表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

人間の皮膚は重要なバリア機能を有しており、病原体からの組織の恒常性と保護に貢献様々な免疫細胞が含まれています。肌がアクセスすることは比較的容易であるように、それは末梢免疫制御メカニズムを研究するための理想的なプラットフォームを提供します。免疫常駐健康な皮膚行動免疫監視中の細胞だけでなく、乾癬のような炎症性皮膚疾患の発達において重要な役割を果たしています。新興洞察力にもかかわらず、様々な炎症性皮膚疾患の根底にある生物学の我々の理解はまだ限られています。生検皮膚試料から単離された良質な(単一)細胞集団が必要です。これまでに、単離手順は、深刻な生存細胞の十分な数を得ることの欠如によって妨げられてきました。単離およびその後の分析にも得ることが、現在の解離手順によって引き起こされる機械的及び化学的ストレスに起因する免疫細胞系統マーカーの損失の影響を受けています単一細胞懸濁液。ここでは、自動化された組織の解離及びコラゲナーゼ処理を用いた機械的皮膚解離を組み合わせることにより、健康と関係する両方の乾癬のヒト皮膚からT細胞を単離するために修正された方法を記載します。この方法は、単一細胞懸濁液を調製する際に、このようなCD4、CD8、Foxp3をおよびCD11cなど、ほとんどの免疫系統マーカーの発現を保持します。成功したCD4 + T細胞の単離およびその後の表現型および機能的分析の例が示されています。

Introduction

皮膚は、身体と環境との間の主要なインタフェースとして、外部からの物理的、化学的、およびそのような創傷、紫外線や微生物などの生物学的傷害に対する防御の最初の行を提供します。皮膚は、主に2つのコンパートメント、表皮と真皮を含み、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、樹状細胞(DC)、および約200億メモリーT細胞を含む免疫細胞の様々な含まれ、全体の血液量1、ほぼ2倍の数の本、2。データの成長体は、皮膚が組織の恒常性の間、および様々な病理学的状態の両方で、本質的な免疫学的機能を持っているという概念をサポートしています。正常な皮膚内に存在する免疫細胞を、免疫学的監視3を実施するために考えられ、例えば、乾癬4のような炎症性疾患の発症において役割を果たすことが示されています。乾癬病変皮膚では、CD4 +およびCD8 +の両方のT細胞がOBSた浸潤しましたervedそれはCD4とCD8の比率は、疾患状態5に応じて変化することが示されました。しかし、細胞のこの集団は、既存の技術は、ほんのわずかの細胞の単離を可能にするため、研究するのが困難です。

ヒトの皮膚からのT細胞の単離のために現在広く用いられている技術は、酵素処理と機械的に皮膚解離を兼ね備えています。ヒトの皮膚生検は、広範囲に刻み、トリプシン、コラゲナーゼおよび/ ​​またはEDTA 6-8のような酵素でインキュベートします。皮膚は、引張力および機械的分解に非常に抵抗性であるバリア組織であることを考慮すると、T細胞の単離の確立された方法は、これらの細胞集団の困難およびex vivo細胞培養を行い、非常に少数の細胞および生細胞のより低い番号を生成します挑戦。

ここでは、mechanを組み合わせることにより、健康で関与両方乾癬ヒトの皮膚からリンパ球を単離するための改良法を報告します酵素消化は、コラゲナーゼを使用して一緒に、自動化された組織の解離の代わりに広くミンチの確立された方法を用いて、皮膚のiCalの解離。 DCおよびT細胞を含む種々の生存免疫細胞サブセットを、単一細胞懸濁液の調製後に観察されました。重要な表面マーカーCD3、CD4とCD8の発現がよく保存されていました。このようにして調製した細胞は、ex vivoでの細胞培養またはフローサイトメトリー分析に使用するための準備ができています。このプロトコルは、正常乾癬患者の病変皮膚に由来する単一の皮膚生検(4 mm)での分析のために使用されています。その結果、皮膚常駐患者のT細胞は、健康なボランティア9と比較して、IL-17及びIFNγのような多くの炎症性サイトカインを産生することを示しました。

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Protocol

注:健康な個体からの皮膚生検は、科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に選択科目整形手術を受けている個体の腹部の皮膚の残りから得ました。人間の皮膚の使用が承認されたラートボウト大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ、エッセン、ドイツの大学の人間の研究のための医学倫理委員会によって設定された規則に従ってインチ

ヒト皮膚からの単一細胞懸濁液の調製(フローキャビネット内の作業滅菌後、細胞培養物がある場合は必須)

  1. 細胞培養培地を準備していない血清を含むRPMI 1640 +ペニシリン/ストレプトマイシン(ml最終濃度100単位/および100μg/ mlの、それぞれ)+ピルビン酸(0.02ミリモル)およびグルタマックス(0.02 mM)を、追加されました。
  2. 完全培地を準備します。ステップ1.1 + 10%のヒトプール血清(HPS)で調製した培地; 4℃で保存します。私たちの前に20℃±2にメディアを持参る。
  3. 4ミリメートルラウンド生検パンチ装置を用いて皮膚生検を取得し、最大4時間、または4℃でONで20℃±2でRPMI1640完全培地に保管してください。実験室での到着時にできるだけ早く生検を処理します。
    注:皮膚の長期保存は、細胞収量および細胞生存率に影響を与えます。
  4. ブルーキャップされた解離管にラベルを付け、ラベルされたチューブに5ミリリットルを完全培地を追加します。
  5. 無菌の6ウェル培養プレート(合計3つのウェル中)を各ウェルに完全培養培地2mlを加えます。このように3回のすすぎの合計を達成し、1つのより多くの時間を、単一のウェルに生検を配置するために、無菌のツールを使用してすすぎ、第2のウェルにそれを上に移動し、このステップを繰り返します。
  6. 滅菌シャーレによくすすぎ、皮膚生検を移し生検の上に完全培養培地100μlを追加し、慎重にステンレス鋼使い捨ての滅菌メスを使用して、皮下脂肪組織を削り取ります。
    注:番目重要なステップです。
  7. 滅菌ペトリ皿上の4小片に各皮膚生検をカット。転送サンプル(最大チューブあたり、4mmの生検の4つの)完全培養培地5mlを含有する準備解離管に。
  8. しっかりとキャップでチューブを閉じ、自動化された組織の解離のスリーブに上下逆さまに取り付けます。すべてのサンプル材料をロータのエリアに位置していることを確認します。
  9. 56秒間の適切な回転速度で生検を解離するために「プログラムm_spleenの_01」(計測器の内蔵メモリにより、または伴うプログラムカードが提供する事前定義されたプログラム)を実行することにより、解離プロセスを開始します。
  10. 処理の後、解離から解離管を切り離し、すべての解離した材料は、チューブの底に収集されていることを確認してください。
  11. 解離チューブに150μlのコラゲナーゼIA(80 mg / mlで)を加え、37℃で振とう水浴中でサンプルをインキュベート60分間°C。よく混ぜ、thedissociationチューブにDNアーゼI(5 MU / ml)を100μlのを追加します。
    注:コラゲナーゼのより高い濃度またはより長いインキュベーション時間は、細胞生存率を変化させます。
  12. 自動化された組織の解離のスリーブに解離管を取り付け、生検1つのより多くの時間を解離するために「 プログラムM_脾臓_01」を実行します。
  13. 50ミリリットルファルコンチューブの上に70μMナイロン細胞ストレーナーを配置します。細胞塊/組織片を除去するために、このセルストレーナーに解離した試料材料を適用します。
  14. 完全培地の5ミリリットルで一回セルストレーナーを洗浄します。 20°C±2で遠心し、10分と吸引上清のための450×gで。
  15. 洗浄工程をもう一度繰り返します。完全培養培地300μlの中に再懸濁し、細胞ペレット。単一細胞懸濁液は、さらなる分析のために準備ができています。 ex vivoでの細胞培養のためのプロトコルを続行するか、フローサイトメトリー分析。
  16. さらに私の場合、ntracellularサイトカイン染色は、37℃で4時間、PMA(12.5 NG /ミリリットル)、イオノマイシン(500ngの/ ml)およびブレフェルジンA(5μg/ ml)で細胞を刺激し、5%CO 2インキュベーターフローを実行する前に4時間フローサイトメトリー分析。

