Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Человеческой кожи имеет важную барьерную функцию, и содержит различные иммунные клетки, которые вносят вклад в гомеостаз ткани и защиты от патогенных микроорганизмов. Поскольку кожа является относительно легко получить доступ, он обеспечивает идеальную платформу для изучения периферические механизмы иммунных регуляторных. Иммунные клетки резидентные у здоровых поведения кожи иммунологического, но и играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Несмотря на возникающие идеи, наше понимание биологии, лежащей в основе различных воспалительных заболеваний кожи по-прежнему ограничено. Существует необходимость для хорошего качества населения (одиночный) клеток, выделенных из образцов биопсии кожи. До сих пор процедуры изоляции были серьезно затруднена из-за отсутствия получения достаточного количества жизнеспособных клеток. Выделение и последующий анализ также пострадали от потери иммунных маркеров клеточной линии дифференцировки, из-за механического и химического стресса, вызванного существующими процедурами диссоциации, чтобы получитьодноклеточной суспензии. Здесь мы опишем модифицированный метод для выделения Т-клеток от обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем сочетания механической диссоциации кожи с использованием автоматизированной диссоциатор тканей и лечения коллагеназы. Эта методика сохраняет экспрессию большинства маркеров иммунной линии дифференцировки, таких как CD4, CD8, Foxp3 и CD11c при приготовлении одноклеточных суспензий. Примеры успешного выделения клеток CD4 + T и последующего фенотипических и функционального анализа показаны.

Introduction

Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т - клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови 1 , 2. Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических состояниях. Иммунные клетки резидентные в нормальной коже , как полагают, проводят иммунологического 3 и было показано, играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний , таких как псориаз 4. В псориатической пораженной кожи, и CD4 + и CD8 + Т - клетки проникали были наблerved и показано , что отношение CD4 и CD8 варьирует в зависимости от состояния заболевания 5. Тем не менее, эти популяции клеток трудно изучать, так как существующие методы позволяют изолировать только несколько клеток.

В настоящее время широко используются методы для выделения Т-клеток из человеческой кожи сочетают механическую диссоциацию кожи с ферментативной обработкой. Биопсий кожи человека широко фарша и инкубировали с ферментами , такими как трипсин, коллагеназа и / или ЭДТА 6-8. Принимая во внимание , что кожа является барьером ткани , которая обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации, установленные методы выделения Т - клеток получают очень мало клеток, и даже более низкие количества жизнеспособных клеток, что делает ех Vivo культуры клеток этих клеточных популяций трудно и испытывающий.

Здесь мы сообщаем модифицированный метод для выделения лимфоцитов из обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем объединения Mechanскую диссоциация кожи с использованием автоматизированной диссоциатор ткани вместо установленного метода широко мясорубки вместе с ферментативное расщепление с помощью коллагеназы. Различные жизнеспособные подмножества иммунных клеток, включая контроллеры домена и Т-клетки наблюдались после приготовления одной клеточной суспензии. Важно, что экспрессия поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8 хорошо сохранился. Клетки , полученные таким способом, будут готовы к использованию в бывших клеточных культурах или естественных условиях анализа проточной цитометрии. Этот протокол был успешно применен для анализа единичных биоптатах кожи (4 мм), полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом. Результаты показали , что кожа пациента житель Т - клетки получают более провоспалительных цитокинов , таких как IL-17 и IFN & gamma ; по сравнению со здоровыми добровольцами 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: биопсию кожи у здоровых индивидуумов были получены из брюшной кожи пережиток лиц, перенесших плановое пластическую операцию после устного или письменного информированного согласия для научного использования. Использование человеческой кожи был утвержден и в соответствии с правилами, установленными Медицинским этическими комитетами для человеческого исследования в медицинском центре университета Radboud, Неймеген, Нидерланды и Университет Эссен, Германия.

1. Подготовка одноклеточных суспензий из человеческой кожи (работа стерильного в потоке-кабинете, если последующее Культура клеток требуется)

  1. Готовят среду для культивирования клеток: среда RPMI 1640 + пенициллин / стрептомицин (конечные концентрации 100 единиц / мл и 100 мкг / мл, соответственно) + пирувата (0,02 мМ) и Glutamax (0,02 мМ) без сыворотки добавлены.
  2. Подготовить всю питательную среду: питательная среда, полученного на стадии 1.1 + 10% человек объединяли сыворотку (HPS); Хранить при температуре 4 ° С. Доведите среды до 20 ° С ± 2 перед намиING.
  3. Получение биопсии кожи с использованием 4мм круглый инструмент трепанобиопсия и держать его в RPMI1640 полной культуральной среде при температуре 20 ° С ± 2 до 4 часов или при температуре 4 ° C ON. Процесс биопсии как можно скорее по прибытии в лабораторию.
    Примечание: более длительное хранение кожи будет влиять на выход клеток и жизнеспособность клеток.
  4. Этикетка синего шапками диссоциации трубки и добавляют 5 мл полной культуральной среды в помеченную пробирку.
  5. Добавляют 2 мл полной культуральной среды в каждую лунку (в общей сложности 3 скважины) стерильного 6-луночный планшет для культивирования. Используйте стерильные инструменты, чтобы поместить биопсии в одну лунку, промыть, переместить его на второй скважине и повторить этот шаг еще раз, таким образом достигая в общей сложности трех полосканий.
  6. Перенести хорошо промыты биопсии кожи в стерильную чашку Петри, добавляют 100 мкл полной культуральной среды на верхней биопсии, и осторожно соскабливают подкожно-жировой ткани, используя нержавеющей стали одноразового использования стерильным скальпелем.
    Примечание: Thэто очень важный шаг.
  7. Разрежьте каждую биопсию кожи на 4 мелкие кусочки на стерильную чашку Петри. Образцы передачи (до четырех 4 мм биопсий на пробирку) к подготовленному диссоциации пробирку, содержащую 5 мл полной культуральной среды.
  8. Плотно закройте пробирки с крышкой, и прикрепить вниз головой к рукаву автоматизированной диссоциатора ткани. Убедитесь, что все образцы материала находится в зоне ротора.
  9. Запустить процесс диссоциации, запустив "Программа m_spleen _01" (предопределенный программу, представленную внутренней памяти прибора или в сопровождении программной картой) отделиться биопсии при соответствующей скорости вращения в течение 56 сек.
  10. После обработки отсоединения диссоциации трубки от диссоциатора и убедитесь, что все диссоциированного материал собирается в нижней части трубы.
  11. Добавьте 150 мкл коллагеназы IA (80 мг / мл) в диссоциации трубки и инкубировать образец в встряхивании на водяной бане при температуре 37° С в течение 60 мин. Добавляют 100 мкл ДНКазы I (5 MU / мл) в thedissociation трубку, хорошо перемешать.
    Примечание: Более высокая концентрация коллагеназы или более длительного времени инкубации будет изменять жизнеспособность клеток.
  12. Прикрепите трубку диссоциации к рукаву автоматизированной диссоциатора ткани и запустить "программу m_ селезенка _01" отмежеваться биопсии еще один раз.
  13. Поместите нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм на верхней части трубки сокола 50 мл. Применить диссоциированных образцы материалов для этой ячейки фильтра, чтобы удалить скопления клеток / мусора ткани.
  14. Промыть клеточный фильтр один раз 5 мл полной культуральной среды. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 10 мин и супернатант аспирата.
  15. Повторите стадии промывки еще один раз. гранулы клеток Ресуспендируют в 300 мкл полной культуральной среды. Одноклеточные суспензии готовы для дальнейшего анализа; по- прежнему с протоколами для бывших естественных условиях культивирования клеток или проточной цитометрии анализа.
  16. В случае дальнейшего Intracellular окрашивание цитокинов, стимулируют клетки с PMA (12,5 нг / мл), Ionomycin (500 нг / мл) и Brefeldine А (5 мкг / мл) в течение 4 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 4 часов перед выполнением потока цитометрии анализ.

2. Поликлональные Активация кожи резидентных Т - клеток (Ex Vivo культуры клеток)

  1. Кратные суспензии одноклеточные 100 мкл (полученного на стадии 1.15) в круглым дном 96-луночного планшета.
    Примечание: Для каждого из 4 биопсии кожи мм, приобретаемые одноклеточные суспензии могут быть разделены на по меньшей мере две лунки 96-луночного планшета.
  2. Добавить анти-CD28 микрогранулы анти-CD3 / монАТ напыление (25,000 шариков на ячейку), рекомбинантный человеческий цитокин РИЛ-2 (конечная концентрация 25 ед / мл) и RIL-1 & beta; (конечная концентрация 50 нг / мл).
  3. Накройте культуральную пластину с хорошо видную закрывающей пластины, инкубировать в 5% СО 2, 100% влажности, 37 ° C инкубатор. Изменение среды, когда среда цвет становится желтым.

3. Проточная цитометрия Анализ первичной / культивированный кожи резидентных Т-клеток

  1. Подготовка FACS буфера: PBS + 0,2% BSA.
  2. Передача клетки, представляющие интерес в V-дно 96-луночного планшета. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  3. Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  4. Пятно клетки с 100 мкл приготовленных eFluorescence780 конъюгированных Fixable жизнеспособность красителя (1: 1000 разведение с использованием PBS) при 4 ° С в течение 30 мин. Добавьте 100 мкл FACS буфера, центрифуге при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  5. Выберите требуемый маркера клеточной поверхности мАт, например: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-АРС-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), и CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), готовят мАт-смеси с использованием FACS буфера по каждому фактору разбавления мАт тестировали. Определение настроек затвора с помощью управления изотипа антитела вместе с образцом без пятен.
  6. Добавьте 25 мкл приготовленной смеси мАт-в каждую лунку. Выдержите 20 минут при температуре 20 ° С ± 2, защищенном от света месте.
  7. Добавьте 100 мкл FACS буфера, центрифуге при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  8. Для образцов, когда требуется только поверхностное окрашивание клеток, переходите к выполнению шага 3.16.
  9. В случае окрашивания внутриклеточной Foxp3:
    1. Подготовка фиксации и пермеабилизирующего буфера путем смешивания одной части концентрата с 3-х частей разбавителей.
    2. Приготовьте 1х буфер пермеабилизирующего: 1 часть буфера 10x пермеабилизирующего + 9 частей стерилизованной H 2 O.
  10. Ресуспендируют гранул в 100 мкл фиксации и permeabiliзация буфер, хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
  11. Добавьте 100 мкл буфера пермеабилизирующего в каждую лунку центрифуге при 450 мкг при комнатной температуре в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  12. Вымойте клеток с пермеабилизации буфером еще один раз.
  13. Выберите требуемый внутриклеточные мАт, например, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) и IFN & gamma;-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Готовят смесь мАт с использованием пермеабилизирующего буфера, содержащего 2% сыворотки нормальной крысы, согласно каждому фактору мАт разведений тестируемого. Определение настроек затвора с помощью управления изотипа антитела вместе с образцом без пятен.
  14. Добавьте 20 мкл приготовленной MAB-смеси в каждую лунку. Выдержите в 4 ° С в течение 30 мин, защищенном от света месте.
  15. После 30-минутной инкубации, добавьте 100 мкл пермеабилизации буфера в каждую лунку. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  16. Вымойте клеток с пермеабилизации Buffeг еще один раз. Ресуспендируют осадок в 110 мкл буфера FACS и перенос клеточных суспензий в текущем microFACS трубку.
    Примечание: Образец готов к измерению с использованием 10-цветной проточной цитометрии.
  17. В случае точного количества клеток требуется, добавьте 10 мкл хорошо перемешанной однородной суспензии флуоросфер в каждом образце непосредственно перед выполнением измерений с использованием проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, представленные здесь, даст между 2200 ± 615 (среднее значение ± SEM, кожа здоровых добровольцев) до 178000 ± 760 (среднее значение ± SEM, пораженной кожи пациентов, страдающих псориазом) жизнеспособных лимфоцитов из кожи человека при использовании одного 4 мм биопсии кожи.

Различные типы CD45 + клеток , были идентифицированы в одноклеточных суспензий , полученных из кожи здоровых лиц , включая CD4 + T-клеток (около 45%), CD8 + Т-клетки (~ 30%), и CD11c + контроллеры домена (~ 5% ), в то время как несколько В - клеток (CD19 +), NK - клеток (CD56 + CD3 -), или моноциты / макрофаги (CD14 + или CD1c +) наблюдались (рис 1А). Эта методика также позволяет для анализа CD4 + CD25 + Foxp3 + клеток в биоптатах кожи человека. С помощью внутриклеточного окрашивания после фиксации и проницаемости, можно продемонстрировать экспрессию транскрипции FACтор Foxp3 в CD25 + Т - клеток (Фигура 1А).

Одноклеточные суспензии, полученные из биопсии кожи человека показали высокий автофлюоресценции фон в FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (тихоокеанский синий) и FL10 (хром оранжевый) каналов, используя цитометр (данные не показаны) , Для правильного анализа популяции лимфоцитов, поэтому мы рекомендуем использовать против человеческого CD45 мАт , сопряженную с Brilliant Violet 421 флуорохромом для стробирования популяции лимфоцитов и исключения населения autofluorescent клеток (рис 1B). Большинство резидентных клеток в коже человека были CD3 + Т - клеток (рис 1C). Для анализа жизнеспособности клеток рекомендуется использовать поправимо жизнеспособность красителя , чтобы отличить жизнеспособное от мертвых / отмирающих клеток (рис 1C). Как правило, это результаты протокола на 65,3% ± 7,7 (среднее ± SD) жизнеспособных клеток. Для дальнейшего анализа методом проточной цитометрии данных, то Адвисред к воротам на популяции жизнеспособных клеток, так как мертвые или умирающие клетки теряют свою целостность клеточных мембран, и может не специфически связывать конъюгированного антитела, тем самым увеличивая фоновое окрашивание.

Т-клетки, выделенные этим протоколом хорошо подходят для дальнейшего функционального анализа. Используя один 4 мм биопсии повреждений кожи у пациентов с псориазом, было показано , что биопсия полученные Т - клетки получают IL-17A и IFN & gamma ; следующие 4 ч при стимуляции ФМА / иономицином в присутствии брефелдин А (рисунок 2).

Свежеприготовленные одноклеточной суспензии кожи от вовлеченных псориатических поражений кожи могут быть также использованы для дальнейшего культивирования клеток экс естественных условиях и последующего функционального анализа. После расширения после поликлональной стимуляции с помощью микрошариков анти-CD3 / анти-CD28 моноклональное антитело покрытие в присутствии провоспалительных цитокинов IL-1 или IL-23 в течение 8 дней, клетки могут быть , например, анализируют на их cytokине производственные мощности (рисунок 3). Поступая таким образом, наблюдалось четкое различие между цитокинами производства потенциала клеток, полученных из кожи здоровых и страдающих псориазом лиц. Т-клетки от псориатических индивидуумов показали гораздо более высокий потенциал для производства псориаза ассоциированных цитокинов IL17A и IFN & gamma. Это означает , что даже после того, как экс естественных условиях культуры прототипического фенотип псориаз цитокин сохраняется, отсутствует в случае здоровых людей .

Рисунок 1
Рисунок 1:. Различные типы лейкоцитов идентифицированы в одноклеточных суспензий , полученных из кожи здоровых лиц лимфоцитов резидентных кожи выделяли с использованием протокола , описанного в тексте , окрашивали флуорохромом конъюгированные МАт интерес плюс фиксируемой жизнеспособность красителя и сразу анализировали с помощью проточной цитометрии. (А) Расход ТиЦtometric обнаружение моноцитов (CD14), контроллеры домена (CD11c), В - клетки (CD19), NK - клетки (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + и CD25 + Foxp3 + подмножеств внутри лимфоцитов резидентов кожи. Anti-Human CD45 / BV421 мАт отличает лимфоциты от autofluorescent клеток. Стратегии стробирования , используемые для CD45 + клеток, показан на (В). (C) Процент жизнеспособных CD45 + CD3 + Т - клеток после изоляции. Число показывает процент положительных клеток. Представитель эксперимент из трех различных экспериментов / доноров показано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
На рисунке 2: Т - клетки , полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом может произвоCE IL-17A и IFN & gamma. Один 4 мм биопсия кожи была взята из пораженной кожи псориаза пациента на устно или письменное согласие научного использования. Т-клетки-резиденты кожи были выделены с использованием протокола, описанного в тексте. Производство IL-17A и IFN & gamma; резидентными кожи Т-клеток. Внутриклеточное накопление цитокинов в ответ на 4 ч при стимуляции ФМА / иономицином в присутствии брефелдин А измеряли с помощью проточной цитометрии. Процент цитокин-положительных клеток показана. Данные трех разных пациентов показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Кожные резидентные Т - клетки способны производить IL-17A и IFN & gamma ; следуя ех естественных условиях а) или IL-23 (50 нг / мл, B) в течение 8 дней. Затем клетки стимулировали в течение 4 ч с РМА / иономицин в присутствии брефелдин А и после этого анализировали на содержание внутриклеточной продукции цитокинов с помощью проточной цитометрии. Характерным примером из трех независимых экспериментов / доноров показано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы приводим протокол, чтобы эффективно изолировать резидентные кожи Т-клеток из биопсий кожи человека. Преимуществом этого протокола является выделение относительно большого числа жизнеспособных лимфоцитов, экспрессирующих и соответствующие поверхностные маркеры. Подмножества клеток были идентифицированы: CD11c + DCs, клетки CD4 + и CD8 + Т - клетки и Foxp3 + CD25 +. Важно отметить, что экс естественных условиях культуры изолированных резидентов кожи Т - клеток было очень хорошо осуществимо и позволил для последующего функционального анализа.

Человеческой кожи могут быть диссоциированы в одноклеточных суспензий путем объединения механической диссоциации с ферментативным разрушением внеклеточного белков адгезии, которые функционируют, чтобы поддерживать структурную целостность тканей. Хотя диспаза разделительный слой на основе эпидермиса и дермы является широко используемым методом для определения инфильтрации клеток в этих соответствующих слоях кожи, мы заметили, что диспаза лечение привело тгабаритная значительное снижение клеточной поверхности экспрессии CD25 и CD27 (не показан). Поскольку эти маркеры имеют важное значение для характеристики субпопуляций лимфоцитов, мы полагаем, что диспазу влияет на лечение последующее иммунофенотипирование. Это не вероятно , что удаление дермы отвечает за наблюдаемое сокращение CD25 или CD27 , экспрессирующих клеток, так как в коже здоровых людей , большинство Т - клеток , локализованных в дерме в то время как число минут Т - клеток присутствуют в эпидермисе 10 -12. Вредное воздействие диспаза на способности пролиферации кератиноцитов изолированных сообщалось ранее 13. Таким образом, рациональное использование диспазу является оправданным, если функции клеток является целью исследования. В нашем протоколе мы используем тип коллагеназы I для получения одноклеточной суспензии биопсии кожи. Хотя коллагеназы I обладает высокой триптические активностью по сравнению с коллагеназы IV и, таким образом, является более жестким, мы выбрали именно эту коллагеназы, так как он был тэSTED для его пригодности для культивирования клеток. Использование коллагеназы IV, который подходит для культивирования клеток может быть следующим шагом для дальнейшей оптимизации нашего текущего протокола.

Благодаря своему характеру, кожа обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации. До сих пор, всесторонний анализ иммунных клеток в коже человека была затруднена техническими проблемами при получении достаточного количества клеток при использовании относительно жесткие протоколы с пищеварением. Как следствие, в большинстве исследований, опубликованных на сегодняшний день полагаться на иммуногистохимических анализов. Прямое выделение CD4 + Т - клеток из биопсии кожи , как правило , считается громоздкой. Альтернативой было бы использование эксплантов кожи вылезут культуры 10. Тем не менее, это занимает 2-3 недели культуры, а также питательная среда эксплантов кожа содержит набор, выбранный из цитокинов и хемокинов, что может привести к преимущественному выползают конкретных подгрупп Т-клеток. Кроме того, период культивирования может затрагиваемт фенотип клеток. Текущий протокол не использует добавленных цитокинов или хемокинов и экспрессии CD4 (а также других клеточных маркеров) хорошо сохраняется после изоляции, что позволяет как фенотипические и функциональное исследование популяций Т-клеток непосредственно после выделения.

Имеющийся в продаже автоматизированная Диссоциатор ткань используется для диссоциации фрагментов кожи до их инкубации с коллагеназой, требуемой для деградации внеклеточного матрикса. Для последующего высвобождения клеток из межклеточного матрикса, автоматизированный Диссоциатор снова используется. Хотя обширное руководство по резки кожи может дать аналогичные количества клеток (данные не показаны), результаты менее последовательными и в большей степени зависят от опыта исполнителя. Разобщение кожи с использованием предварительно определенная процедура, предлагаемый инструмент даст гораздо более воспроизводимые результаты. В соответствии с предыдущими исследованиями, показавшими, что кожа содержит различные лeukocytes подмножеств 2,14, CD11c + DCs, CD8 + и CD4 + Т - клеток, и FOXP3 + клетки были обнаружены в популяциях одноклеточных , подготовленных в соответствии с протоколом , представленной здесь. Важно отметить, что протокол дает относительно высокий выход жизнеспособных лимфоцитов. Из-за эффективности протокола, он особенно полезен при изучении материала пациента, где часто можно получить лишь один 4 мм биопсии кожи. Используя метод, мы смогли показать , что Т - клетки , выделенные из кожи пораженной больных псориазом показали более высокий потенциал для производства IL-17A и IFN & gamma ; по сравнению с здоровой кожи 9.

В зависимости от вопроса исследования, это может быть необходимо для дальнейшей очистки определенных подмножеств клеток после получения одноклеточных суспензий. В этом случае, более крупные куски кожи могут быть использованы для обеспечения выхода достаточное количество клеток для анализа подмножеством. При этом убедитесь, что кожа должна быть разрезан на более мелкие пиECES в размере около 2 мм х 2 мм перед началом протокола изоляции.

В заключение отметим, что настоящий протокол предлагает улучшенный способ выделения клеток-резидентов кожи, облегчения значимого фенотипического и функционального анализа на уровне одной клетки, тем самым улучшая нашу понимание в коже иммунных реакций.

Критические шаги в текущем протоколе являются надлежащее удаление подкожной жировой ткани и раскрой кожи на более мелкие куски, особенно при обработке более одной биопсии в диссоциации трубки. Жировая ткань и / или большие куски ткани заставит Диссоциатор работать неправильно, требуя повторных запусков. Это позволит нанести серьезный ущерб жизнеспособности клеток. Ограничением метода является то, что число клеток, полученных из одной биопсии кожи 4 мм недостаточно для последующего выделения подмножеств клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

биопсии кожи у пациентов с псориазом были любезно предоставлены доктором Андреасом Koerber (дерматологии отдела в Университете г. Эссен, Германия) после устного или письменного информированного согласия для научного использования.

XH также поддерживается NSFC 61263039 и 11101321 NSFC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics