चूहे में ठंड संवेदनशीलता और अनुकूलन के निर्धारण के लिए एक सरल और सस्ता तरीका

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

कृन्तकों में ठंड जवाबदेही मापने दोनों सामान्य और रोग की शर्तों के तहत मानव में ठंड संवेदनशीलता के संभावित तंत्र की समझ में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। शीत तल परख (सीपीए), मूल रूप से पहले एक कई साल, आरटी पर दिया ठंड प्रोत्साहन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्पष्ट murine व्यवहार प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है विकसित की है। इस परख की और हाल ही में संवर्द्धन तापमान दो की एक विस्तृत श्रृंखला में ठंड संवेदनशीलता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप की अनुमति दी है। दोनों संस्करणों की भी अपेक्षाकृत उच्च throughput, और उपयोग करने के लिए सस्ती होने के लिए तैयार कर रहे हैं।

प्रगति का एक बड़ा सौदा अन्य व्यवहार तरीकों का उपयोग कर ठंड संवेदनशीलता के तंत्र को समझने में किया गया है। एक विधि dabbing या माउस पंजा पर एसीटोन छिड़काव और माउस पंजा 3,4 flicking खर्च करता है समय की राशि को मापने शामिल है जो एसीटोन वाष्पीकरण परीक्षण है। दुर्भाग्य से,एसीटोन वाष्पीकरण के लिए प्रतिक्रियाओं गीला सनसनी और एसीटोन की गंध से चकित कर रहे हैं। इसके अलावा, एसीटोन वाष्पीकरण की परीक्षा में लागू किया जाता है कि ठंड उत्तेजना लागू किया एसीटोन की मात्रा पर आधारित है, और जिसका अंदाजा लगाना मुश्किल है पर भिन्न हो सकते हैं। अंत में, रिहाई चूहे, आधारभूत में एसीटोन करने के लिए कम से कम प्रतिक्रिया है कि यह असंभव इस विधि के साथ अतिसंवेदनशीलता के अभाव में analgesia के उपाय करने के लिए कर रही है।

ठंड प्रतिक्रियाओं के लिए एक और शास्त्रीय परख पूंछ ठंडे पानी 5,6 में डूब जाता है के बाद वापसी के लिए विलंबता मापा जाता है जहां पूंछ झटका परख है। इस परख में व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्पष्ट कर रहे हैं और परख के लिए एक विशिष्ट तापमान के लिए प्रतिक्रियाओं के उपाय करते हैं, जानवरों के साथ अच्छी तरह से वर्णित तनाव प्रेरित एनाल्जेसिक तंत्र 7 के माध्यम से ठंड जवाबदेही को बदल सकते हैं, जो परीक्षण के दौरान रोका जाना चाहिए।

एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण व्यवहार जो उपाय ठंड प्लेट परीक्षण है,चूहों की प्रतिक्रियाएं वे एक Peltier ठंडा प्लेट 8-10 पर रखा जाता है के बाद। इस उपकरण विशिष्ट तापमान पर पशु प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, यह भी असंगत इस्तेमाल किया गया है; विभिन्न समूहों कूदता 8,11 की संख्या, पहली प्रतिक्रिया 8,11- से 13 विलंबता सहित प्रतिक्रियाओं के विभिन्न प्रकार मापा है, और पंजा की संख्या बहुत अलग परिणामों के साथ 11,13,14 हटाया। ठंड प्लेट परख भी एक समय में परीक्षण किया जा सकता है केवल एक पशु के रूप में अपेक्षाकृत कम throughput है, और यह एक महंगी और नाजुक Peltier डिवाइस की आवश्यकता है।

2-प्लेट तापमान वरीयता परीक्षण जानवरों अलग तापमान 9,15- 17 में से 2 जुड़े प्लेटों पर खर्च करते हैं कि समय के रिश्तेदार राशि उपाय है कि ठंड प्लेट परीक्षण का आमतौर पर इस्तेमाल किया व्युत्पन्न है। इसी तरह एक अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया परख थर्मल ढाल परख, चूहों अलग तापमान क्षेत्रों में खर्च करते हैं उस समय की है, जहां राशि हैएक लंबी धातु की थाली पर 5 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस के बीच लेकर 16 मापा जाता है। इन assays तापमान की तुलना की अनुमति है, यह व्यवहार तापमान घृणा या तापमान पसंद करने का प्रतिनिधित्व करता है कि क्या यह स्पष्ट नहीं है।

अंत में, गतिशील ठंड प्लेट परख चूहों परिवेश तापमान 18 बदलने के लिए प्रतिक्रिया कैसे को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस पद्धति का एक आर टी Peltier डिवाइस पर चूहों रखने और चूहों कूद या अलग प्लेट तापमान पर अपने पंजे चाटना कितना मापने, जबकि एक डिग्री सेल्सियस के लिए इसे नीचे ramping शामिल है। इस चूहों एक शीतलन पर्यावरण के लिए अनुकूल कैसे परीक्षण करती है, यह चूहों एक कूलर परिवेश के तापमान की सेटिंग में एक ठंड उत्तेजना का जवाब कैसे परीक्षण करने के लिए एक तरीका प्रदान नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शन करने के लिए महंगे उपकरण की आवश्यकता है और उनके ठंड संवेदनशीलता को मापने से पहले परीक्षण उपकरणों के लिए चूहों acclimate करने के लिए एक तरीका प्रदान नहीं करता है।

इन assays के पूरक हैं, सीपीए acclima testsतापमान पर्वतमाला की एक किस्म पर एक अच्छी तरह से परिभाषित ठंड प्रोत्साहन के लिए टेड प्रतिक्रियाओं, या ठंडे तापमान परिवेश के लिए अनुकूल करने की प्रक्रिया के दौरान। यह सस्ते में उच्च throughput परीक्षण के लिए बढ़ाया जा करने की क्षमता के साथ, हमारे वर्तमान तंत्र के साथ एक समय में 14 चूहों को जांच कर सकता।

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Protocol

सभी माउस प्रोटोकॉल स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार थे और चिकित्सा के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल के जानवरों के अध्ययन समिति (सेंट लुइस, MO) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. परीक्षण प्लेट और बाड़ों की तैयारी

  1. कांच की सतह को साफ।
  2. प्रयोगशाला टेप के साथ कांच की थाली के बीच में सतह के लिए टी प्रकार रेशा thermocouple के जांच सुरक्षित।
  3. थाली के बीच के साथ एक पंक्ति में कांच की प्लेट पर पशु बाड़ों रखें।
  4. केंद्र पशु बाड़े के माध्यम से thermocouple के जांच धागा और डेटा लकड़हारा में प्लग। ऑटो शट डाउन सुविधा निष्क्रिय जबकि पर डेटा लकड़हारा बारी है, और प्रदान की केबल के साथ कंप्यूटर से डेटा लकड़हारा देते हैं।
    1. प्रयोग के दौरान प्लेट तापमान रिकॉर्डिंग, तो थाली तापमान रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए डेटा लकड़हारा सॉफ्टवेयर खुला।
    2. यदि आवश्यक हो, फिर से करने के लिए सॉफ्टवेयर को समायोजितकॉर्ड थाली तापमान में एक बार हर दूसरा।
    3. थर्मल डेटा लकड़हारा के साथ पैक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तापमान रिकॉर्डिंग शुरू।
  5. चूहों के बीच दृश्य बातचीत को रोकने के लिए काला आवेषण के साथ बाड़े अलग करें।
  6. स्थिति बाड़ों के नीचे एक आरामदायक बैठा स्थिति से दिख रहा है कि इस तरह के कांच के नीचे दर्पण।

2. वार्मिंग / ग्लास प्लेट शीतलक

  1. गरम पानी, गीला बर्फ, या सूखी बर्फ के साथ एल्यूमीनियम बक्से भरें और कांच की थाली पर उन्हें उचित स्थान (सूखी बर्फ से भरा एल्यूमीनियम पन्नी के पैकेट भी कांच शांत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चित्रा 1) 2।
    1. 30 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण के लिए, दूर पशु बाड़ों (चित्रा 2 बी) 2 से '' लगभग 0.25 एल्यूमीनियम बक्से की स्थिति।
      1. कांच की थाली के दोनों तरफ एक गर्म पानी फैलानेवाला सेट करें। 45 फैलानेवाला सेट - 60 डिग्री सेल्सियस, और हमेंगर्म पानी (चित्रा 1C) 2 की एक सतत स्ट्रीम के साथ एल्यूमीनियम बॉक्स को भरने के लिए यह ई।
      2. Circulators स्थित करें एल्यूमीनियम बक्से से गर्म पानी सीधे वापस प्रत्येक पक्ष (चित्रा 1C) पर फैलानेवाला के जलाशय में नालियों कि दो।
    2. आरटी पर परीक्षण के लिए, बक्से खाली (चित्रा 2) दो को छोड़ दें।
    3. (चित्रा 2) 17 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण के लिए, दूर दोनों तरफ पशु बाड़ों से '' लगभग 0.25 बक्से स्थिति और गीला बर्फ से भरना दो।
    4. (चित्रा 2) 12 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण के लिए, दूर दोनों तरफ बाड़ों से '' लगभग 1.25 बक्से स्थिति और सूखी बर्फ के साथ भरें दो।
    5. (चित्रा 2) 5 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण के लिए, लगभग 0.25 '' दूर दोनों तरफ बाड़ों से बक्से स्थिति और सूखी बर्फ के साथ भरें दो।
      1. सूखी बर्फ के साथ कांच को ठंडा करते हैं, कमरे में सीओ 2 buildup को रोकने के लिए पर्याप्त वेंटिलेशन नहीं है सुनिश्चित करें।
  2. वांछित तापमान रेंज तक पहुँचने के लिए कांच के लिए प्रतीक्षा करें।
  3. थाली पर बाड़ों को चूहों जोड़ें।
    ध्यान दें: एक सफेद शोर जनरेटर शोर गड़बड़ी को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. चूहों acclimate करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    नोट: हमारी सुविधा में इस मोटे तौर पर 2.5 घंटा लेता है, लेकिन इस पशु आवास और हैंडलिंग शर्तों के आधार पर काफी भिन्न हो सकते हैं।
  5. बक्से गरम पानी, गीला बर्फ, या सूखी बर्फ से भरा रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के द्वारा वांछित तापमान रेंज में कांच बनाए रखें।
    नोट: हमारी तंत्र के साथ बक्से बर्फ मोटे तौर पर हर 90 मिनट के साथ refilled किया जाना चाहिए।
    नोट: 17 डिग्री सेल्सियस हालत के लिए, यह बर्फ के साथ यह refilling से पहले नाली छेद के माध्यम से एल्यूमीनियम बक्से से पानी की सबसे खाली करने के लिए उपयोगी है। इस तापमान बेहतर है, और जनसंपर्क स्थिर होगाघटना अतिप्रवाह
    नोट: सूखी बर्फ की सही मात्रा मौसम में भिन्नता है, लेकिन सामान्य रूप में तापमान स्थिर रखेंगे बॉक्स की पूरी लंबाई के साथ पूर्ण से अधिक बक्से ¼ छोटा रखने जाएगा।

निश्चित तापमान पर 3. परीक्षण चूहे

  1. व्यवहार कमरे के बाहर, सूखी बर्फ के बारे में आधा भरा एक बर्फ बाल्टी भरने।
  2. एक हथौड़ा या लकड़ी का हथौड़ा का उपयोग करना, एक ठीक पाउडर में सूखी बर्फ कुचलने।
    नोट: बाल्टी overfilling यह मुश्किल पूरी तरह से पाउडर में सूखी बर्फ को कुचलने के लिए कर देगा।
  3. एक सीधी रेजर ब्लेड या कैंची का प्रयोग, एक 3 मिलीलीटर सिरिंज शीर्ष काट दिया।
  4. एक 21 जी सुई का प्रयोग, सिरिंज (6 छेद में से कुल) के पक्ष का विरोध करने पर तीन छेद प्रहार।
    नोट: सूखी बर्फ compressing जबकि ये छेद बनाने की क्रिया द्वारा उत्पन्न दबाव कम होगा। कट ऑफ सिरिंज कई प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  5. सिरिंज, सूखी बर्फ पाउडर, और व्यवहार के कमरे में एक हाथ से आयोजित स्टॉपवॉच ले लो।
  6. सूखी बर्फ पाउडर का आधा भरा सिरिंज चैम्बर भरें। एक फ्लैट वस्तु के खिलाफ सिरिंज की कटौती अंत पकड़ो, और मजबूती सवार का प्रयोग पाउडर सेक। ध्यान रहे; प्लास्टिक सवार मोड़ या दबाव से टूट सकता है। यदि ऐसा होता है, एक नई सिरिंज से सवार की जगह।
  7. सिरिंज के किनारे पिछले संकुचित सूखी बर्फ गोली की नोक बढ़ाएँ।
  8. बाकी पर पूरी तरह से कर रहे हैं कि टेस्ट चूहों।
    1. 30 डिग्री सेल्सियस, 23 डिग्री सेल्सियस और 17 डिग्री सेल्सियस से कम, सभी चार गिलास पर पंजे और नहीं है कि परीक्षण चूहों चलती है, लेकिन 19 पूरी तरह से सो नहीं।
    2. 12 डिग्री सेल्सियस और 5 डिग्री सेल्सियस कम, चलती है या कूद दो पंजे या चार पंजे और नहीं पर कर रहे हैं कि परीक्षण चूहों।
  9. धीरे, लक्ष्य-निर्धारण के लिए दर्पण का इस्तेमाल, लेकिन मजबूती से माउस hindpaw (चित्रा 1 ए) 2 नीचे कांच की सतह के खिलाफ फ्लैट गोली फ्लश दबाएँ। हाथ-टाइमर शुरू करो।
  10. टाइमर बंद करो और माउस दूर ठंडा गिलास से चलता रहता है जब गोली निकालें।
    नोट: वापसी के आंदोलन खड़ी या क्षैतिज हो सकता है।
    1. माउस बहुत संक्षेप में पंजा चलता रहता है और फिर ठंडा सतह के लिए यह रिटर्न तो माउस दूर एक स्थायी कदम बनाता है, जब तक समय और उत्तेजक जारी है।
      नोट: हमारी प्रयोगशाला मामलों के बहुमत में चूहों के लिए 20 सेकंड की एक अधिकतम प्रोत्साहन समय का उपयोग करता है।
  11. प्रत्येक जानवर के प्रत्येक पंजा पर कम से कम 3 मूल्यों एकत्र कर रहे हैं जब तक इस परीक्षण की प्रक्रिया को दोहराएं। कम से कम 15 मिनट से किसी एक पंजा पर कम से कम 7 मिनट, और अलग लगातार परीक्षणों द्वारा एक ही माउस पर विपरीत पंजे का परीक्षण अलग परीक्षणों।
  12. यदि आवश्यक हो, ठंडा (चित्रा 3) एक के विभिन्न दरों उत्पन्न करने के लिए कांच के विभिन्न मोटाई का उपयोग करें।
    नोट: ठंडा करने की दर व्युत्क्रमानुपाती कांच की मोटाई के साथ जोड़ा जाता है।

