Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mänsklig hud har en viktig barriärfunktion och innehåller olika immunceller som bidrar till vävnad homeostas och skydd mot patogener. Eftersom huden är relativt lätt att komma åt, det ger en idealisk plattform för att studera perifera immunregleringsmekanismer. Immunresidensceller i frisk hud uppträdande immunosurveillance, men också spela en viktig roll i utvecklingen av inflammatoriska hudsjukdomar, såsom psoriasis. Trots nya insikter, är vår förståelse av biologin bakom olika inflammatoriska hudsjukdomar fortfarande begränsad. Det finns ett behov av god kvalitet (singel) cellpopulationer isolerade från biopsier hudprover. Hittills har isoleringsprocedurer blivit allvarligt hämmas av en brist på att erhålla ett tillräckligt antal viabla celler. Isolering och efterföljande analys har också påverkats av förlusten av immunceller härstamning markörer, på grund av mekanisk och kemisk stress som orsakas av de nuvarande dissociation förfaranden för att erhållaenkelcellsuspension. Här beskriver vi en modifierad metod för att isolera T-celler från både friska och inblandade psoriatisk människohud genom att kombinera mekanisk hud dissociation användning av en automatiserad vävnads dissociator och kollagenas-behandling. Denna metod bevarar uttryck för de flesta immun härstamning markörer såsom CD4, CD8, Foxp3 och CD11c på framställningen av enstaka cellsuspensioner. Exempel på framgångsrika CD4 + T-cell isolering och efterföljande fenotypiska och funktionell analys visas.

Introduction

Huden, som det primära gränssnittet mellan kroppen och miljön, är den första försvarslinjen mot yttre fysiska, kemiska och biologiska förolämpningar såsom sårskada, ultraviolett strålning och mikroorganismer. Huden innefattar två huvudfack, epidermis och dermis, och innehåller en mängd olika immunceller inkluderande Langerhans celler, makrofager, dendritiska celler (DC), och ca 20 miljarder minnes-T-celler, nästan dubbelt så många som föreligger i hela blodvolymen 1 , 2. En växande mängd data stöder tanken att huden har väsentliga immunologiska funktioner, både under vävnadshomeostas och i olika patologiska tillstånd. Immunceller bosatta i normal hud tros genomföra immunosurveillance 3 och har visat sig spela en roll i utvecklingen av inflammatoriska störningar, såsom psoriasis 4. I psoriatisk lesionell hud, både CD4 + och CD8 + infiltrerade T-celler var observed och det visades att förhållandet mellan CD4 och CD8 varierar beroende på sjukdomsstatus 5. Emellertid dessa populationer av celler är svåra att studera eftersom befintliga tekniker möjliggör isolering av endast få celler.

De för närvarande allmänt använda tekniker för T-cell isolering från mänsklig hud kombinera mekanisk hud dissociation med enzymatisk behandling. Mänsklig hud biopsier omfattande malet och odlades med enzymer som trypsin, kollagenas och / eller EDTA 6-8. Med tanke på att huden är en barriär vävnad som är mycket motståndskraftig mot dragkrafter och mekaniska disaggregation, av etablerade metoder för T-cellisolering produceras mycket få celler, och till och med lägre antalet livskraftiga celler, vilket gör ex vivo cellkultur av dessa cellpopulationer svår och utmanande.

Här rapporterar vi en modifierad metod för att isolera lymfocyter från både friska och engagerade psoriasis mänsklig hud genom att kombinera mechaniCal dissociation av huden med hjälp av en automatiserad vävnads dissociator i stället för den etablerade metoden för omfattande mals tillsammans med enzymatisk spjälkning med hjälp av kollagenas. Olika viabla immuncellundergrupper inklusive DCs och T-celler observerades efter framställning av en enkelcellsuspension. Viktigare uttrycket av de ytmarkörer CD3, CD4 och CD8 var väl bevarad. Celler som sålunda framställts, är klara för användning i ex vivo cellodlingar eller flödescytometrisk analys. Detta protokoll har med framgång använts för analys av enstaka hudbiopsier (4 mm) härrörande från lesionell hud av psoriasispatienter. Resultaten visade att huden bosatt patienten T-celler producerade mer inflammatoriska cytokiner såsom IL-17 och IFN-y i jämförelse med friska försökspersoner 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Hudbiopsier från friska individer erhölls från buken hud överblivna av individer som genomgår elektiv plastikkirurgi efter muntlig eller skriftlig informerat samtycke för vetenskapliga ändamål. Användningen av människohud godkändes och i enlighet med de föreskrifter som av den medicinska etiska kommittéer för mänsklig forskning av Radboud University Medical Center, Nijmegen, Nederländerna och universitetet i Essen, Tyskland.

1. Beredning av encelliga Suspensioner från Human Skin (Work Steril i en Flow-skåp om Efterföljande Cell Culture är krävs)

  1. Förbereda cellodlingsmedium: RPMI 1640 + penicillin / streptomycin (slutkoncentrationerna 100 enheter / ml och 100 | ig / ml, respektive) + pyruvat (0,02 mM) och glutamax (0,02 mM), med inget serum tillsätts.
  2. Förbered komplett odlingsmedium: odlingsmedium som framställts i steg 1,1 + 10% humant sammanslaget serum (HPS); lagra vid 4 ° C. Ta medium till 20 ° C ± 2 framför ossIng.
  3. Skaffa hudbiopsi med hjälp av en 4mm rund biopsistans instrument och hålla den i RPMI1640 komplett odlingsmedium vid 20 ° C ± 2 för upp till fyra timmar eller vid 4 ° C på. Process biopsin så snart som möjligt efter ankomsten till laboratoriet.
    OBS: Längre förvaring av huden kommer att påverka cellutbytet och cellernas livsduglighet.
  4. Märka en blå-tak dissociation röret och tillsätt 5 ml komplett odlingsmedium i den märkta röret.
  5. Tillsätt 2 ml av komplett odlingsmedium i varje brunn (totalt 3 brunnar) av en steril 6-brunnars odlingsplatta. Använd sterila verktyg för att placera biopsi i ett enda väl, skölja, flytta den till en andra brunn och upprepa detta steg en gång på så sätt åstadkomma en totalt tre sköljningar.
  6. Överföra väl sköljda hudbiopsi till en steril petriskål, tillsätt 100 pl komplett odlingsmedium på ovansidan av biopsi, och försiktigt skrapa bort den subkutana fettvävnaden med användning av en rostfri engångstyp steril skalpell.
    OBS: Thär är ett kritiskt steg.
  7. Skär varje hudbiopsi i 4 mindre bitar på en steril petriskål. Överför prover (upp till fyra av 4 mm biopsier per rör) till den förberedda dissociation rör innehållande 5 ml komplett odlingsmedium.
  8. Tätt stänga rören med locket, och fäst upp och ned på hylsan av den automatiska vävnads dissociator. Se till att alla provmaterial är beläget i området för rotorn.
  9. Starta dissociation process genom att köra "programmet m_spleen _01" (ett fördefinierat program som tillhandahålls av instrumentets interna minne eller av den åtföljs programkort) för att dissociera biopsi vid lämplig rotationshastighet för 56 sek.
  10. Efter bearbetning, lossa dissociation röret från dissociator och se till att alla dissocierade materialet samlas i botten av röret.
  11. Tillsätt 150 l kollagenas IA (80 mg / ml) i dissociation röret och inkubera provet i ett skakande vattenbad vid 37° C under 60 min. Tillsätt 100 pl DNas I (5 MU / ml) i thedissociation rör, blanda väl.
    OBS: Högre koncentration av kollagenas eller längre inkubationstid kommer att förändra cellernas livskraft.
  12. Fäst dissociation röret till hylsan av den automatiserade vävnads dissociator och kör "programmet m_ mjälte _01" för att dissociera biopsi en gång.
  13. Placera en 70 | iM nyloncellfilter på toppen av en 50 ml Falcon-rör. Tillämpa dissocierade provmaterial till denna cell sil för att avlägsna cellklumpar / vävnadsrester.
  14. Tvätta cell sil gång med 5 ml komplett odlingsmedium. Centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 10 min och aspirera supernatanten.
  15. Upprepa tvättsteget en gång till. Resuspendera cellpellets i 300 pl komplett odlingsmedium. Encelliga suspensioner är redo för vidare analys; fortsätta med protokoll för ex vivo cellkultur eller flödescytometrianalys.
  16. I fall av ytterligare intracellular cytokin-färgning, stimulera celler med PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) och Brefeldine A (5 | j, g / ml) under 4 h vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 4 h före utförande av flödet cytometri-analys.

