידי אתגרים טכניים בהשגה מספיק מספרים סלולריים בעת שימוש בפרוטוקולי עיכול קשה יחסית. כתוצאה מכך, רוב המחקרים שפורסמו עד כה להסתמך על ניתוחי immunohistochemical. הבידוד הישיר של תאי T מסוג CD4 + ביופסיות עור נחשב מסורבל כלל. חלופה תהיה שימוש explant העור לזחול החוצה תרבויות 10. עם זאת, אלה לקחת 2-3 שבועות של תרבות, ומדיום תרבות העור explant מכיל קבוצה הנבחרת של ציטוקינים chemokines, אשר עלול להוביל זחילה מועדפת מתוך תת תא T הספציפי. בנוסף תקופת התרבות עשויה affect את הפנוטיפ של תאים. הפרוטוקול הנוכחי אינו לעשות שימוש הוסיפו ציטוקינים או כמוקינים, וביטוי של CD4 (וגם סמני תאים אחרים) נשמר היטב לאחר הבידוד, המאפשרים הוא פנוטיפי ולימוד תפקודי של אוכלוסיות תאי T ישירות לאחר בידוד.

Dissociator רקמות אוטומטיים זמין מסחרי משמש הדיסוציאציה של שברי עור לפני הדגירה שלהם עם collagenase, נדרשים השפלים הבין-התאי. עבור שחרורו הצפוי של תאי תאי מטריקס, את Dissociator האוטומטית משמשת שוב. למרות חיתוך ידני נרחב של עור יכול להניב מספרים סלולריים דומים (מידע לא מוצג), התוצאות הן פחות עקביות תלויות יותר את החוויה של ההופעה. דיסוציאציה של עור באמצעות ההליך מוגדר מראש המוצע על ידי המכשיר תניב הרבה תוצאות לשחזור יותר. בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו עור המכיל l השונהeukocytes תת 2,14, CD11c + DCS, CD8 + ו- CD4 + T תאים, Foxp3 + תאים נצפו אוכלוסיות תא בודד שהכין הפרוטוקול המובא כאן. חשוב לציין, פרוטוקול מניב תשואה גבוהה יחסית של לימפוציטים קיימא. בשל היעילות של הפרוטוקול, זה שימושי במיוחד כאשר לומד חומר חולה, שם לעתים קרובות ביופסית עור יחידה רק 4 מ"מ ניתן להשיג. באמצעות השיטה, הצלחנו להראות כי תאי T מבודדים מן העור lesional של חולי פסוריאזיס הראו יכולת גבוהה לייצר IL-17A ו IFNγ לעומת עור בריא 9.

בהתאם לשאלת המחקר, ייתכן שיהיה צורך לטהר תת תא מסוים נוספת לאחר הכנת תרחיפים תא בודד. במקרה זה, חתיכות גדולות של עור יכולות לשמש כדי להבטיח את התשואה של תאים מספיק משנת המנתח. כאשר עושים זאת, לוודא כי העור צריך להיות וחותכים pi קטןeces של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ לפני תחילת פרוטוקול בידוד.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מציע דרך משופרת לבודד תאי עור תושב, הקלת פנוטיפי משמעותי אנליזה פונקציונלית ברמת תא בודדת, ובכך לשפר התובנה שלנו בתגובות עור חיסוניות.

צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי הם ההסרה התקינה של רקמת שומן תת העור ואת החיתוך של עור לחתיכות קטנות יותר, במיוחד בעת עיבוד יותר ביופסיה אחת בתוך שפופרת דיסוציאציה. רקמת שומן ו / או חתיכות רקמה גדולות תגרום Dissociator לעבוד בצורה לא נכון, שואל בשביל שליחויות מחדש. זה יפגע כדאיות התא ברצינות. המגבלה של הטכניקה היא כי מספרים סלולריים נגזרו ביופסית עור יחידה 4 מ"מימ אינם מספיקים עבור הבידוד הבא של תת קבוצות של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ביופסיות עור מחולים פסוריאזיס נמסרו באדיבות על ידי ד"ר אנדראס Koerber (המחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת אסן, גרמניה) לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי.

XH נתמכת גם על ידי NSFC 61263039 ו NSFC 11,101,321.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics