Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

La peau humaine a une fonction de barrière importante et contient diverses cellules du système immunitaire qui contribuent à l'homéostasie tissulaire et la protection contre les agents pathogènes. Comme la peau est relativement facile d'accès, il offre une plateforme idéale pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire périphériques. cellules résidentes immunitaire en bonne santé conduite de la peau immunosurveillance, mais aussi jouer un rôle important dans le développement des troubles inflammatoires de la peau, comme le psoriasis. En dépit des idées émergentes, notre compréhension de la biologie sous-jacente diverses maladies de peau inflammatoire est encore limitée. Il est nécessaire pour les populations (unique) de cellules isolées de bonne qualité à partir d'échantillons de biopsie de la peau. Jusqu'à présent, les procédures d'isolement ont été gravement entravées par l'absence d'obtention d'un nombre suffisant de cellules viables. L'isolement et l'analyse subséquente ont également été affectés par la perte des marqueurs de la lignée de cellules immunitaires, en raison de la contrainte mécanique et chimique provoquée par les procédés actuels de dissociation pour obtenirsuspension cellulaire unique. Ici, nous décrivons une méthode modifiée pour isoler les cellules de la peau humaine saine et psoriatique impliquée T en combinant la dissociation mécanique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé et le traitement par la collagénase. Cette méthode conserve l'expression de la plupart des marqueurs de la lignée immunes telles que CD4, CD8, et Foxp3 CD11c lors de la préparation des suspensions de cellules isolées. Des exemples d'isolement réussi CD4 + des lymphocytes T et phénotypiques ultérieure et analyse fonctionnelle sont montrées.

Introduction

La peau, comme la principale interface entre le corps et l'environnement, fournit la première ligne de défense contre physique externe, chimiques et biologiques des insultes telles que la blessure, le rayonnement ultraviolet et les micro-organismes. La peau se compose de deux compartiments, l'épiderme et le derme, et contient une variété de cellules immunitaires , y compris les cellules de Langerhans, les macrophages, les cellules dendritiques (DCs), et environ 20 milliards de cellules T mémoire, près de deux fois le nombre présent dans l'ensemble du volume sanguin 1 , 2. Un nombre croissant de données soutient l'idée que la peau a des fonctions immunologiques essentielles, à la fois lors de l'homéostasie tissulaire et dans diverses conditions pathologiques. Les cellules immunitaires résidentes dans la peau normale sont pensés pour mener immunosurveillance 3 et ont été montré à jouer un rôle dans le développement de troubles inflammatoires tels que le psoriasis 4. Dans la peau lésionnelle psoriasique, CD4 + et CD8 + infiltrés cellules T étaient obsdé- laissées , et on a montré que le rapport entre le CD4 et CD8 varie en fonction de l'état de la maladie 5. Cependant, ces populations de cellules sont difficiles à étudier parce que les techniques existantes permettent l'isolement des seules cellules rares.

Les techniques actuellement largement utilisées pour l'isolement de la peau humaine des cellules T combinent mécanique dissociation de la peau avec un traitement enzymatique. Les biopsies de peau humaine sont largement émincées et incubées avec des enzymes comme la trypsine, la collagénase et / ou EDTA 6-8. Considérant que la peau est un tissu de la barrière qui est très résistant aux efforts de traction et de désagrégation mécanique, les méthodes établies d'isolement des cellules T produisent très peu de cellules, et même un nombre plus faible de cellules viables, ce qui rend culture ex vivo de cellules de ces populations cellulaires difficile et difficile.

Nous rapportons ici une méthode modifiée pour isoler les lymphocytes de la peau humaine psoriasique sain et impliqué en combinant mechanla dissociation ique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé au lieu de la méthode établie de hachage largement, avec une digestion enzymatique à l'aide de la collagénase. Divers sous-ensembles de cellules immunitaires viables, y compris les DC et les lymphocytes T ont été observées après la préparation d'une suspension à cellule unique. Il est important de l'expression des marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8 a été bien conservée. Les cellules ainsi préparées sont prêts à être utilisés ex vivo dans des cultures cellulaires ou par cytométrie de flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l'analyse de biopsies cutanées unique (4 mm) dérivées de la peau lésionnelle des patients atteints de psoriasis. Les résultats ont montré que les cellules T du patient de la peau résidente produites cytokines plus inflammatoires comme l' IL-17 et d' IFNy par rapport aux volontaires sains 9.