皮膚常駐T細胞の2ポリクローナル活性化(ex vivoで細胞培養)

  1. アリコート(ステップ1.15で調製した)100μlの単一細胞懸濁液を、丸底96ウェルプレートに。
    注:4mMの皮膚生検のそれぞれについて、取得された単一細胞懸濁液を96ウェルプレートのうちの少なくとも2つのウェルに分割することができます。
  2. 抗CD3 /抗CD28 mAbで被覆したマイクロビーズ(ウェル当たり25,000ビーズ)、組換えヒトサイトカインのrIL-2(最終濃度25 U / ml)およびのrIL-1β(最終濃度50 ngの/ mlで)を加えます。
  3. ウェル標識プレートの蓋で培養プレートをカバーし、5%CO 2、100%湿度でインキュベートし、37 Cのインキュベーター°。培地の色が黄色になるとメディアを変更します。

プライマリ/培養皮膚常駐T細胞の3フローサイトメトリー分析

  1. PBS + 0.2%BSA:FACS緩衝液を準備します。
  2. V底96ウェルプレートに、目的とする細胞を転送します。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  3. 100μlのPBSにペレットを再懸濁。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  4. 4℃で30分間:(PBSを使用して、千希釈1)固定可能な生存可能性色素を結合させ準備eFluorescence780100μlの染色細胞。 FACS緩衝液100μl、20℃±2で遠心分離機、2分、および吸引上清450 XGを追加します。
  5. 例えば、必要な細胞表面マーカーのmAbを選択:CD45-BV421(HI30、1時20分)、CD3-ECD(UCHT1、午前1時50分)、CD4-PC5.5(1388.2、1:200)、CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11、1:400)、CD14-FITC(TUK4、1時50分)、CD19-APC-AlexFluo750(13から1191:50)、CD56-PE(MEM-188、1:50)、CD25-PeCy7(BC96、1時50分)、のCD11c-PeCy7(BU15、1:10)、およびCD1c-APC(AD5-8E7、 1:10)、テストした各mAbの希釈率に応じて、FACS緩衝液を使用したmAb-混合物を準備します。非染色サンプルと一緒に、抗体のアイソタイプコントロールを使用して、ゲートの設定を定義します。
  6. 各ウェルに準備したmAb-混合物の25μlのを追加します。光から保護し、20℃±2で20分間インキュベートします。
  7. FACS緩衝液100μl、20℃±2で遠心分離機、2分、および吸引上清450 XGを追加します。
  8. 唯一の細胞表面染色を必要とするサンプルについては、ステップ3.16に進みます。
  9. 細胞内のFoxp3染色の場合:
    1. 希釈剤の3部で濃縮物の一部を混合することによって固定し、透過処理バッファーを準備します。
    2. 10倍の透過化バッファの1部+滅菌H 2 Oの9部:1×透過処理バッファーを準備します
  10. 固定とpermeabiliの100μl中に再懸濁ペレット化バッファは、よく混ぜ、および4でインキュベート 30分間°C。
  11. 各ウェルに450 2分間、室温でXG、および吸引上清で遠心分離機を100μlの透過化バッファを追加します。
  12. 透過化バッファ1より多くの時間で細胞を洗浄。
  13. 例えば、必要な細胞内のmAbを、選択し、Foxp3を-eFluo450(PCH1​​01、1:50)、IL-17A-AlexFluo488(eBio64DEC1、1:50)およびIFNγ-PeCy7(4S.B3、1:400)。テストした各mAbの希釈倍率に応じて、2%正常ラット血清を含む透過化緩衝液を用いてモノクローナル抗体の混合物を準備します。非染色サンプルと一緒に、抗体のアイソタイプコントロールを使用して、ゲートの設定を定義します。
  14. 各ウェルに準備したmAb-混合物の20μlのを追加します。 4インキュベート 30分間°Cで、光から保護します。
  15. 30分間のインキュベーション後、各ウェルに透過化緩衝液100μlを加えます。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  16. 透過性のブフェで細胞を洗浄R 1のより多くの時間。再懸濁し、FACS緩衝液の110μlのでペレット、およびmicroFACSチューブに細胞懸濁液を転送します。
    注:サンプルは、10色のフローサイトメトリーを用いた測定の準備ができています。
  17. 必要とされる正確な細胞数の場合には、直ちにフローサイトメトリーを用いて測定を行う前に、各試料中に蛍光粒子の十分に混合された均一な懸濁液10μlを追加します。

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Representative Results

単4ミリメートルの皮膚生検を使用している場合、ここで提示されたプロトコルは、ヒトの皮膚から(±SEM、乾癬患者の病変皮膚を意味する)760±178,000まで(±SEM、健康なボランティアの皮膚を意味する)615±2200の間に実行可能なリンパ球を得られます。

CD45 +細胞の異なる種類はCD4 + T細胞(〜45%)、CD8 + T細胞(約30%)を含む、健康な個体の皮膚に由来する単一細胞懸濁液中で同定、およびCD11c +樹状細胞(約5%でした)、いくつかのB細胞(CD19 +)のに対し、NK細胞(CD56 + CD3 - )、または単球/マクロファージ(CD14 +またはCD1c +)は、( 図1A)が観察されました。方法はまた、ヒト皮膚生検におけるCD4 + CD25 +のFoxp3 +細胞の分析を可能にします。固定及び透過化の後に細胞内染色を用いることにより、転写FACの発現を実証することが可能ですCD25 + T細胞中のFoxp3器( 図1A)。

ヒトの皮膚生検に由来する単細胞懸濁液(データは示さず)FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(ECD)、FL9(パシフィックブルー)とFL10(クロムオレンジ)サイトメーターを使用して、チャネル内の高い自己蛍光バックグラウンドを示しました。 。リンパ球集団の適切な分析のために、我々は、したがって、自己蛍光細胞集団( 図1B)のリンパ球集団と除外のゲーティングのためのブリリアントバイオレット421蛍光色素と結合した抗ヒトCD45モノクローナル抗体を使用することをお勧めします。ヒトの皮膚内に存在する細胞の大部分は、CD3 + T細胞( 図1C)でした。細胞生存率分析のために、死んだ/死細胞( 図1C)から実行可能な区別するために固定可能な生存可能性色素を使用することをお勧めします。 7.7(平均±SD)生細胞±65.3パーセントで典型的には、このプロトコルは結果。フローサイトメトリーデータのさらなる分析のために、それはadvisあります死亡または瀕死の細胞がその細胞膜の完全性を失うので、生存細胞集団のゲートに編、及び非特異的それによってバックグラウンド染色を増加させ、結合抗体に結合することができます。

このプロトコルによって単離されたT細胞は、さらに、機能解析に適しています。乾癬患者の病変皮膚の単一の4mm生検を用いることにより、生検由来のT細胞は、ブレフェルジンAの存在下で、PMA /イオノマイシンで4時間刺激し図2)は、次のIL-17AおよびIFNγを産生することが示されました。

関与乾癬皮膚病変から新たに調製した単一細胞皮膚懸濁液は、 エキソビボ細胞培養およびその後の機能解析のために使用することもできます。 8日間の炎症誘発性サイトカインIL-1βまたはIL-23の存在下で、抗CD3 /抗CD28 mAbで被覆したマイクロビーズとのポリクローナル刺激後の膨張に続いて、細胞は、 例えば、それらのcytokについて分析することができますINE容量( 図3)を生成します。そうすることによって、健康および乾癬個体の皮膚由来細胞のサイトカイン産生の可能性との間に明確な差が認められました。乾癬個体からのT細胞は、乾癬関連サイトカインIL17AとIFNγを生成する非常に高い能力を示しました。これはあってもex vivoでの培養後の原型乾癬サイトカイン表現型が存在しない健常対照の場合には、維持されることを意味します。

図1
図1:白血球の異なるタイプがテキストで記述されたプロトコルを用いて単離し、健康な個体の皮膚常在リンパ皮膚に由来する単一細胞懸濁液中で同定され、目的に加えて固定可能生存色素の蛍光色素結合mAbで染色し、直ちにによって分析しましたフローサイトメトリー。 (A)フローCY、CD4 +、CD8 +およびCD25 + Foxp3の皮膚常在リンパ球内の+サブセット-単球(CD14)、樹状細胞(CD11cの)、B細胞(CD19)、NK細胞(CD56 + CD3)のtometric検 ​​出。抗ヒトCD45 / BV421 mAbが自己蛍光細胞からリンパ球を区別します。 CD45 +細胞のために使用されるゲーティング戦略は、(B)に示されています。分離後の生存可能なCD45 + CD3 + T細胞の(C)の割合。番号は、陽性細胞の割合を示します。三つの異なる実験/ドナーのうち代表的な実験が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:乾癬患者の病変皮膚由来のT細胞はproduのことができますCEのIL-17AおよびIFNγ。単4ミリメートルの皮膚生検は、経口的または科学的な使用のためのインフォームドコンセントを書かれた時に乾癬患者の病変皮膚から採取しました。皮膚常在T細胞を、本文中に記載のプロトコールを用いて単離しました。皮膚常在T細胞によるIL-17AおよびIFNγの産生。ブレフェルジンAの存在下で、PMA /イオノマイシンで4時間刺激に応答したサイトカインの細胞内蓄積をフローサイトメトリーによって測定しました。サイトカイン陽性細胞の割合が示されています。 3人の異なる患者のデータが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:皮膚常駐T細胞は 、ex vivoで 、次のIL-17AおよびIFNγを生成することが可能です 、A)またはIL-23(50 ng / mlで、B)8日間刺激しました。次に、細胞を、ブレフェルジンAの存在下で、PMA /イオノマイシンで4時間刺激し、その後、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン産生について分析しました。 3つの独立した実験/ドナーのうち代表的な例が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、効率的にヒトの皮膚生検からの皮膚常在T細胞を単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの利点は、実行可能なリンパ球の比較的高い数の分離であり、関連する表面マーカーを発現します。同定された細胞のサブセットは以下の通りであった:たCD11c + DCは、CD4 +およびCD8 + T細胞とのFoxp3 + CD25 +細胞。重要なのは、孤立した皮膚常在T細胞のex vivoでの文化は非常によく実現可能だったとその後の機能解析を可能にしました。

ヒトの皮膚は、組織の構造的完全性を維持するために機能する細胞外接着タンパク質の酵素分解と機械的に解離を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。表皮と真皮のディスパーゼベース層分離は、これらのそれぞれの皮膚層に細胞浸潤を決定するために広く用いられている方法ですが、私たちは、ディスパーゼ処理がトンを主導していることに気づきましたOA CD25およびCD27の細胞表面発現の主要な減少(図示せず)。これらのマーカーは、リンパ球サブセットを特徴付けるために重要であるように、我々はディスパーゼ治療がその後の免疫表現に影響を​​与えると信じています。微小T細胞数は、表皮10内に存在している間、真皮の除去は、T細胞の大部分が真皮に局在する健常個体の皮膚であるため、CD25またはCD27を発現する細胞中で観察された減少の原因である可能性がありません-12。単離されたケラチノサイトの増殖能力にディスパーゼの有害な影響は、これまで13が報告されています。細胞機能が研究の目的である場合はそのため、ディスパーゼの慎重な使用が保証されています。我々のプロトコルでは、我々は、私は皮膚生検の単一細胞懸濁液を得るために、コラゲナーゼタイプを使用してきました。コラゲナーゼ私はコラゲナーゼIVと比較して高いトリプシン活性を有し、したがって、より厳しいですが、それはテされているため、我々は、この特定のコラゲナーゼを選択しました細胞培養のためのその適合性についてSTED。細胞培養に適してコラゲナーゼIVの使用は、私たちの現在のプロトコルを最適化するために、将来のステップかもしれません。

その性質上、皮膚は、引張力および機械的分解に非常に耐性があります。これまで、ヒトの皮膚における免疫細胞の包括的な分析は、比較的過酷な消化プロトコルを使用する場合に十分な細胞数を得るために技術的な課題によって妨げられてきました。その結果、現在までに公開されたほとんどの研究は、免疫組織化学的分析に依存しています。皮膚生検からのCD4 + T細胞の直接単離は、一般的に面倒と考えられています。代替手段は、皮膚外植クロールアウト文化10の使用であろう。しかし、これらは、培養2〜3週間を取り、皮膚移植片培養培地は、特定のT細胞サブセットのうち優先クロールにつながる可能性サイトカインおよびケモカインの選択されたセットを、含まれています。また、培養期間はaffec可能性があります細胞の表現型をtは。現在のプロトコルは、表現型と直接分離後のT細胞集団の機能的研究の両方を可能にする追加されたサイトカインまたはケモカイン、およびCD4(および他の細胞マーカー)の発現も分離後に保存され、使用しません。

商業的に入手可能な自動化された組織の解離、分解、細胞外マトリックスに必要なコラゲナーゼとのインキュベーションの前に皮膚断片の分離のために使用されます。細胞外マトリックスからの細胞のその後のリリースでは、自動化された解離が再び使用されます。皮膚の広範囲マニュアルカット(データは示されていない)類似の細胞数を得ることができるが、結果はあまり一致しており、演奏者の経験に大きく依存しています。機器によって提供される事前定義された手順を使用して皮膚の解離はより再現性のある結果が得られます。皮膚はさまざまなリットルが含まれていることを示した以前の研究と一致eukocytesは2,14、のCD11c + DCは、CD8 +およびCD4 + T細胞サブセット、およびのFoxp3 +細胞を、ここに提示されたプロトコルによって調製し、単一の細胞集団で観察されました。重要なのは、プロトコルが実行可能なリンパ球の比較的高い収率をもたらします。原因プロトコルの効率性のために、それは、単一の、4mmの皮膚生検を得ることができ、多くの場合、患者の材料を、特に有用で研究します。この方法を用いて、乾癬患者の病変皮膚から単離されたT細胞は、健康な皮膚9と比較して、IL-17AおよびIFNγを産生する高い能力を示したことを示すことができました。

調査の質問に応じて、さらに、単一細胞懸濁液を調製した後、特定の細胞サブセットを精製する必要があるかもしれません。この場合には、皮膚の大きな片はサブセットの分析のために十分な細胞の収量を確保するために使用することができます。その際、皮膚はより小さなパイにカットされるべきであることを確認してください単離プロトコールを開始する前に、X 2ミリメートルの周りの2ミリメートルのECES。

結論では、本プロトコルは、それによって皮膚の免疫応答で私たちの洞察力を向上させる、単一細胞レベルで意味のある表現型および機能解析を容易にする、皮膚常在細胞を分離するための改良方法を提供しています。

現在のプロトコルでの重要なステップは、解離管に複数の生検を処理する場合は特に、皮下脂肪組織と小さな部分に皮膚の切断を適切に除去されています。脂肪組織および/または大規模な組織片を再実行を求め、解離が正しく動作するようになります。これは真剣に細胞生存率に悪影響を与えるだろう。技術の限界は、単一の、4mmの皮膚生検に由来する細胞数は、細胞のサブセットのその後の単離のために十分ではないということです。

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Acknowledgements

乾癬患者からの皮膚生検を親切に科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に博士アンドレアスKoerber(エッセン、ドイツの大学の皮膚科部門)によって提供されました。

XHはまた、NSFC 61263039とNSFC 11101321でサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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