4. शीत अनुकूलन के दौरान चूहों का परीक्षण

नोट: यह कांच बेनी के रूप में परीक्षण की अनुमति देता है जो एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल हैई बल्कि प्लेट स्थिर हो गया है और चूहों पूरी तरह से ठंडे वातावरण के लिए अनुकूल है एक बार से अधिक, ठंडा।

  1. तंत्र स्थापित करने के लिए धारा 1 में सूचीबद्ध निर्देशों का पालन करें।
  2. आर टी (चित्रा 7A) 2 में आधारभूत माप लेने के लिए धारा 3 में सूचीबद्ध निर्देशों का पालन करें।
  3. सूखी बर्फ के साथ एल्यूमीनियम बक्से पूर्व शांत करते हैं।
  4. आधारभूत वापसी सुप्तावस्था मापा गया है एक बार, दूर बाड़ों से दोनों तरफ थाली लगभग 1.25 '' पर precooled बक्से स्थिति (चित्रा 7A, तीर लेबल "सूखी बर्फ कहा,") 2।
  5. कांच की प्लेट ठंडा के रूप में अक्सर के रूप में संभव के रूप में माप लेने, माप लेने के लिए धारा 3 में सूचीबद्ध निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

30 डिग्री सेल्सियस, 23 डिग्री सेल्सियस, 17 डिग्री सेल्सियस, और 12 डिग्री सेल्सियस पर शुरू चूहों से हासिल व्यवहार प्रतिक्रियाओं अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य (चित्रा -4 ए) 20 हैं। Hindpaw के तहत उत्पन्न किया जा रहा ठंड प्रोत्साहन उपाय करने के लिए, चूहों एक ketamine / xylazine / acepromazine कॉकटेल के साथ anesthetized थे और उनके पंजे एक टी प्रकार रेशा thermocouple (चित्रा 4 बी) 20 के शीर्ष पर कांच पर सुरक्षित थे। गिलास ठंडा या इच्छित परीक्षण रेंज के लिए गरम हो गया था। प्लेट प्लेट (चित्रा 5A) 2 की लंबाई के साथ समान रूप से ठंडा किया जाता है, यद्यपि यह एक ठंडा ढाल व्यवहार बाड़ों (चित्रा 5 ब) दो भर में उत्पन्न होता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। केंद्रीय भागों थोड़ा गर्म (चित्रा 5 ब) 2 रहे हैं, जबकि बाड़ों के दोनों तरफ सूखी बर्फ के करीब हैं कि बाड़े के कुछ हिस्सों, कूलर हैं। ठंडे तापमान में यूSED, चूहे बाड़े के मध्य भाग में अपने समय के अधिकांश खर्च करते हैं। कांच की थाली तापमान स्थिर था एक बार, एक फोकल सूखी बर्फ प्रोत्साहन पंजा / thermode नीचे कांच पर रखा गया था। इस स्थापना से दर्ज तापमान निशान के आधार पर यह सीपीए का उपयोग कर उत्पन्न ठंड उत्तेजनाओं प्रत्येक तापमान रेंज (चित्रा 4C) 20 पर अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि स्पष्ट है।

सीपीए में उत्पन्न ठंड उत्तेजना भी ठंडा (चित्रा 3) की तीव्रता भिन्न करने के लिए कांच के तीन अलग-अलग मोटाई का उपयोग कर मापा गया था। ठंडा करने की दर व्युत्क्रमानुपाती कांच की मोटाई से संबंधित है, और इन मोटाई के किसी भी (चित्रा 3) के रूप में जरूरत ठंड संवेदनशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पिछला काम सीपीए चूहों में एनलजेसिया और अतिसंवेदनशीलता का पता लगा सकते हैं कि दिखाया गया है। अफ़ीम की 1.5 मिलीग्राम / किग्रा के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद 30 मिनट, चूहों काफी एल हैखारा के चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया चूहों की तुलना में वापसी के लिए onger विलंबता (चित्रा 6A: Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एनोवा मुख्य प्रभाव * पी ​​<0.05 2-तरह; 30 मिनट ** पी <0.01; एन = समूह प्रति 12) 1। अफ़ीम / खारा के बाद 60 मिनट तक, चूहों में अफ़ीम चयापचय की दर के अनुरूप है जो saline- और अफ़ीम इंजेक्शन समूहों के बीच कोई अंतर नहीं है।

पूरा Freund के सहयोगी (सीएफए) पहले hindpaw इंजेक्शन 21 के बाद सूजन और अतिसंवेदनशीलता पैदा करने के लिए दिखाया गया है। ** पी <0.01 2 घंटा * पी ​​<0.05, 3 घंटा, Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा मुख्य प्रभाव पी <0.001: सीएफए इंजेक्शन के बाद, सीपीए वापसी सुप्तावस्था (चित्रा 6B 2 और 3 घंटा बाद इंजेक्शन कमी एन = 12 समूह के अनुसार)। 4 घंटा सीएफए इंजेक्शन के बाद, चूहों 1.5 मिलीग्राम / किग्रा अफ़ीम के चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिए गए। अफ़ीम इंजेक्शन, CFA- और खारा इंजेक्शन चूहों दोनों बढ़ गया था withdr के बाद 30 मिनटअवाल 3 घंटा पर उनके सुप्तावस्था के सापेक्ष सुप्तावस्था (चित्रा 6B: Dunnett की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा, सीएफए 4.5 घंटा $$$ पी <0.001, खारा खारा 4.5 घंटा बनाम 3 घंटा बनाम सीएफए 3 घंटा $$$ पी <0.001)। अफ़ीम metabolized किया गया था एक बार एक घंटे बाद, सीएफए इंजेक्शन चूहों को एक बार फिर खारा इंजेक्शन नियंत्रण चूहों की तुलना में कम वापसी सुप्तावस्था था (चित्रा 6B: 2-तरह Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एनोवा; ** पी <0.01) 1।

सबसे स्तनधारी प्रजातियों में अपने पर्यावरण के मैच के लिए उनके तापमान संवेदनशीलता अनुकूल करने की क्षमता है। इन विट्रो, अध्ययन इस अनुकूलन प्रक्रिया रंज दो हाइड्रोलिसिस 22- 24 पर निर्भर है, लेकिन पिछले व्यवहार उपकरण vivo में इस परिकल्पना को मान्य करने में असमर्थ थे कि सुझाव दिया है। सीपीए दो अलग अलग तरीकों से इस अनुकूलन बढ़ाता करने में सक्षम है। गिलास ठंडा के रूप में चूहों की वापसी विलंबता परीक्षण करके ( दो होता है के रूप में एनजी> चित्रा 7A, सी), सीपीए ठंड अनुकूलन उपाय कर सकते हैं। 0 मिनट 12.13 ± 0.8 सेकंड, 30 मिनट = 12.1 ± 1.6 सेकंड, 60 मिनट = 13.2 =: थाली ठंड अनुकूलन सीपीए (चित्रा 7B साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की तुलना में तेजी से होता है, सुझाव है कि ठंडा के रूप में सामान्य परिस्थितियों में वापसी विलंबता अपरिवर्तित है , Bonferroni पद हॉक परीक्षण P> 0.05 से 1.1 सेकंड, 90 मिनट = 10.8 ± 1.2 सेकंड एक तरह से एनोवा ± n = 6) 2। चूहों की थाली से पहले phospholipase-सी अवरोध करनेवाला U73122 25 के इंजेक्शन intraplantar दिया जाता है फिर भी, जब बिगड़ा हुआ है कि अनुकूलन सुझाव, उनकी वापसी सुप्तावस्था घट रहे हैं (चित्रा 7C) ठंडा किया जाता है (चित्रा 7 दिन: आधारभूत = 11.29 ± 0.53 सेकंड, 30 मिनट = Dunnett की पोस्ट-हॉक परीक्षण, मुख्य प्रभाव पी = 0.02, व्यक्तिगत आधारभूत बनाम 30 मिनट पी = 0.02 के साथ एक तरह से एनोवा, एन = 9); 8.09 ± 1.17 सेकंड।

सीपीए भी अटल बिहारी उपाय कर सकते हैंility समय की लंबी अवधि में ठंड परिवेश तापमान लिए अनुकूल है। जंगली प्रकार चूहों 30 डिग्री सेल्सियस, 23 डिग्री सेल्सियस, 17 डिग्री सेल्सियस, या 12 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के बाद सीपीए का उपयोग कर जांच की जाती है जब वापसी विलंबता सुझाव दे, वही सब पर शुरू होने वाले तापमान है कि जंगली प्रकार गुम्मट 30 डिग्री सेल्सियस = 13.23 ± 0.5 सेकंड, 23 डिग्री सेल्सियस = 12.8 ± 0.7 सेकंड, 17 डिग्री सेल्सियस = 12.3 ± 0.9 सेकंड, 12 डिग्री सेल्सियस = 12.8 ± 0.5 सेकंड, 1: चूहों ठंडा परिवेश के तापमान के लिए (2A चित्रा अनुकूलित Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण, पी> 0.05 एन = 6 से 30 डिग्री सेल्सियस के लिए, एन = के साथ जिस तरह एनोवा 15 से 23 डिग्री सेल्सियस, 17 डिग्री सेल्सियस, और 12 डिग्री सेल्सियस) 20 के लिए। शुरुआती तापमान TRPM8-को चूहों की वापसी सुप्तावस्था घटने के रूप में जंगली प्रकार चूहों के विपरीत, (चित्रा वे अपने वातावरण के अनुरूप उनकी प्रतिक्रिया दहलीज अनुकूलन करने में असमर्थ हैं, सुझाव है कि कमी 8: 1-जिस तरह से दोहराया उपायों एनोवा Bonferroni बाद साथ हॉक परीक्षण, मुख्य प्रभाव पी = 1.5 एक्स 10 पुरुषों-5, बनाम 12 डिग्री सेल्सियस। 23 डिग्री सेल्सियस पी = 6 एक्स 10 -5, 17 डिग्री सेल्सियस बनाम 23 डिग्री सेल्सियस पी = 0.004; महिलाओं के मुख्य प्रभाव पी = 3.6 एक्स 10 -5, 12 डिग्री सेल्सियस बनाम 23 डिग्री सेल्सियस पी = 9.25 एक्स 10 -5, 17 डिग्री सेल्सियस बनाम 23 डिग्री सेल्सियस पी = 0.0005; DF = 1, एन = 11 पुरुषों और 11 महिलाओं) 20।

चित्र 1
सीपीए के प्रदर्शन के लिए चित्रा 1. शीत तल परख (सीपीए) के उपकरण दो। (ए) योजनाबद्ध। वे आराम कर रहे हैं जब तक चूहे प्लास्टिक व्यवहार बाड़ों में एक गिलास प्लेट पर आदत कर रहे हैं। एक सूखी बर्फ गोली hindpaw नीचे कांच के नीचे करने के लिए लागू किया जाता है, और विलंबता मापा जाता है ठंडा गिलास से वापस लेने के लिए। विन्यास में सीपीए उपकरण (बी) चित्र, थाली करने के लिए 5 डिग्री सेल्सियस शांत करने के लिए। थर्मल डेटा लकड़हारा बाड़ों के केंद्र में है, और एल्यूमीनियम बक्से दोनों तरफ बाड़े पार्श्व। विन्यास में सीपीए उपकरण (सी) चित्र, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली गर्म करने के लिए। पानी फैलानेवाला फिर वापस फैलानेवाला के जलाशय में पक्ष पर नाली से बाहर बहती है जो एल्यूमीनियम बॉक्स में गर्म पानी बहता है। ब्रेनर एट अल। 2014 में 2 से अनुमति के साथ reused। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा सीपीए दो। (ए) के दौरान शीशे के प्लेट की 2. तापमान सीपीए में व्यवहार प्रयोगों के दौरान गिलास प्लेट का तापमान ट्रेसिंग औसत। 30 डिग्री सेल्सियस N = 1, 23 डिग्री सेल्सियस एन = 5, 17 डिग्री सेल्सियस N = 7, 12 डिग्री सेल्सियस N = 7, 4 डिग्री सेल्सियस एन = 5 (बी) के योजनाबद्ध आरेख डीईएमसीपीए में अलग अलग तापमान की स्थिति उत्पन्न करने के लिए कैसे onstrating। ब्रेनर एट अल। 2014 में 2 से अनुमति के साथ reused। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कांच मोटाई विपरीत ढंग से एक ठंडा करने की दर के साथ जोड़ा जाता है। (ए) योजनाबद्ध प्रयोगात्मक डिजाइन (बी) आरेखण। पंजा नीचे ठंड तल का प्रोत्साहन दौरान तापमान सामान्य परिस्थितियों में सभी तीन गिलास मोटाई पर मापा गया था, और जो स्टायरोफोम spacers के दूर कांच की सतह से पंजा propping। सभी मामलों में, दूर कांच से पंजा propping पंजा पर मापा ठंड उत्तेजना (एन = 6 कांच की मोटाई के अनुसार) में एक नाटकीय कमी के कारण होता है। ( एट अल। 2012 एक से अनुमति के साथ पुन: उपयोग यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सीपीए वापसी सुप्तावस्था में 23 डिग्री सेल्सियस, 17 डिग्री सेल्सियस, या 12 डिग्री सेल्सियस से शुरू चूहों के लिए 20। (ए) औसत वापसी विलंबता संगत कर रहे हैं। (बी) के विन्यास सीपीए ठंड उत्तेजना को मापने के लिए। एक anesthetized माउस का पंजा शीर्ष पर प्रयोगशाला टेप के साथ कांच की प्लेट पर सुरक्षित हैएक टी प्रकार रेशा thermocouple के। सीपीए प्रोत्साहन पंजा और thermocouple दोनों नीचे कांच के नीचे पर रखा गया है। (सी) तापमान 30 डिग्री सेल्सियस, 23 डिग्री सेल्सियस, 17 डिग्री सेल्सियस, या 12 डिग्री सेल्सियस से शुरू सीपीए में उत्पन्न। काला तीर हर हालत में जाग चूहों के लिए औसत वापसी सुप्तावस्था प्रतिनिधित्व करते हैं। ब्रेनर एट अल से अनुमति के साथ पुन: उपयोग। 2014 दो। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. ग्लास प्लेट तापमान प्लेट के केंद्र में रखा गया था सीपीए दो। (ए) thermocouple T1 (काला) में संगत कर रहे हैं। Thermocouple टी 2 (लाल) थाली के ठीक किनारे करने के लिए करीब व्यवहार बाड़े में रखा गया था। तापमान टीआरएcings और अभी तक सही (T1-T2) में ग्राफ प्रयोग के दौरान पूरे T1 और टी 2 में लगभग समान तापमान दिखा। (बी) thermocouple T1 (काला) थाली के केंद्र में रखा गया था। Thermocouple टी 2 (लाल) सूखी बर्फ से भरे एल्यूमीनियम बॉक्स के करीब दीवार पर, केंद्रीय व्यवहार बाड़े में रखा गया था। तापमान ट्रेसिंग और अभी तक सही (T1-T2) में ग्राफ थाली में एक स्थिर तापमान तक पहुँच गया है एक बार T1 और टी 2 के बीच एक मोटे तौर पर तीन डिग्री सेल्सियस का अंतर है कि वहाँ दिखा। ब्रेनर एट अल से अनुमति के साथ पुन: उपयोग। 2014 दो। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 सीपीए एनलजेसिया और अतिसंवेदनशीलता एक उपाय कर सकते हैं। (ए) एस1.5 मिलीग्राम की ubcutaneous इंजेक्शन / किलोग्राम अफ़ीम 30 मिनट के इंजेक्शन के बाद चूहों की वापसी विलंबता बढ़ जाती है (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा, 30 मिनट पद इंजेक्शन ** पी <0.01)। 60 मिनट इंजेक्शन के बाद, अफ़ीम इंजेक्शन और खारा इंजेक्शन चूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर है। (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा, * पी ​​<0.05, ** पी <0.01) (बी) 10 उल की Intraplantar इंजेक्शन पूरा Freund के सहयोगी (सीएफए) चूहों 2 और 3 घंटा पद इंजेक्शन की वापसी विलंबता कम हो जाती है। सभी चूहों 4 घंटे में अफ़ीम के चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिए गए थे, और 4.5 घंटा सब पर वापसी सुप्तावस्था 3 घंटा के साथ तुलना में काफी अधिक थे (Dunnet की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा; $$$ पी <0.001)। (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा; ** पी <0.01) सीएफए के इंजेक्शन (अफ़ीम इंजेक्शन के बाद 1.5 एचआर) के बाद 5.5 घंटा, सीएफए इंजेक्शन चूहों अभी भी खारा इंजेक्शन चूहों की तुलना में कम वापसी सुप्तावस्था था। से अनुमति के साथ पुन: उपयोगब्रेनर एट अल। 2012 1। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
कांच की थाली गतिशील रूप से 20 ठंडा रूप में ठंड अनुकूलन मापने चित्रा 7.। ग्लास प्लेट के रूप में सीपीए के प्रदर्शन के लिए (ए) योजनाबद्ध ठंडा है। बेसलाइन तापमान सूखी बर्फ के कंटेनर थाली करने के लिए जोड़ रहे हैं, आरटी पर मापा जाता है, और कांच की प्लेट ठंडा के रूप में वापसी विलंबता मापा जाता है। कांच की प्लेट ठंडा रूप में (बी) जंगली प्रकार चूहों वे सीपीए (बेसलाइन से मापा जा सकता है की तुलना में तेजी ठंडा तापमान के लिए अनुकूल है, सुझाव है कि एक ही वापसी विलंबता = 12.8 ± 0.3 सेकंड, 30 मिनट = 13.67 ± 0.9 सेकंड, 60 न्यूनतम = 11.03 ± 1.0 सेकंड, 90 मिनट = 11.31 ± 0.6 सेकंड, एन = 3 चूहों; Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण, किसी भी समूह के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद) के साथ एक तरह से एनोवा। कांच की थाली के रूप में सीपीए के प्रदर्शन के लिए योजनाबद्ध (सी) पीएलसी अवरोध करनेवाला U73122 या नियंत्रण यौगिक U73343 के intraplantar इंजेक्शन के बाद, ठंडा है। थाली U73122 इंजेक्शन के बाद ठंडा है, जबकि (डी) चूहे U73122 परिवेश तापमान को ठंडा करने के लिए अनुकूल करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप, सुझाव है कि काफी कम वापसी सुप्तावस्था है। ब्रेनर एट अल। 2014 में 20 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग। यह आंकड़ा दर्द के अध्ययन के लिए इंटरनेशनल एसोसिएशन (IASP) की अनुमति के साथ reproduced किया गया है। आंकड़ा अनुमति के बिना किसी अन्य उद्देश्य के लिए reproduced नहीं हो सकता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"चित्रा 8 चित्रा TRPM8-को चूहों पर्यावरणीय 20 को ठंडा करने के लिए अनुकूल नहीं है TRPM8-को चूहों Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ (2 तरह से एनोवा मापा सब शुरू करने के लिए तापमान पर जंगली प्रकार littermates से अधिक वापसी सुप्तावस्था है;। *** पी < 0.001)। TRPM8-को चूहों की वापसी विलंबता भी शुरू तापमान घटने के रूप में कम हो जाती है (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा; ## पी <0.01, ### पी <0.001), वापसी में कोई उल्लेखनीय बदलाव नहीं आया है, जबकि शुरुआती तापमान घटने के रूप में जंगली प्रकार littermates की विलंबता। ब्रेनर एट अल। 2014 में 20 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग। यह आंकड़ा दर्द के अध्ययन के लिए इंटरनेशनल एसोसिएशन (IASP) की अनुमति के साथ reproduced किया गया है। आंकड़ा अनुमति के बिना किसी अन्य उद्देश्य के लिए reproduced नहीं हो सकता। CLIC करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां कश्मीर।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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