Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T - Zell - Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.

Introduction

Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans'schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis - T - Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T - Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen.

Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd.

Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex - vivo - Zellkulturen oder Durchflusszytometrie - Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T - Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.

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Protocol

HINWEIS: Hautbiopsien von gesunden Personen aus Bauchhaut Überbleibsel von Individuen erhalten wurden elektiven plastische Chirurgie nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke. Die Verwendung menschlicher Haut wurde genehmigt und in Übereinstimmung mit den gesetzten Regeln von der medizinischen Ethikkommission für Humanforschung der Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande und Universität Essen, Deutschland.

1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der menschlichen Haut (Work Sterile in einem Fluss Schrank wenn Nachfolgende Zellkultur ist erforderlich)

  1. Bereiten Zellkulturmedium: RPMI 1640 + Penicillin / Streptomycin (endgültige Konzentration 100 Einheiten / ml und 100 ug / ml, jeweils) + Pyruvat (0,02 mM) und Glutamax (0,02 mM) ohne Serum zugesetzt.
  2. Bereiten komplette Kulturmedium: Kulturmedium, hergestellt in Schritt 1.1 + 10% humanes Serumsammel (HPS); Lagerung bei 4 ° C. Bringen Medium auf 20 ° C ± 2 vor unsing.
  3. Besorgen Sie sich die Hautbiopsie eine 4mm lang Biopsie Punch Instrument und halten Sie es in RPMI1640 komplettem Kulturmedium bei 20 ° C ± 2 für bis zu 4 Stunden oder bei 4 ° C an. Verarbeiten Sie die Biopsie so schnell wie möglich bei der Ankunft im Labor.
    HINWEIS: Eine längere Lagerung der Haut wird die Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen.
  4. Beschriften Sie eine blau-capped Dissoziation Rohr und mit 5 ml komplettem Kulturmedium in das markierte Rohr.
  5. 2 ml komplettem Kulturmedium in jede Vertiefung (insgesamt 3 wells) einer sterilen 6-well-Kulturplatte. Verwenden Sie sterile Werkzeuge, um die Biopsie in einem einzigen gut zu platzieren, spülen, verschieben Sie es zu einem zweiten weit über und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, also insgesamt drei Spülungen zu erreichen.
  6. Übertragen Sie die gut gespült Hautbiopsie in eine sterile Petrischale, 100 & mgr; l komplettem Kulturmedium auf der Oberseite der Biopsie und vorsichtig abkratzen das subkutane Fettgewebe mit einem Edelstahl-sterilen Einweg-Skalpell ab.
    HINWEIS: Thist, ist ein kritischer Schritt.
  7. Schneiden Sie jede Hautbiopsie in 4 kleinere Stücke auf einer sterilen Petrischale. Transfer-Proben (bis zu vier von 4 mm Biopsien pro Röhrchen) auf die vorbereitete Dissoziation Röhrchen mit 5 ml komplettem Kulturmedium.
  8. dicht schließen die Rohre mit der Kappe, und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator. Stellen Sie sicher, dass alle Probenmaterial in dem Bereich des Rotors befindet.
  9. Starten Sie den Dissoziationsprozeß durch das "Programm m_spleen _01" läuft (ein vordefiniertes Programm zur Verfügung gestellt von den internen Speicher des Instruments oder durch die Begleitung Programmkarte), um die Biopsie bei der entsprechenden Drehzahl für 56 Sekunden zu distanzieren.
  10. Nach der Bearbeitung lösen sich von der Dissociator die Dissoziation Rohr und stellen Sie sicher, dass alle das dissoziierte Material am Boden des Rohres gesammelt wird.
  11. In 150 ul Kollagenase IA (80 mg / ml) in den Spaltrohr und Inkubation der Probe in einem geschüttelten Wasserbad bei 37° C für 60 min. 100 l DNase I (5 MU / ml) in thedissociation Rohr, gut mischen.
    Hinweis: Eine höhere Konzentration von Kollagenase oder längere Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern.
  12. Bringen Sie die Dissoziation Rohr an der Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator und führen Sie das "Programm m_ Milz _01" die Biopsie ein weiteres Mal zu distanzieren.
  13. Legen Sie eine 70 & mgr; M Nylon Zelle Sieb auf der Spitze eines 50 ml-Falcon-Röhrchen. Anwenden dissoziierten Probenmaterialien auf diese Zellsieb Zellklumpen / Gewebereste zu entfernen.
  14. Waschen Zellsieb einmal mit 5 ml vollständigem Kulturmedium. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 10 min und Überstand absaugen.
  15. Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Resuspendieren Zellpellets in 300 & mgr; l komplettem Kulturmedium. Einzelzellsuspensionen sind bereit für die weitere Analyse; weiterhin mit Protokollen für die ex vivo Zellkultur oder Zytometrie Analyse fließen.
  16. Bei weiteren intracellular Zytokinfärbung stimulieren Zellen mit PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) und Brefeldin A (5 ug / ml) für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 4 Stunden vor dem Strömungsdurchführen Zytometrie Analyse.