2. Polyklonal Aktivering av Skin-Resident T-celler (ex vivo Cell Culture)

  1. Alikvot 100 | il encelliga suspensioner (framställd i steg 1,15) i en rundbottnad 96-brunnsplatta.
    OBS: För var och en av 4 mm hudbiopsi, kan de förvärvade encelliga suspensioner delas upp i åtminstone två brunnar av en 96-brunnars platta.
  2. Lägg anti-CD3 / anti-CD28-mAb-belagda mikropärlor (25000 pärlor per brunn), rekombinant humant cytokin rIL-2 (slutkoncentration 25 U / ml) och rIL-1 (slutkoncentration 50 ng / ml).
  3. Täcka odlingsplattan med en väl-märkt platta lock, inkubera i 5% CO2, 100% fuktighet, 37 ° C inkubator. Ändra mediet när mediet färgen blir gul.

3. flödescytometrianalys av primära / odlad hud-Resident T-celler

  1. Förbered FACS buffert: PBS + 0,2% BSA.
  2. Överföra celler av intresse i en v-bottnad 96-brunnars platta. Centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 2 min, och aspirera supernatanten.
  3. Återsuspendera pelleten i 100 | il PBS. Centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 2 min, och aspirera supernatanten.
  4. Fläcken celler med 100 pl av beredda eFluorescence780 konjugerade fixerbar livskraft färgämne (1: 1000 spädning med användning av PBS) vid 4 ° C under 30 minuter. Tillsätt 100 | il FACS-buffert, centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 2 min, och aspirera supernatanten.
  5. Välj nödvändiga cellytmarkör mAbs, till exempel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), och CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), förbereda mAbs blandning med hjälp av FACS buffert enligt varje mAb utspädningsfaktor testas. Definiera gate inställningar med isotypisk kontroll antikropp tillsammans med icke-fläckprov.
  6. Tillsätt 25 pl av beredd mAbs-blandningen i varje brunn. Inkubera 20 minuter vid 20 ° C ± 2, skydda mot ljus.
  7. Tillsätt 100 | il FACS-buffert, centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 2 min, och aspirera supernatanten.
  8. För prover som bara kräver cellytan färgning, fortsätta med steg 3,16.
  9. Vid intracellulär Foxp3 färgning:
    1. Förbereda fixering och permeabilisering buffert genom att blanda en del koncentrat med 3 delar utspädningsmedel.
    2. Bered 1x permeabilization buffert: 1 del av 10x Permeabilization buffert + 9 delar steriliserat H2O
  10. Resuspendera pellets i 100 pl fixering och permeabilisation buffert, blanda väl och inkubera vid 4 ° C under 30 min.
  11. Tillsätt 100 | il permeabilization buffert till varje brunn, centrifugera vid 450 xg vid RT i 2 minuter, och aspirera supernatanten.
  12. Tvätta cellerna med permeabilization buffert en gång.
  13. Välj önskat intracellulära mAbs, till exempel, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) och IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Förbered mAbs blandning med hjälp av permeabilization buffert innehållande 2% normalt råttserum enligt varje mAb utspädningsfaktor testas. Definiera gate inställningar med isotypisk kontroll antikropp tillsammans med icke-fläckprov.
  14. Tillsätt 20 pl av beredd mAb-blandning i varje brunn. Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter, skydda mot ljus.
  15. Efter 30 min inkubation, tillsätt 100 | il av permeabilization buffert i varje brunn. Centrifugera vid 20 ° C ± 2, 450 x g under 2 min, och aspirera supernatanten.
  16. Tvätta celler med permeabilization buffer en gång till. Återsuspendera pelleten i 110 | il FACS-buffert, och överföring cellsuspensioner in microFACS rör.
    OBS: Prov är redo för mätning med 10-färgers flödescytometri.
  17. Vid exakta antalet celler som krävs, tillsätt 10 pl välblandad homogen suspension av fluorosfärer i varje prov omedelbart innan du utför mätningar med hjälp av flödescytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet presenteras här kommer att ge mellan 2200 ± 615 (medelvärde ± SEM, huden hos friska försökspersoner) upp till 178.000 ± 760 (medelvärde ± SEM, lesionell hud psoriasispatienter) livskraftiga lymfocyter från mänsklig hud när man använder en enda 4 mm hudbiopsi.

Olika typer av CD45 + celler identifierades i encelliga suspensioner erhållna från huden hos friska individer inklusive CD4 + T-celler (~ 45%), CD8 + T-celler (~ 30%), och CD11c + DC: er (~ 5% ), medan några B-celler (CD19 +), NK-celler (CD56 + CD3 -), eller monocyter / makrofager (CD14 + eller CD1c +) observerades (Figur 1A). Metodiken gör det också möjligt för analys av CD4 + CD25 + Foxp3 + celler i humana hudbiopsier. Genom att använda intracellulär färgning efter fixering och permeabilisering, är det möjligt att visa uttrycket av transkriptions factor Foxp3 i CD25 + T-celler (Figur 1A).

Encelliga suspensioner som härrör från mänskliga hudbiopsier visade en hög autofluorescens bakgrund i FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacific Blue) och FL10 (kromorange) kanaler med en cytometer (data visas ej) . För ordentlig analys av lymfocytpopulationen, rekommenderar vi därför att använda en anti-human CD45 mAb konjugerad med en Brilliant Violet 421 fluorokrom för grind av lymfocytpopulationen och uteslutning av autofluorescent cellpopulationen (Figur 1B). Majoriteten av residensceller i human hud var CD3 + T-celler (Figur 1C). För cellviabiliteten analys är det rekommenderat att använda en fastställbara livskraft färgämne för att skilja livskraftiga från döda / döende celler (Figur 1C). Typiskt detta protokoll resulterar i 65,3% ± 7,7 (medelvärde ± SD) levande celler. För ytterligare analys av flödescytometri data, är det advised till gate på den livsdugliga cellpopulationen, eftersom döda eller döende celler förlorar sin cellmembranintegritet, och kan ospecifikt binda konjugerad antikropp, och därigenom öka bakgrundsfärgning.

T-celler isolerade genom detta protokoll är väl lämpade för ytterligare funktionell analys. Genom att använda en enda 4 mm biopsi av lesioner hud psoriasispatienter, visade det sig att biopsi härledda T-celler producerade IL-17A och IFNy efter 4 timmar stimulering med PMA / jonomycin i närvaro av Brefeldin A (Figur 2).

Nylagade encelliga hud suspensioner från berörda psoriasis hudlesioner kan också användas för ytterligare ex vivo cellodling och efterföljande funktionell analys. Efter expansion efter polyklonal stimulering med anti-CD3 / anti-CD28-mAb-belagda mikropärlor i närvaro av de pro-inflammatoriska cytokinerna IL-1 p eller IL-23 i 8 dagar, kan cellerna t.ex. analyseras för deras cytokine förmågan att producera (Figur 3). Genom att göra så, var en tydlig skillnad mellan cytokin producerande potentialen hos celler från huden hos friska och psoriasis personer observerades. T-celler från psoriasis individer visade en mycket högre kapacitet att producera psoriasis förknippad cytokiner IL17A och IFNy. Detta innebär att även efter ex vivo kulturen en prototypisk psoriasis cytokin fenotyp bibehålls, frånvarande vid friska kontroller.

