Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 + e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.

Introduction

A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue 1 , 2. Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em várias condições patológicas. Células imunes residentes na pele normal são pensados ​​para conduzir imunovigilância e 3 têm demonstrado desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como psoríase 4. Na pele lesionada psoriática, tanto CD4 + e CD8 + foram infiltradas células T observed e foi demonstrado que a razão entre a CD4 e CD8 varia dependendo do estado da doença 5. No entanto, estas populações de células são difíceis de estudar porque as técnicas existentes permitem o isolamento de apenas algumas células.

As técnicas atualmente utilizados para o isolamento de células T a partir de pele humana combinam dissociação da pele mecânica com tratamento enzimático. As biópsias da pele humana são extensamente triturada e incubada com enzimas como a tripsina, colagenase e / ou EDTA 6-8. Considerando-se que a pele é um tecido de barreira, que é altamente resistente a forças de tracção e de desagregação mecânica, os métodos estabelecidos de isolamento de células T produzido muito poucas células, e até mesmo menor número de células viáveis, o que torna a cultura ex vivo de células destas populações de células difíceis e desafiador.

Aqui, nós relatamos um método modificado para isolar linfócitos de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação mechanical dissociação da pele usando um Dissociator tecido automatizada em vez do método estabelecido de picagem extensivamente, em conjunto com a digestão enzimática com colagenase. Vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo as DCs viáveis ​​e células T foram observadas após a preparação de uma suspensão de célula única. É importante notar a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8 foi bem preservada. As células assim preparadas, estão prontos para uso em culturas de células ex vivo ou análise de citometria de fluxo. Este protocolo tem sido empregue com sucesso para a análise de biópsias de pele individuais (4 mm) derivadas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase. Os resultados mostraram que as células T do paciente de pele residente produzido mais citocinas inflamatórias como a IL-17 e IFN-y, em comparação com voluntários saudáveis ​​9.

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Protocol

NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis ​​foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha.

1. Preparação de suspensões de células individuais de Pele Humana (Trabalho estéril em um Fluxo de-gabinete se Cultura de Células posterior é necessária)

  1. Prepare meio de cultura celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentrações finais de 100 unidades / mL e 100 ug / ml, respectivamente) + piruvato (0.02 mM) e Glutamax (0,02 mM), sem soro adicionado.
  2. Prepare meio de cultura completo: meio de cultura preparado no passo 1.1 + 10% de soro humano (HPS); Armazenar a 4 ° C. Traga médio a 20 ° C ± 2 antes de nósing.
  3. Obter a biópsia de pele com um instrumento redondo 4 milímetros biópsia por punção e mantê-lo no meio de cultura RPMI 1640 completo a 20 ° C ± 2 até 4 horas ou a 4 ° C EM. Processar a biópsia, o mais rapidamente possível após a chegada ao laboratório.
    NOTA: um armazenamento mais prolongado da pele vai influenciar o rendimento das células e viabilidade celular.
  4. Marcar um tubo de dissociação azul-tampado e adicionar 5 ml de meio de cultura completo para o tubo rotulado.
  5. Adicionar 2 ml de meio de cultura completo a cada poço (num total de 3 cavidades) de uma placa de cultura de 6 poços estéril. Use ferramentas estéreis para colocar a biópsia em um único poço, lavar, mova-o para um segundo poço e repetir este passo mais uma vez, conseguindo assim um total de três lavagens.
  6. Transferir a biópsia da pele bem lavado com uma placa de Petri estéril, adicionar 100 uL de meio de cultura completo no topo da biópsia, e raspar cuidadosamente o tecido gordo subcutâneo utilizando-se um bisturi de aço inoxidável estéril descartável.
    NOTA: Thé é um passo crítico.
  7. Corte cada biópsia da pele em 4 pedaços menores em uma placa de Petri estéril. amostras de transferência (até quatro biópsias de 4 mm por tubo) para o tubo de dissociação preparadas contendo 5 ml de meio de cultura completo.
  8. Feche bem os tubos com a tampa, e anexar cabeça para baixo para a manga da Dissociator tecido automatizado. Certifique-se de que todo o material de amostra está localizado na área do rotor.
  9. Iniciar o processo de dissociação, executando o "_01 programa m_spleen" (um programa pré-definido fornecida pela memória interna do instrumento ou pelo cartão de programa, acompanhado) dissociar a biópsia na velocidade de rotação apropriada para 56 seg.
  10. Após o processamento, retire o tubo de dissociação do Dissociator e certifique-se que todo o material dissociado é recolhido na parte inferior do tubo.
  11. Adicionar 150 ul de colagenase IA (80 mg / ml) para dentro do tubo de dissociação e incubar a amostra num banho de água com agitação a 37° C durante 60 min. Adicionar 100 ul de ADNase I (5 mU / ml) para dentro do tubo thedissociation, misturar bem.
    NOTA: Maior concentração de colagenase ou tempo de incubação vai alterar a viabilidade celular.
  12. Fixe o tubo de dissociação para a manga da Dissociator tecido automatizada e execute o programa "m_ baço _01" dissociar a biópsia mais uma vez.
  13. Coloque um coador de células de nylon de 70 | iM no topo de um tubo Falcon de 50 ml. Aplicar materiais de amostra dissociados para este filtro celular para remover os detritos aglomerados de células / tecido.
  14. Lavar uma vez com filtro de células 5 ml de meio de cultura completo. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min e o sobrenadante aspirado.
  15. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Ressuspender as peletes de células em 300 ul de meio de cultura completo. uma única célula suspensões estão prontos para uma análise mais aprofundada; continuar com protocolos para a cultura de células ex vivo ou citometria de fluxo.
  16. Em caso de mais icoloração de citocinas ntracellular, estimular as células com PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) e Brefeldine A (5? g / ml) durante 4 hr a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas antes de executar o fluxo análise de citometria.

2. Polyclonal ativação das células T da Pele-residente (Ex Vivo de Cultura Celular)

  1. Alíquotas de suspensões de células únicas de 100 ul (preparado no passo 1.15) numa placa de fundo redondo de 96 poços.
    NOTA: Para cada biópsia de pele de 4 mm, as suspensões unicelulares adquiridos pode ser dividida em, pelo menos, duas cavidades de uma placa de 96 poços.
  2. Adicionar anti-CD3 / microesferas anti-CD28 mAb-revestidas (25.000 grânulos por poço), citocina recombinante humano de rIL-2 (concentração final de 25 U / ml) e rIL-1p (concentração final de 50 ng / ml).
  3. Cobrir a placa de cultura com uma tampa de placa bem marcado, incubar em 5% de CO2, 100% de humidade, 37 ° C incubadora. Alterar médio quando a cor média vira para amarelo.

3. citometria de fluxo de primário / cultivadas células da pele Residente T

  1. Preparar tampão de FACS: PBS + 0,2% de BSA.
  2. Transferir células de interesse em uma placa de 96 poços de fundo em V. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  3. Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  4. As células são coradas com 100 ul de eFluorescence780 preparados conjugados corante de viabilidade fixável (1: 1000 de diluição utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  5. Escolha mAbs marcador da superfície celular necessárias, por exemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), preparar os mAbs-mistura, utilizando tampão FACS de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha.
  6. Adicionar 25 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar 20 min a 20 ° C ± 2, proteger da luz.
  7. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  8. Para amostras que exigem apenas coloração da superfície celular, continue com o passo 3.16.
  9. No caso da coloração de Foxp3 intra-celular:
    1. Preparar tampão de fixação e permeabilização através da mistura de uma parte do concentrado com 3 partes de diluentes.
    2. Prepare tampão de permeabilização 1x: 1 parte de 10x permeabilização tampão + 9 partes de H 2 O. esterilizado
  10. Ressuspender as pelotas em 100 ul de fixação e permeabilitampão zação, misture bem, e incubar a 4 ° C durante 30 min.
  11. Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização a cada poço, centrifugar a 450 xg à temperatura ambiente durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  12. Lavar as células com tampão de permeabilização mais uma vez.
  13. Escolha mAbs intracelulares necessário, por exemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e de IFN-y-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Prepare a mistura de mAbs utilizando tampão de permeabilização contendo soro normal de rato 2% de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha.
  14. Adicionar 20 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar a 4 ° C durante 30 min, proteger da luz.
  15. Após 30 min de incubação, adicionar 100 ul de tampão de permeabilização em cada poço. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  16. Lave as células com buffe permeabilizaçãoR mais uma vez. Ressuspender sedimento em 110 ul de tampão de FACS, e suspensões de células para dentro do tubo de transferência microFACS.
    NOTA: A amostra está pronta para a medição usando 10 cores citometria de fluxo.
  17. No caso do número de células exato necessário, adicione 10 ml de suspensão uniforme bem misturado de fluoroesferas em cada amostra imediatamente antes de realizar medições de citometria de fluxo.

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Representative Results

O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis ​​de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm.

Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 + (~ 30%) e CD11c + DC (~ 5% ), enquanto que as células B (alguns CD19 +), células NK (CD56 + CD3 -), ou de monócitos / macrófagos (CD14 + ou CD1c +) foram observados (Figura 1A). A metodologia também permite a análise de CD4 + CD25 + Foxp3 + células em biópsias de pele humana. Utilizando coloração intracelular após fixação e permeabilização, é possível demonstrar a expressão da transcrição FACTor Foxp3 em células CD25 + (Figura 1A).

Suspensões de uma única célula obtidos a partir de biópsias de pele humana mostrou um fundo elevado autofluorescência em FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacific azul) e os canais usando um citómetro de FL10 (laranja cromo) (dados não mostrados) . Para a análise adequada da população de linfócitos, nós recomendamos o uso de um mAb CD45 anti-humano conjugado com uma Brilliant Violet 421 fluorocromo para gating da população de linfócitos ea exclusão da população de células autofluorescente (Figura 1B). A maioria das células residentes na pele humana eram células T CD3 + (Figura 1C). Para a análise de viabilidade celular, recomenda-se usar um corante de viabilidade fixável para distinguir viáveis ​​de células mortas / morrer (Figura 1C). Normalmente, este protocolo resulta em 65,3% ± 7,7 (média ± SD) de células viáveis. Para uma análise mais aprofundada da citometria de fluxo de dados, é AdvisEd a porta sobre a população de células viáveis, uma vez que as células mortas ou moribundas perdem a integridade da membrana celular, e pode não se ligar especificamente anticorpo conjugado, aumentando assim a coloração de fundo.

As células T isoladas por este protocolo são bem adequados para análise funcional. Ao utilizar um único biópsia 4 milímetros de pele lesionada de pacientes com psoríase, mostrou-se que as células T de biópsias derivado produzida IL-17A e IFNy seguinte 4 h estimulação com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A (Figura 2).

Preparados na hora suspensões de pele de uma única célula de lesões de pele psoriática envolvidos podem ser usados ​​também para uma maior cultura de células ex vivo e análise funcional subsequente. Após expansão após estimulação policlonal com microesferas anti-CD3 / anti-CD28 mAb revestidas na presença de citoquinas pró-inflamatórias IL-1 ou IL-23 durante 8 dias, por exemplo, as células podem ser analisadas quanto à sua cytokINE produção de capacidade (Figura 3). Ao fazê-lo, foi observada uma clara diferença entre o potencial de produção de citoquina de células derivadas da pele de indivíduos saudáveis ​​e de psoríase. As células T de indivíduos psoriáticas mostraram uma capacidade muito maior para produzir a psoríase associada IL17A citocinas e IFNy. Isto implica que, mesmo após a cultura ex vivo de um fenótipo de citocinas psoríase prototípico é mantida, no caso de ausência de controlos saudáveis.

figura 1
Figura 1:. Diferentes tipos de leucócitos são identificados em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis ​​linfócitos residentes pele isolado utilizando o protocolo descrito no texto foram coradas com os mAbs fluorocromo-conjugados de interesse acrescido de corante de viabilidade fixável e imediatamente analisadas por citometria de fluxo. (A) Fluxo cydetecção tometric dos monócitos (CD14), DCs (CD11c), células B (CD19), as células NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + e CD25 + Foxp3 + subconjuntos dentro de linfócitos residentes pele. CD45 anti-humano / BV421 mAb distingue linfócitos de células autofluorescentes. As estratégias utilizadas para gating células CD45 + é mostrado em (B). (C) Percentagem de células T CD3 + CD45 + viável após o isolamento. Número mostra a percentagem de células positivas. A experiência representativa de três experiências diferentes / doadores é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: células T derivadas da pele lesional de pacientes com psoríase pode produce IL-17A e IFN-y. A biópsia de pele única de 4 mm foi feita a partir da pele lesional de pacientes psoríase em cima oralmente ou consentimento informado por escrito para uso científico. As células T residentes pele foram isolados utilizando o protocolo descrito no texto. Produção de IL-17A e IFNy por células T residentes pele. acumulação intracelular de citocinas em resposta à estimulação de 4 horas com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A foi medido por citometria de fluxo. Percentagem de células citocinas positivo é mostrado. Dados de três pacientes diferentes são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: células T cutâneas residentes são capazes de produzir IL-17A e IFN-y seguinte ex vivo A) ou IL-23 (50 ng / ml, B) durante 8 dias. Em seguida, as células foram estimuladas durante 4 horas com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A e depois analisados ​​para a produção de citoquina intracelular por citometria de fluxo. Um exemplo representativo de três experimentos / doadores independentes é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c + DCs, CD4 + e CD8 + T e Foxp3 + CD25 +. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito bem possível e permitido para análise funcional subsequente.

A pele humana pode ser dissociados em suspensões de célula única através da combinação de dissociação mecânica com a degradação enzimática das proteínas de adesão extracelulares, que funcionam de modo a manter a integridade estrutural dos tecidos. Embora dispase separação da camada base da epiderme e derme é um método amplamente utilizado para determinar a infiltração de células nestas respectivas camadas da pele, percebemos que dispase tratamento levou tOA grande redução da expressão à superfície celular do CD25 e CD27 (não mostrado). À medida que estes marcadores são importantes para caracterizar subconjuntos de linfócitos, acreditamos que a dispase a influenciar o tratamento subsequente imunofenotipagem. Não é provável que a supressão da derme é responsável pela redução observada em CD25 ou CD27 as células que expressam, uma vez que na pele de indivíduos saudáveis, a maioria das células T está localizada na derme, enquanto o número de células minutos T estão presentes na epiderme 10 -12. O efeito prejudicial de dispase na capacidade de proliferação dos queratinócitos isolados foi reportado anteriormente 13. Portanto, o uso prudente de dispase se justifica se a função celular é o objetivo do estudo. Em nosso protocolo temos vindo a utilizar colagenase tipo I obter a suspensão de células isoladas de biópsias de pele. Embora colagenase I tem alta atividade tríptica comparação com colagenase IV e, portanto, é mais dura, temos escolhido este colagenase especial porque tem sido tested para a sua adequação para cultura de células. O uso de uma colagenase IV, que é adequado para a cultura celular pode ser um passo futuro para optimizar ainda mais a nossa protocolo corrente.

Devido à sua natureza, a pele é altamente resistente a forças de tensão e desagregação mecânica. Até agora, uma análise abrangente de células imunes na pele humana tem sido prejudicada por desafios técnicos na obtenção de números de células suficientes quando se utiliza protocolos de digestão relativamente severas. Como consequência, a maioria dos estudos publicados até à data dependem de análises de imuno-histoquímica. O isolamento directo das células T CD4 + a partir de biópsias de pele é geralmente considerada demasiado. Uma alternativa seria o uso de explante de pele rastejar para fora culturas 10. No entanto, estes levar 2-3 semanas de cultura, e o meio de cultura explante pele contém um conjunto selecionado de citocinas e quimiocinas, que poderá conduzir a crawling preferencial de subconjuntos específicos de células T. Além disso, o período de cultura pode affect o fenótipo das células. O protocolo atual não faz uso de citocinas adicionais ou quimiocinas e expressão de CD4 (e também outros marcadores de células) está bem preservada após o isolamento, permitindo tanto fenotípicas e estudo funcional de populações de células T diretamente após o isolamento.

Um tecido Dissociator automatizado disponível comercialmente é utilizado para a dissociação de fragmentos da pele antes da sua incubação com colagenase, necessária para a degradação da matriz extracelular. Para a libertação subsequente das células a partir da matriz extracelular, o Dissociator automatizado é utilizado novamente. Apesar de extensa corte manual da pele pode produzir o número de células semelhantes (dados não mostrados), os resultados são menos consistentes e são mais dependente da experiência do artista. Dissociação da pele usando o procedimento pré-definido oferecida pelo instrumento irá produzir resultados muito mais reprodutíveis. Consistentes com estudos anteriores que mostram que a pele contém vários leukocytes subconjuntos células DCs, CD8 + e T CD4 + 2,14, CD11c +, e células Foxp3 + foram observados nas populações de células únicas preparadas pelo protocolo aqui apresentado. Importantemente, o protocolo origina um rendimento relativamente elevado de linfócitos viáveis. Devido à eficiência do protocolo, que é particularmente útil quando se estuda o material do paciente, onde muitas vezes apenas uma única biópsia de pele de 4 mm, podem ser obtidas. Utilizando o método, fomos capazes de mostrar que as células T isoladas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase mostrou uma maior capacidade para produzir IL-17A e IFN-y, em comparação com a pele saudável 9.

Dependendo da questão de pesquisa, pode ser necessário para purificar ainda mais certos subconjuntos de células após a preparação de suspensões de células únicas. Neste caso, grandes pedaços de pele pode ser utilizada para garantir o rendimento das células suficientes para análises subconjunto. Ao fazê-lo, certifique-se de que a pele deve ser cortado em pi menorECES de cerca de 2 mm x 2 milímetros antes de iniciar o protocolo de isolamento.

Em conclusão, o presente protocolo oferece um modo melhorado para isolar células residentes da pele, facilitando fenotípica significativa e análise funcional em um nível de célula única, melhorando assim a percepção em respostas imunes da pele.

etapas críticas do protocolo atual são a remoção adequada do tecido adiposo subcutâneo e o corte de pele em pedaços menores, especialmente quando o processamento de mais de uma biópsia em um tubo de dissociação. O tecido adiposo e / ou grandes pedaços de tecido fará com que o Dissociator para trabalhar de forma inadequada, pedindo re-runs. Isso vai prejudicar seriamente a viabilidade celular. A limitação da técnica é que o número de células derivadas de uma única biópsia de pele de 4 mm não são suficientes para o subsequente isolamento de subconjuntos de células.

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Acknowledgements

biópsias de pele de pacientes com psoríase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatologia da Universidade de Essen, Alemanha), após consentimento informado oral ou escrita para uso científico.

XH também é suportado pelo NSFC 61263039 e 11101321 NSFC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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