2. polyklonalen Aktivierung der Haut-Einwohner - T - Zellen (ex vivo Zellkultur)

  1. Aliquot 100 ul Einzelzellsuspensionen (hergestellt in Schritt 1.15) in einen Rundboden-96-Well-Platte.
    HINWEIS: Für jede der 4 mm Hautbiopsie können die erfassten Einzelzellsuspensionen in mindestens zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgeteilt.
  2. Hinzufügen anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beschichteten Microbeads (25.000 Kügelchen pro Vertiefung), rekombinantes menschliches Cytokin rIL-2 (Endkonzentration 25 U / ml) und rIL-1β (ng / ml Konzentration 50 final).
  3. Decken Sie die Kulturplatte mit einem gut markierten Platte Deckel, Inkubation in 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit, 37 ° C Inkubator. Ändern Medium, wenn das Medium Farbe gelb wird.

3. Durchflusszytometrie Analyse von Primär- / kultivierten Haut-Einwohner-T-Zellen

  1. Bereiten Sie FACS-Puffer: PBS + 0,2% BSA.
  2. Übertragen Zellen von Interesse in einer V-Boden 96-Well-Platte. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  3. Resuspendieren des Pellets in 100 ul PBS. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  4. Stain Zellen mit 100 & mgr; l präparierte eFluorescence780 konjugiert fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (1: 1000 Verdünnung mit PBS) bei 4 ° C für 30 min. Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  5. Wählen Sie das gewünschte Zelloberflächenmarker mAb, zum Beispiel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TÜK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), und CD1c-APC (AD5-8E7, die mAb-Mischung unter Verwendung von FACS-Puffer 1:10), bereiten nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe.
  6. In 25 ul vorbereitet mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren 20 min bei 20 ° C ± 2, vor Licht schützen.
  7. Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  8. Bei Proben, die nur Zeiloberflächenfärbung erfordern, weiter mit Schritt 3.16.
  9. Bei intrazellulären Foxp3-Färbung:
    1. Bereiten Fixierung und Permeabilisierung Puffer von einem Teil Konzentrat mit 3 Teilen Verdünnungsmittel zu mischen.
    2. Vorbereitung 1x Permeabilisierung Puffer: 1 Teil 10x Permeabilisierung Puffer + 9 Teile sterilisiert H 2 O.
  10. Resuspendieren Pellets in 100 ul Fixierung und Diffusionsratesation Puffer, mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
  11. 100 l Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung, Zentrifuge bei 450 × g bei RT für 2 min und absaugen Überstand.
  12. Wash-Zellen mit Permeabilisierung Puffer noch einmal.
  13. Wählen erforderlich intrazellulärem mAbs, beispielsweise Foxp3-eFluo450 (pCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) und IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereiten Sie die mAbs Mischung Permeabilisierung Puffer mit 2% normalem Rattenserum nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe.
  14. In 20 ul der vorbereiteten mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, vor Licht zu schützen.
  15. Nach 30 min Inkubation in jede Vertiefung 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  16. Wash-Zellen mit Permeabilisierung buffer ein weiteres Mal. Pellet in 110 & mgr; l FACS-Puffer und Transfer Zellsuspensionen in microFACS Rohr.
    HINWEIS: Probe ist bereit für die Messung mit 10-Farben-Durchflusszytometrie.
  17. Bei genaue Zellzahl erforderlich, fügen Sie 10 ul gut gemischten einheitliche Suspension von Fluorospheres in jeder Probe unmittelbar vor der Durchführung von Messungen mittels Durchflusszytometrie.

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Representative Results

Das Protokoll hier präsentiert wird Ausbeute zwischen 2200 ± 615 (Mittelwert ± SEM, Haut von gesunden Probanden) bis 178.000 ± 760 (Mittelwert ± SEM, fallener Haut von Psoriasis-Patienten) rentable Lymphozyten aus der menschlichen Haut, wenn eine einzelne 4 mm Hautbiopsie.

Verschiedene Arten von CD45 + Zellen wurden in Einzelzellsuspensionen identifiziert , die von der Haut von gesunden Personen einschließlich CD4 + T-Zellen (~ 45%), CD8 + T-Zellen (~ 30%) und CD11c + DCs (~ 5% ), während einige B - Zellen (CD19 +), NK - Zellen (CD56 + CD3 -) oder Monozyten / Makrophagen (CD14 + oder CD1c +) beobachtet (1A). Die Methode erlaubt auch die Analyse von CD4 + CD25 + Foxp3 + Zellen in menschlichen Hautbiopsien. Durch die Verwendung von intrazelluläres Färben nach Fixierung und Permeabilisierung, ist es möglich, die Expression des Transkriptions fac demonstrierentor Foxp3 in CD25 + T - Zellen (1A).

Einzelzellsuspensionen aus menschlichen Hautbiopsien abgeleitet zeigten eine hohe Autofluoreszenz-Hintergrund in FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (pacific blue) und FL10 (Chromorange) Kanäle mit einem Zytometer mit (Daten nicht gezeigt) . Für eine korrekte Analyse der Lymphozyten - Population, also wir die Verwendung eines Anti-Human - CD45 mAb mit einem Brilliant Violet 421 Fluorochrom zur Torsteuerung der Lymphozyten - Population und den Ausschluss von der autofluoreszenten Zellpopulation (1B) konjugiert empfehlen. Die Mehrheit der Bewohner Zellen in der menschlichen Haut waren CD3 + T - Zellen (1C). Für die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse wird empfohlen , von den toten / sterbende Zellen (1C) eine fixierbare Lebensfähigkeit Farbstoff zu unterscheiden , rentabel zu verwenden. Typischerweise Ergebnisse dieses Protokolls auf 65,3% ± 7,7 (Mittelwert ± SD) lebenden Zellen. Zur weiteren Analyse der Durchflusszytometrie Daten ist es advised zum Tor auf der lebensfähigen Zellpopulation, da tote oder sterbende Zellen verlieren ihre Integrität der Zellmembran, und nicht-spezifisch konjugierten Antikörper binden kann, wodurch die Hintergrundfärbung zu erhöhen.

T-Zellen durch dieses Protokoll isoliert sind gut geeignet für die weitere funktionelle Analyse. Eine einzelne 4 mm Biopsie lesional Haut von Psoriasis - Patienten durch Verwendung wurde gefunden , dass die Biopsie - abgeleiteten T - Zellen nach 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A (Figur 2) erzeugte IL-17A und IFNy gezeigt.

Auch für weitere ex vivo Zellkultur und nachfolgende funktionelle Analyse Einzelzellsuspensionen aus der Haut beteiligt psoriatischen Hautveränderungen können Frisch zubereitete verwendet werden. Nach der Expansion nach polyklonale Stimulation mit anti-CD3 / anti-CD28 mAb beschichteten Mikrobeads in Gegenwart der proinflammatorischen Zytokine IL-1β oder IL-23 für 8 Tage, können beispielsweise die Zellen für ihre cytok analysiert werdenine Produktionskapazität (Abbildung 3). Dadurch wurde so eine deutliche Differenz zwischen dem Zytokin produzierenden Potential von Zellen, die aus Haut von gesunden und psoriatischer Individuen beobachtet. T-Zellen von psoriatischer Individuen zeigten eine viel höhere Kapazität der Psoriasis Zytokine IL17A und IFNy zu erzeugen. Dies bedeutet , dass auch nach der Ex - vivo - Kultur ist eine prototypische Psoriasis Zytokin - Phänotyp beibehalten, fehlt bei gesunden Kontrollen.

Abbildung 1
Abb . 1: Verschiedene Arten von Leukozyten identifiziert werden in Einzelzellsuspensionen von der Haut abgeleitet von gesunden Menschen Haut resident Lymphozyten isoliert unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben wurden mit den fluorochromkonjugierten mAb von Interesse und fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff und sofort analysiert gefärbt durch Durchflusszytometrie. (A) Durchfluss cymetrisches Nachweis der Monozyten (CD14), DCs (CD11c), B - Zellen (CD19), NK - Zellen (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + und CD25 + Foxp3 + Subsets innerhalb der Haut resident Lymphozyten. Anti-Human CD45 / BV421 mAb unterscheidet Lymphozyten von autofluoreszenten Zellen. Die Gating - Strategien für CD45 + Zellen ist in (B) gezeigt. (C) Prozentsatz der lebenden CD45 + CD3 + T - Zellen nach der Isolierung. Zahl zeigt den Prozentsatz der positiven Zellen. Ein repräsentatives Experiment aus drei verschiedenen Experimenten / Geber angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: T - Zellen aus fallener Haut von Psoriasis - Patienten abgeleitet produ könnence IL-17A und IFNy. Eine einzelne 4 mm Hautbiopsie wurde bei oral von der fallener Haut von Psoriasis Patienten entnommen oder informierte Zustimmung für wissenschaftliche Zwecke geschrieben. Die T-Zellen der Haut Bewohner wurden unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben isoliert. Produktion von IL-17A und IFNy durch Haut resident T-Zellen. Intrazelluläre Akkumulation von Zytokinen in Reaktion auf 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A wurde durch Flusszytometrie gemessen. Prozentsatz der Cytokin-positiven Zellen gezeigt. Daten von drei verschiedenen Patienten gezeigt werden . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Skin-resident - T - Zellen sind in der Lage IL-17A und IFNy folgenden ex vivo zu produzieren A) oder IL-23 (50 ng / ml, B) angeregt für 8 Tage. Als nächstes wurden die Zellen für 4 Stunden mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A und danach analysiert, für die intrazelluläre Zytokinproduktion durch Durchflusszytometrie stimuliert. Ein repräsentatives Beispiel aus drei unabhängigen Experimenten / Geber angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell - Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T - Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex - vivo - Kultur der isolierten Haut resident T - Zellen war sehr gut machbar und für die nachfolgende funktionelle Analyse erlaubt.

Menschliche Haut kann mit den enzymatischen Abbau der extrazellulären Adhäsion Proteine, die durch die Kombination von mechanischer Dissoziation in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden funktionieren, um die strukturelle Integrität von Geweben aufrechterhalten. Obwohl Dispase basierte Schicht Trennung der Epidermis und Dermis eine weit verbreitete Methode ist die Zellinfiltration in diesen jeweiligen Hautschichten zu bestimmen, haben wir festgestellt, dass Dispase-Behandlung führte toa deutliche Verringerung der Zelloberflächenexpression des CD25 und CD27 (nicht gezeigt). Da diese Marker sind wichtige Lymphozytensubpopulationen zu charakterisieren, glauben wir, dass Dispase Behandlung Einflüsse nachfolgenden Immunophänotypisierung. Es ist nicht wahrscheinlich , dass die Entfernung der Dermis für die beobachtete Verringerung der CD25 oder CD27 - exprimierenden Zellen, da in der Haut von gesunden Personen die Mehrheit der T - Zellen in der Dermis lokalisiert ist , während minute T - Zellzahlen vorhanden sind , in der Epidermis verantwortlich 10 -12. Die nachteilige Wirkung von Dispase auf der Proliferationskapazität der isolierten Keratinocyten wurde zuvor 13 berichtet. Daher wird umsichtige Verwendung von Dispase gerechtfertigt, wenn die Zellfunktion das Ziel der Studie ist. In unserem Protokoll haben wir Kollagenase Typ unter Verwendung von I Einzelzellsuspension von Hautbiopsien zu erhalten. Obwohl Kollagenase I hohe tryptischen Aktivität im Vergleich zu Kollagenase IV hat und somit ist härter, haben wir diese besondere Kollagenase gewählt, weil es te gewesensted auf seine Eignung für die Zellkultur. Die Verwendung eines Kollagenase IV, die für die Zellkultur sein könnte ein zukünftiger Schritt weiter zu optimieren unsere aktuellen Protokoll geeignet ist.

Aufgrund seiner Natur ist die Haut von Zugkräften und mechanischen Disaggregierung sehr widerstandsfähig. Bisher eine umfassende Analyse von Immunzellen in der menschlichen Haut wurde von technischen Herausforderungen bei der Beschaffung von genügend Zellzahlen behindert, wenn relativ harten Verdauung Protokolle. Als Konsequenz setzen auf immunhistochemischen Analysen meisten Studien bisher veröffentlicht. Die direkte Isolierung von CD4 + T - Zellen aus Hautbiopsien wird in der Regel aufwendig angesehen wird . Eine Alternative wäre die Verwendung von Hautexplantat kriechen aus Kulturen 10. Allerdings nehmen diese 2-3 Wochen Kultur, und die Haut Explantation Kulturmedium enthält eine Reihe ausgewählt von Zytokinen und Chemokinen, die den präferenziellen Crawling aus spezifischen T-Zell-Subpopulationen führen könnte. Darüber hinaus könnte der Kulturperiode affect den Phänotyp der Zellen. Das aktuelle Protokoll nicht die Verwendung von zugesetzten Cytokinen oder Chemokinen, und die Expression von CD4 (und auch andere Zellmarker) machen, ist gut nach der Isolierung erhalten, sowohl phänotypische und funktionelle Untersuchung der T-Zell-Populationen direkt nach der Isolierung ermöglicht.

Eine im Handel erhältliche automatisierte Gewebe Dissociator ist für die Dissoziation von Hautfragmente vor ihrer Inkubation mit Kollagenase, die für den Abbau der extrazellulären Matrix verwendet. Für die anschließende Freisetzung der Zellen aus der extrazellulären Matrix wird die automatisierte Dissociator wieder verwendet. Obwohl eine umfangreiche manuelle Schneiden von Haut ähnliche Zellzahlen ergeben kann (Daten nicht gezeigt), sind die Ergebnisse weniger konsistent und sind abhängig von der Erfahrung des Ausführenden. Die Dissoziation von Haut der vordefinierten Prozedur durch das Instrument angeboten verwendet, wird ergeben viel mehr reproduzierbare Ergebnisse. In Übereinstimmung mit früheren Studien, dass die Haut zeigt, enthält verschiedene leukocytes Teilmengen 2,14, CD11c + DCs, CD8 + und CD4 + T - Zellen, und + Foxp3 - Zellen wurden in Einzelzellpopulationen , die durch das Protokoll hier vorgestellten beobachtet. Wichtig ist, ergibt das Protokoll eine relativ hohe Ausbeute an lebensfähigen Lymphozyten. Aufgrund der Effizienz des Protokolls, ist es besonders nützlich, wenn das Studium Patientenmaterial, wobei häufig nur ein einziges 4 mm Hautbiopsie erhalten werden kann. Mit der Methode konnten wir zeigen , dass T isolierte Zellen aus der fallener Haut von Psoriasis - Patienten eine höhere Kapazität zeigte produzieren IL-17A und IFNy im Vergleich zu gesunden Haut 9.

Je nach Fragestellung kann es erforderlich sein, um bestimmte Zellen-Untergruppen nach der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu reinigen. In diesem Fall größere Hautstücke können verwendet werden, um die Ausbeute an Zellen ausreichend, um sicherzustellen, für die Teilmenge analysiert. Dabei ist darauf zu achten, dass die Haut in kleinere pi geschnitten werdenECES von etwa 2 mm x 2 mm vor der Isolierung Protokoll zu starten.

Abschließend bietet das vorliegende Protokoll eine verbesserte Art und Weise Haut resident Zellen zu isolieren, sinnvolle phänotypische und funktionelle Analyse auf Einzelzellebene zu fördern und so unsere Erkenntnisse in der Hautimmunantworten zu verbessern.

Kritische Schritte im aktuellen Protokoll sind die richtige Entfernung von subkutanem Fettgewebe und das Schneiden der Haut in kleinere Stücke, vor allem, wenn mehr als eine Biopsie in einer Dissoziation Rohrbearbeitung. Fettgewebe und / oder große Gewebestücke bewirkt, dass der Dissociator unsachgemäß arbeiten, bitten um wieder läuft. Dies wird ernsthaft die Lebensfähigkeit der Zellen zu schaden. Die Begrenzung der Technik ist, dass die Zellzahlen aus einer einzelnen 4 mm Hautbiopsie abgeleitet sind nicht genug für die nachfolgende Isolierung von Untermengen von Zellen.

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Acknowledgements

Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt.

XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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