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Protocol

NOTE: Les biopsies cutanées provenant d'individus sains ont été obtenus à partir des restes de l'abdomen de la peau des individus subissant une chirurgie plastique facultative après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique. L'utilisation de la peau humaine a été approuvé et en conformité avec les règlements établis par les comités d'éthique médicale pour la recherche humaine du centre médical universitaire Radboud, Nijmegen, aux Pays-Bas et de l'Université d'Essen, en Allemagne.

1. Préparation de la cellule unique Suspensions de la peau humaine (travail stérile dans un flux d'armoire si la suite Culture cellulaire est requis)

  1. Préparer un milieu de culture cellulaire: RPMI 1640 + pénicilline / streptomycine (concentrations finales de 100 unités / ml et 100 pg / ml, respectivement) + pyruvate (0,02 mM) et du glutamax (0,02 mM), sans sérum ajouté.
  2. Préparer le milieu de culture complet: milieu de culture préparé à l'étape 1.1 + 10% de sérum humain rassemblé (HPS); stocker à 4 ° C. Apportez moyenne à 20 ° C ± 2 devant nousing.
  3. Obtenir la biopsie de la peau à l'aide d'un instrument de biopsie de poinçon rond 4mm et le garder dans RPMI1640 milieu de culture complet à 20 ° C ± 2 pour un maximum de 4 heures ou à 4 ° C ON. Traiter la biopsie dès que possible après leur arrivée au laboratoire.
    REMARQUE: un stockage prolongé de la peau aura une influence sur le rendement de la cellule et la viabilité des cellules.
  4. Etiqueter un tube de dissociation bleu-capped et ajoutez 5 ml de milieu de culture complet dans le tube étiqueté.
  5. Ajouter 2 ml de milieu de culture complet dans chaque puits (au total 3 puits) d'un 6 puits plaque de culture stérile. Utiliser des outils stériles pour placer la biopsie dans un seul puits, rincer, le déplacer vers un second puits et répétez cette étape une fois de plus, réalisant ainsi un total de trois rinçages.
  6. Transférez la biopsie bien rincés de la peau à une boîte de Petri stérile, ajouter 100 ul de milieu de culture complet sur le dessus de la biopsie, et soigneusement gratter le tissu adipeux sous-cutané à l'aide d'un scalpel stérile jetable en acier inoxydable.
    NOTE: Thest est une étape critique.
  7. Couper chaque biopsie de la peau en 4 morceaux plus petits sur une boîte de Pétri stérile. Des échantillons de transfert (jusqu'à quatre biopsies de 4 mm par tube) dans le tube de dissociation préparée contenant 5 ml de milieu de culture complet.
  8. Bien refermer les tubes avec le bouchon, et fixer la tête en bas sur le manchon du dissociateur de tissu automatisé. Assurez-vous que tout le matériau d'échantillon est situé dans la zone du rotor.
  9. Démarrer le processus de dissociation en exécutant le "_01 programme m_spleen" (un programme prédéfini fourni par la mémoire interne de l'instrument ou par la carte de programme accompagné) de dissocier la biopsie à la vitesse de rotation appropriée pour 56 sec.
  10. Après le traitement, détacher le tube de dissociation de la dissociateur et assurez-vous que tout le matériel dissocié est recueilli au fond du tube.
  11. Ajouter 150 ul collagénase IA (80 mg / ml) dans le tube de dissociation et incuber l'échantillon dans un bain d'eau agité à 37° C pendant 60 min. Ajouter 100 ul de DNase I (5 MU / ml) dans le tube de thedissociation, bien mélanger.
    Remarque: Une plus forte concentration de la collagénase ou de plus longue durée d'incubation va modifier la viabilité cellulaire.
  12. Fixez le tube de dissociation au manchon du dissociateur de tissu automatisé et exécuter le programme "m_ rate _01" de dissocier la biopsie une fois de plus.
  13. Placer une cellule de nylon tamis de 70 pm sur la partie supérieure d'un tube Falcon de 50 ml. Appliquer des matériaux d'échantillons dissociées à ce tamis cellulaire pour éliminer les amas de cellules / débris de tissu.
  14. Laver tamis cellulaire une fois avec 5 ml de milieu de culture complet. Centrifuger à 20 ° C ± 2 450 g pendant 10 min et le surnageant aspiré.
  15. Répétez l'étape de lavage une fois de plus. Remettre en suspension les culots de cellules dans 300 ul de milieu de culture complet. Les suspensions de cellules uniques sont prêts pour une analyse plus approfondie; poursuivre avec les protocoles de culture ex vivo de cellules ou une analyse par cytométrie en flux.
  16. En cas de nouvelle intracellular coloration des cytokines, stimulent les cellules avec du PMA (12,5 ng / ml), de l' ionomycine (500 ng / ml) et Brefeldine A (5 ug / ml) pendant 4 heures à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 4 heures avant de procéder à l' écoulement analyse cytométrie.

2. polyclonaux Activation des cellules T de la peau-résident (Ex Vivo culture cellulaire)

  1. Aliquote de 100 ul suspensions unicellulaires (préparé à l'étape 1.15) dans une plaque à fond rond de 96 puits.
    NOTE: Pour chacun de 4 mm biopsie de la peau, les suspensions monocellulaires acquises peuvent être divisées en au moins deux puits d'une plaque de 96 puits.
  2. Ajouter des microbilles anti-CD28 anti-CD3 / Acm revêtues (25.000 billes par puits), une cytokine recombinante humaine rIL-2 (concentration finale de 25 U / ml) et de la rIL-1 ß (concentration finale de 50 ng / ml).
  3. Couvrir la plaque de culture avec un couvercle de plaque bien marqué, incuber dans 5% de CO 2, 100% d' humidité, 37 ° C incubateur. Changer le milieu lorsque la couleur moyenne devient jaune.

3. Analyse de cytométrie en flux de primaire / Cultured cellules de la peau-résident T

  1. Préparer un tampon FACS: PBS + 0,2% de BSA.
  2. Transfert des cellules d'intérêt dans une plaque à 96 puits à fond en V. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  3. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  4. cellules Stain avec 100 pi de eFluorescence780 préparés conjugués colorant de viabilité fixable (1: 1000 dilution en utilisant PBS) à 4 ° C pendant 30 min. Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  5. Sélectionner requises mAb marqueurs de surface cellulaire, par exemple: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-DJE (UCHT1, 01:50), CD4 PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01h50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01h50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), et CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), préparer le mélange en utilisant des mAb-tampon FACS en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d'isotype d'anticorps avec l'échantillon non-tache.
  6. Ajouter 25 ul de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber 20 min à 20 ° C ± 2, protéger de la lumière.
  7. Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  8. Pour les échantillons qui ne nécessitent que la surface cellulaire coloration, passez à l'étape 3.16.
  9. En cas de coloration intra-cellulaire de Foxp3:
    1. Préparer un tampon de fixation et de perméabilisation en mélangeant une partie de concentré avec 3 parties de diluants.
    2. Préparer le tampon de perméabilisation 1x: 1 partie de 10x perméabilisation tampon + 9 parties de H 2 O. stérilisée
  10. Granulés Remettre en suspension dans 100 pi de fixation et permeabilitampon portant, bien mélanger, et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
  11. Ajouter 100 tampon de perméabilisation ul à chaque puits, centrifuger à 450 xg à température ambiante pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  12. Laver les cellules avec perméabilisation tampon une fois de plus.
  13. Sélectionnez mAb intracellulaires nécessaires, par exemple, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1h50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) et IFNy PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Préparer le mélange mAb en utilisant un tampon de perméabilisation contenant 2% de sérum de rat normal en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d'isotype d'anticorps avec l'échantillon non-tache.
  14. Ajouter 20 pi de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, protéger de la lumière.
  15. Au bout de 30 minutes d'incubation, ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation dans chaque puits. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  16. Laver les cellules avec perméabilisation buffer une fois de plus. Remettre en suspension le culot dans 110 pl de tampon FACS, et des suspensions de cellules de transfert dans microFACS tube.
    NOTE: L'échantillon est prêt pour la mesure en utilisant 10 couleurs cytométrie en flux.
  17. Dans le cas du nombre de cellules exacte nécessaire, ajouter 10 pl de suspension uniforme bien mélangée de fluorosphères dans chaque échantillon immédiatement avant d'effectuer des mesures par cytométrie en flux.

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Representative Results

Le protocole présenté ici donnera entre 2.200 ± 615 (moyenne ± SEM, la peau des volontaires en bonne santé) jusqu'à 178.000 ± 760 (moyenne ± SEM, la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis) lymphocytes viables de la peau humaine lors de l'utilisation d'un seul 4 mm biopsie de la peau.

Différents types de CD45 + cellules ont été identifiées dans une seule cellule suspensions dérivées de la peau des individus en bonne santé , y compris les lymphocytes T CD4 + (~ 45%), les lymphocytes T CD8 + (~ 30%), et CD11c + DC (~ 5% ), tandis que quelques cellules B (CD19 + de ), des cellules NK (CD56 + CD3 + -), ou les monocytes / macrophages (CD14 + ou CD1c +) ont été observées (figure 1A). La méthodologie permet également l'analyse de cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + dans les cellules de biopsies de peau humaine. En utilisant une coloration intra-cellulaire après fixation et perméabilisation, il est possible de démontrer l'expression de la transcription factor Foxp3 dans les cellules CD25 + (figure 1A).

suspensions mono-cellulaires dérivées de biopsies de peau humaine ont montré un fond de haute autofluorescence en FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (bleu pacifique) et FL10 (chrome orange) canaux en utilisant un cytomètre (données non présentées) . Pour une analyse correcte de la population des lymphocytes, nous recommandons donc l'utilisation d'un CD45 mAb anti-humain conjugué avec un Brilliant Violet 421 fluorochrome pour gating de la population de lymphocytes et de l' exclusion de la population de cellules autofluorescente (figure 1B). La majorité des cellules résidentes de la peau humaine sont des cellules T CD3 + (figure 1c). Pour l' analyse de la viabilité des cellules , il est recommandé d'utiliser un colorant de viabilité fixable de distinguer viables à partir de cellules mortes / mourantes (Figure 1C). Généralement, ce protocole résultats dans 65,3% ± 7,7 (moyenne ± SD) des cellules viables. Pour une analyse plus approfondie de la cytométrie de flux de données, il est advised à la porte sur la population de cellules viables, étant donné que les cellules mortes ou mourantes perdent leur intégrité de la membrane cellulaire et ne peut pas se lier spécifiquement à un anticorps conjugué, ce qui augmente la coloration de fond.

les lymphocytes T isolés par ce protocole sont bien adaptés pour une analyse plus poussée fonctionnelle. En utilisant un seul 4 mm , une biopsie de peau lésionnelle des patients atteints de psoriasis, on a montré que les cellules T de biopsie dérivé produites IL-17A et IFNy 4 suivant une stimulation heures avec du PMA / ionomycine en présence de bréfeldine A (figure 2).

Fraîchement préparé des suspensions de la peau seule cellule de lésions cutanées psoriasiques impliqués peuvent également être utilisés pour de plus amples ex vivo culture cellulaire et l' analyse fonctionnelle subséquente. Suite à l' expansion après stimulation polyclonale avec des microbilles anti-CD3 / anti-CD28 mAb revêtu par la présence des cytokines pro-inflammatoires IL-1 ou IL-23 pendant 8 jours, les cellules peuvent par exemple être analysés pour leur cytokine capacité de production (Figure 3). Ce faisant, une nette différence entre le potentiel de cytokine produisant des cellules dérivées de la peau des individus sains et psoriasiques a été observée. les cellules provenant d'individus psoriasiques T ont montré une capacité beaucoup plus élevée pour produire le psoriasis associé cytokines IL17A et IFNy. Cela implique que , même après culture ex vivo un prototypique psoriasis cytokine phénotype est maintenue, absente dans le cas des contrôles sains.

Figure 1
Figure 1:. Différents types de leucocytes ont été identifiés dans des suspensions mono-cellulaires dérivées de la peau des individus sains lymphocytes résidents de la peau isolée en utilisant le protocole décrit dans le texte ont été colorées avec des mAb conjugués à un fluorochrome d'intérêt ainsi que fixables colorant de viabilité et immédiatement analysées par cytométrie de flux. (A) Débit cyla détection tometric des monocytes (CD14), les DC (CD11c), les lymphocytes B (CD19), les cellules NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + et CD25 + Foxp3 + sous - groupes de lymphocytes résidents de la peau. CD45 anti-humain / BV421 mAb distingue les lymphocytes provenant de cellules autofluorescents. Les stratégies utilisées pour la transmission sélective des cellules CD45 + est représenté dans (B). (C) Pourcentage de CD45 + viables cellules T CD3 + après isolement. Le numéro indique le pourcentage de cellules positives. Une expérience représentative sur trois expériences / donneurs différents est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: les cellules T dérivées de la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis peuvent produCE IL-17A et IFNy. Un seul 4 mm biopsie de la peau a été prise à partir de la peau lésionnelle du psoriasis patient lors par voie orale ou écrite du consentement éclairé à usage scientifique. Les cellules T résidentes de la peau ont été isolés en utilisant le protocole décrit dans le texte. La production d'IL-17A et d'IFNy par les cellules T résidentes de la peau. l'accumulation intracellulaire de cytokines en réponse à une stimulation 4 heures avec du PMA / ionomycine en présence de Brefeldine A a été mesurée par cytométrie en flux. Pourcentage de cellules positives aux cytokines est représentée. Les données de trois patients différents sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: les cellules T peau-résident sont capables de produire de l' IL-17A et IFNy suivante ex vivo A) ou l' IL-23 (50 ng / ml, B) pendant 8 jours. Ensuite, les cellules ont été stimulées pendant 4 heures avec du PMA / ionomycine en présence de bréfeldine A et analysés par la suite pour la production de cytokines intracellulaires par cytométrie en flux. Un exemple représentatif de trois expériences indépendantes / donateurs est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole pour isoler efficacement les cellules T résidentes de la peau à partir de biopsies de peau humaine. L'avantage de ce protocole est l'isolement d'un nombre relativement élevé de lymphocytes viables, et l'expression des marqueurs de surface appropriés. Les sous - ensembles de cellules identifiées sont:, les cellules CD11c + PED CD4 + et CD8 + et Foxp3 + CD25 +. Surtout, culture ex vivo des lymphocytes T isolés de résidents de la peau était très bien faisable et a permis l' analyse fonctionnelle ultérieure.

La peau humaine peut être dissocié en suspension à cellule unique en combinant dissociation mécanique à la dégradation enzymatique des protéines d'adhésion extracellulaire qui servent à maintenir l'intégrité structurale des tissus. Bien que la dispase séparation des couches à base de l'épiderme et du derme est une méthode largement utilisée pour déterminer l'infiltration de cellules dans ces couches de peau respectives, nous avons remarqué que dispase traitement a conduit toa réduction importante de l'expression de surface cellulaire de CD25 et CD27 (non représenté). Etant donné que ces marqueurs sont importants pour caractériser les sous-populations lymphocytaires, nous pensons que la dispase influence du traitement ultérieur immunophénotypage. Il est peu probable que l'élimination du derme est responsable de la diminution observée dans les cellules exprimant le CD25 ou le CD27, étant donné que dans la peau des individus sains , la majorité des lymphocytes T est localisé dans le derme tandis que le nombre minute de lymphocytes T sont présents dans l'épiderme 10 -12. L'effet nuisible de la dispase sur la capacité de prolifération des kératinocytes isolés a été rapporté précédemment 13. Par conséquent, l'utilisation prudente des dispase est justifiée si la fonction des cellules est le but de l'étude. Dans notre protocole, nous avons eu recours à la collagénase de type I pour obtenir une suspension cellulaire unique de biopsies de peau. Bien que la collagénase I a une activité tryptique élevé par rapport à la collagénase IV et donc est plus sévère, nous avons choisi ce collagénase particulier parce qu'il a été tested pour son aptitude à la culture cellulaire. L'utilisation d'une collagénase IV, qui est approprié pour la culture cellulaire peut être une étape future pour optimiser davantage notre protocole actuel.

En raison de sa nature, la peau est très résistant aux forces de traction et de désagrégation mécanique. Jusqu'à présent, une analyse complète des cellules immunitaires dans la peau humaine a été entravée par des difficultés techniques pour obtenir le nombre de cellules suffisant lors de l'utilisation des protocoles de digestion relativement sévères. En conséquence, la plupart des études publiées à ce jour reposent sur des analyses immunohistochimiques. L'isolement direct de cellules T CD4 + à partir de biopsies de la peau est généralement considérée comme lourde. Une autre solution serait l'utilisation d'explant de peau ramper sur les cultures 10. Cependant, ceux-ci prennent 2-3 semaines de culture, et le milieu de culture des explants de peau contient un ensemble sélectionné de cytokines et de chimiokines, ce qui pourrait conduire à ramper préférentiel de sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T. En outre, la période de culture peut affect le phénotype des cellules. Le protocole actuel ne fait pas usage de cytokines ajoutées ou chimiokines, et l'expression de CD4 (et aussi d'autres marqueurs de cellules) est bien conservée après l'isolement, ce qui permet à la fois phénotypique et étude fonctionnelle des populations de lymphocytes T directement après l'isolement.

Un dissociateur tissulaire automatisé disponible dans le commerce est utilisé pour la dissociation des fragments de peau avant leur incubation avec de la collagénase, nécessaire à la dégradation de la matrice extracellulaire. La libération ultérieure des cellules de la matrice extracellulaire, le dissociateur automatisé est utilisé à nouveau. Bien que vaste coupe manuelle de la peau peut donner le nombre de cellules similaires (données non présentées), les résultats sont moins cohérentes et sont plus dépendants de l'expérience de l'artiste. Dissociation de la peau en utilisant la procédure prédéfinie offerte par l'instrument donnera des résultats beaucoup plus reproductibles. Conformément aux études précédentes montrant que la peau contient divers leukocytes sous - ensembles 2,14, CD11c + cellules PED, CD8 + et T CD4 + et Foxp3 + cellules ont été observées dans les populations monocellulaires préparées par le protocole présenté ici. Fait important, le protocole donne un rendement relativement élevé de lymphocytes viables. En raison de l'efficacité du protocole, il est particulièrement utile lors de l'étude de la matière du patient, où souvent un seul 4 mm biopsie de la peau peut être obtenue. En utilisant la méthode, nous avons pu montrer que les cellules T isolées de la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis ont montré une plus grande capacité à produire de l' IL-17A et IFNy par rapport à une peau saine 9.

En fonction de la question de recherche, il peut être nécessaire de purifier davantage certains sous-ensembles de cellules après la préparation des suspensions de cellules isolées. Dans ce cas, les gros morceaux de la peau peuvent être utilisés pour assurer le rendement des cellules suffisantes pour les analyses sous-ensemble. Ce faisant, assurez-vous que la peau doit être coupé en petits pieces d'environ 2 mm x 2 mm avant de commencer le protocole d'isolement.

En conclusion, le présent protocole offre un moyen amélioré pour isoler les cellules résidentes de la peau, ce qui facilite phénotypique significative et l'analyse fonctionnelle au niveau de la cellule unique, améliorant ainsi notre connaissance dans les réponses immunitaires de la peau.

Les étapes critiques dans le protocole actuel sont la bonne élimination des tissus adipeux sous-cutané et la coupe de la peau en petits morceaux, en particulier lors du traitement de plus d'une biopsie dans un tube de dissociation. Le tissu adipeux et / ou de gros morceaux de tissus vont provoquer la dissociateur de travailler correctement, demandant des rediffusions. Cela va sérieusement nuire à la viabilité des cellules. La limitation de la technique est que le nombre de cellules dérivées d'un seul 4 mm biopsie de la peau ne sont pas suffisantes pour l'isolement subséquent de sous-ensembles de cellules.

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Acknowledgements

Les biopsies cutanées de patients atteints de psoriasis ont été aimablement fournies par le Dr Andreas Koerber (département de dermatologie à l'Université d'Essen, Allemagne) après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique.

XH est également soutenu par NSFC 61263039 et 11101321 NSFC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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