Figur 1
Figur 1:. Olika typer av leukocyter identifieras i singel-cellsuspensioner härledda från huden hos friska individer Skin bosatta lymfocyter isolerades med användning av det protokoll som beskrivs i texten färgades med de fluorokromkonjugerade mAbs av intresse plus fixerbart livskraft färgämne och analyserades omedelbart genom flödescytometri. (A) Flöde cytometric detektering av monocytema (CD14), DCs (CD11c), B-celler (CD19), NK-celler (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + och CD25 + FOXP3 + undergrupper inom hud bosatta lymfocyter. Anti-Human CD45 / BV421 mAb skiljer lymfocyter från autofluorescerande celler. Grind strategier som används för CD45 + celler visas i (B). (C) Procent av livskraftig CD45 + CD3 + T-celler efter isolering. Nummer visar andelen positiva celler. Ett representativt experiment av tre olika experiment / givare visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: T-celler härledda från lesionell hud av psoriasispatienter kan produce IL-17A och IFNy. En enda 4 mm hudbiopsi togs från lesionell hud psoriasis patienten på muntligen eller skriftligt informerat samtycke för vetenskapliga ändamål. De huden bosatta T-celler isolerades med användning av protokollet som beskrivs i texten. Produktion av IL-17A och IFNy vid hud bosatta T-celler. Intracellulär ackumulering av cytokiner som svar på 4 h stimulering med PMA / jonomycin i närvaro av Brefeldin A mättes genom flödescytometri. Procentandel av cytokin-positiva celler visas. Uppgifter om tre olika patienter visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Skin-bosatt T-celler är kapabla att producera IL-17A och IFNy efter ex vivo A) eller IL-23 (50 ng / ml, B) under 8 dagar. Därefter stimulerades cellerna under 4 timmar med PMA / jonomycin i närvaro av Brefeldin A och därefter analyseras med avseende på intracellulär cytokinproduktion genom flödescytometri. Ett representativt exempel av tre oberoende experiment / givare visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att effektivt isolera huden bosatta T-celler från mänsklig hud biopsier. Fördelen med detta protokoll är isolering av relativt höga antalet livskraftiga lymfocyter, och uttrycka relevanta ytmarkörer. De cellundergrupper identifierades var: CD11c + DCS, CD4 + och CD8 + T-celler och Foxp3 + CD25 + celler. Viktigt, ex vivo odling av isolerade hud bosatta T-celler var mycket väl möjligt och tillåtet för efterföljande funktionsanalys.

Mänsklig hud kan dissocieras till encelliga suspensioner genom att kombinera mekanisk dissociation med enzymatisk nedbrytning av de extracellulära adhesionsproteiner vilka fungerar för att bibehålla den strukturella integriteten hos vävnader. Även dispas baserat skikt separation av epidermis och dermis är en allmänt använd metod för att bestämma cellinfiltration i dessa respektive hudlager, märkte vi att dispas behandling ledde toa betydande minskning av cellyteexpression av CD25 och CD27 (ej visad). Eftersom dessa markörer är viktiga för att karakterisera lymfocytundergrupper, tror vi att dispas behandlings påverkar efterföljande immunfenotypning. Det är inte troligt att avlägsnandet av dermis är ansvarig för den observerade minskningen av CD25 eller CD27-uttryckande celler, eftersom huden hos friska individer majoriteten av T-celler är lokaliserade i dermis medan siffrorna minut T-cells är närvarande i epidermis 10 -12. Den skadliga effekten av dispas på proliferationen kapacitet av isolerade keratinocyter har tidigare 13 rapporterats. Därför är återhållsam användning av dispas motiverad om cellfunktion är syftet med studien. I våra protokoll har vi använt kollagenas typ I för att få en enda cell suspension av hudbiopsier. Även kollagenas I har hög tryptisk aktivitet jämfört med kollagenas IV och därmed är mer hård, har vi valt denna kollagenas eftersom det har varit tested för dess lämplighet för cellodling. Användningen av en kollagenas IV som är lämplig för cellodling kan vara ett framtida steg för att ytterligare optimera vår nuvarande protokollet.

På grund av sin natur, är huden mycket motståndskraftig mot dragkrafter och mekanisk uppdelning. Hittills har en omfattande analys av immunceller i human hud hämmats av tekniska utmaningar att få tillräckligt cellantal vid användning av relativt hårda matsmältning protokoll. Som en följd av de flesta studier som publicerats hittills är beroende av immunhistokemiska analyser. Den direkta isoleringen av CD4 + T-celler från hudbiopsier anses allmänt besvärliga. Ett alternativ skulle vara att använda hud explantat krypa ut kulturer 10. Men dessa tar 2-3 veckors odling, och huden Explantation odlingsmediet innehåller en uppsättning vald av cytokiner och kemokiner, som kan leda till förmånliga genomsökning av specifika T-cellundergrupper. Dessutom odlingsperioden kanske affect fenotypen av cellerna. Det nuvarande protokollet inte utnyttjar av tillsatta cytokiner eller kemokiner och uttryck av CD4 (och även andra cellmarkörer) är väl bevarad efter isolering, vilket gör att både fenotypiska och funktionella studier av T-cellpopulationer direkt efter isolering.

En kommersiellt tillgänglig automatiserad vävnads dissociator används för dissociationen av skalfragment före deras inkubation med kollagenas, som erfordras för nedbrytningen den extracellulära matrisen. För den efterföljande frisättning av cellerna från den extracellulära matrisen, är det automatiserade dissociator användas igen. Även omfattande manuell skärning av huden kan ge liknande cellantal (data visas ej), resultatet är mindre konsekvent och är mer beroende av den utövande erfarenhet. Dissociation av huden med hjälp av fördefinierade procedur som erbjuds av instrumentet kommer att ge mycket mer reproducerbara resultat. I överensstämmelse med tidigare studier som visar att huden innehåller olika leukocytes delmängder 2,14, CD11c + DCS, CD8 + och CD4 + T-celler, och Foxp3 + celler observerades i singel-cellpopulationer som framställts genom det protokoll som presenteras här. Viktigt, ger protokollet ett relativt högt utbyte av livskraftiga lymfocyter. På grund av effektiviteten av protokollet, särskilt användbart när studera patientmaterial, där det ofta endast en enda 4 mm hudbiopsi kan erhållas. Med hjälp av metoden, kunde vi visa att T-celler som isolerats från lesionell hud av psoriasispatienter uppvisade en högre kapacitet att producera IL-17A och IFNy jämfört med frisk hud 9.

Beroende på forskningsfråga, kan det vara nödvändigt att ytterligare rena vissa cellunderuppsättningar efter framställningen av enkelcellsuspensioner. I detta fall, kan större stycken av huden användas för att säkerställa utbytet av tillräckligt många celler för subset analyser. När man gör så, se till att huden ska skäras i mindre piECES på ca 2 mm x 2 mm innan du startar isoleringsprotokollet.

Sammanfattningsvis ger det nuvarande protokollet ett förbättrat sätt att isolera huden bosatta celler, vilket underlättar meningsfull fenotypiska och funktionell analys på en enda cell nivå, vilket förbättrar vår insikt i huden immunsvar.

Kritiska steg i det nuvarande protokollet är det korrekta avlägsnandet av subkutan fettvävnad och skär av hud i mindre bitar, i synnerhet vid bearbetning av mer än en biopsi i en dissociation rör. Fettvävnad och / eller stora vävnadsbitar kommer att orsaka dissociator att arbeta felaktigt, ber om repriser. Detta kommer att allvarligt skada cellernas livskraft. Begränsningen av den tekniken är att cell nummer härrör från en enda 4 mm hudbiopsi är inte tillräckligt för efterföljande isolering av undergrupper av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Hudbiopsier från psoriasispatienter tillhandahölls vänligen av Dr. Andreas Koerber (Dermatology institutionen vid universitetet i Essen, Tyskland) efter muntlig eller skriftlig informerat samtycke för vetenskapliga ändamål.

XH stöds också av NSFC 61263039 och NSFC 11.101.321.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics