Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

Medir a capacidade de resposta fria em roedores é importante para melhorar a compreensão dos potenciais mecanismos de sensibilidade frio em seres humanos, tanto em condições normais e patológicas. The Cold Plantar Assay (CPA), originalmente desenvolvido há vários anos um, é projetado para gerar, respostas inequívocas murino comportamentais reprodutíveis a um estímulo frio entregue na RT. Mais recentes melhorias deste ensaio permitiu a medida reprodutível de sensibilidade frio a uma vasta gama de temperaturas de 2. Ambas as versões também são projetados para ser relativamente alto rendimento, e barato de usar.

Uma grande quantidade de progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos de sensibilidade frio usando outros métodos comportamentais. Um método é o teste de evaporação de acetona, enxugando ou que envolve a pulverização acetona na pata do rato e medindo a quantidade de tempo que o rato gasta sacudindo a 3,4 pata. Infelizmente,as respostas a acetona evaporação são confundidos pela sensação molhada e o cheiro da acetona. Além disso, o estímulo frio que é aplicado no teste de acetona evaporação pode variar de acordo com a quantidade de acetona aplicada, e é difícil de quantificar. Finalmente, os ratinhos lesionados têm respostas mínimas para acetona a linha de base, o que torna impossível de medir a analgesia na ausência de hipersensibilidade com este método.

Outro ensaio clássico para respostas frias é o ensaio da ponta da cauda, ​​onde a latência para retirada é medida após a cauda está imerso em 5,6 água fria. Enquanto as respostas comportamentais neste ensaio são inequívocos e o ensaio mede as respostas a uma temperatura específica, os animais devem ser imobilizados durante os testes, o que pode alterar a capacidade de resposta fria através bem descritos mecanismos analgésicos estresse induzido por 7.

Outra ferramenta utilizada é o teste de placa fria, que mede o comportamentorespostas dos ratos depois de serem colocados sobre uma placa arrefecida com Peltier 8-10. Enquanto esta ferramenta fornece informações sobre as respostas de animais em temperaturas específicas, ele também tem sido usado de forma inconsistente; diferentes grupos foram medidos diferentes tipos de resposta incluindo o número de saltos 8,11, a latência a primeira resposta 8,11- 13, e o número de pata elevadores 11,13,14 com resultados muito diferentes. O teste de placa de frio é também relativamente baixa taxa de transferência uma vez que apenas um animal pode ser testada ao mesmo tempo, e necessitam de um dispositivo de Peltier caros e frágeis.

O teste de preferência temperatura 2 placa é um derivado normalmente usado para o teste de placa fria, que mede a quantidade relativa de tempo em que os animais passam em 2 placas conectadas de diferentes temperaturas 9,15- 17. Outro ensaio utilizado é semelhante ao ensaio de gradiente térmico, em que a quantidade de tempo que os ratos passam em diferentes zonas de temperaturavariando entre 5 ° C e 45 ° C em uma placa de metal é medida a longo 16. Enquanto estes ensaios permitir a comparação das temperaturas, não está claro se o comportamento representa aversão temperatura ou a preferência de temperatura.

Finalmente, o ensaio de placa fria dinâmica tem sido usado para medir como ratos responder às mudanças nas temperaturas ambiente 18. Este método envolve a colocação de ratos em um dispositivo Peltier RT e aumentando-a para 1 ° C enquanto mede o quanto os ratos saltar ou lamber as patas em diferentes temperaturas de placas. Enquanto isto testa como ratos se adaptar a um ambiente de arrefecimento, ele não fornece uma maneira de testar como os ratos responder a um estímulo frio na definição de uma temperatura ambiente mais fresco. Além disso, requer equipamentos caros para realizar e não fornece uma maneira de se aclimatar ratos para o equipamento de teste antes de medir a sua sensibilidade frio.

Para complementar estes ensaios, o CPA testa a ACCLIMAted respostas a um estímulo frio bem definida em uma variedade de faixas de temperatura, ou durante o processo de adaptação a temperaturas ambientes frios. Pode testar-se a 14 ratinhos de cada vez com o nosso aparelho actual, com o potencial de ser barata aumentada a escala para ensaios de elevado rendimento.

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Protocol

Todos os protocolos de mouse estavam de acordo com os institutos nacionais de saúde e orientações foram aprovadas pelo Comitê de animal Estudos da Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO).

1. Preparando a Placa e Recintos Testing

  1. Limpar a superfície do vidro.
  2. Segurar a sonda termopar filamento do tipo T à superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório.
  3. Colocar o animal independente sobre a placa de vidro em uma única linha ao longo do meio da placa.
  4. Passe a sonda termopar através do cerco animal centro e ligar para o registrador de dados. Vire o registrador de dados enquanto a desativação do recurso de auto-desligamento, e anexar o registrador de dados para o computador com o cabo fornecido.
    1. Se a gravação da temperatura da placa durante o experimento, abra o software registrador de dados para começar a gravar temperaturas placa.
    2. Se necessário, ajustar o software de recabo a temperatura da placa de uma vez a cada segundo.
    3. Começar a gravar temperaturas usando o software fornecido com o registrador de dados térmico.
  5. Separe o recinto com pastilhas pretas para evitar a interação visual entre camundongos.
  6. Posição espelhos por baixo do vidro de modo que a parte de baixo das caixas é visível a partir de uma posição sentada confortável.

2. O aquecimento / resfriamento da placa de vidro

  1. Preencha caixas de alumínio com água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco e posicioná-los de forma adequada sobre a placa de vidro (pacotes de folhas de alumínio preenchidos com gelo seco também pode ser usado para resfriar o vidro; Figura 1) 2.
    1. Para os testes, a 30 ° C, posicione as caixas de alumínio de aproximadamente 0,25 '' longe dos recintos de animais (Figura 2B) 2.
      1. Definir um circulador de água aquecida em ambos os lados da placa de vidro. Definir o circulador para 45 - 60 ° C, e nósenviar um e-lo para preencher as caixas de alumínio com um fluxo constante de água quente (Figura 1C) 2.
      2. Posicionar os circuladores de tal modo que a água quente a partir das caixas de alumínio escoa directamente de volta para dentro do reservatório da bomba de circulação em cada um dos lados (Figura 1C) 2.
    2. Para os testes à temperatura ambiente, deixar as caixas vazias (Figura 2) 2.
    3. Para os testes a 17 ° C, posicione as caixas de aproximadamente 0,25 '' longe dos recintos de animais de cada lado e encher com gelo molhado (Figura 2) 2.
    4. Para os testes a 12 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 1,25 '' distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2.
    5. Para os testes, a 5 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 0,25 '' distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2.
      1. Quando arrefecer o copo com gelo seco, verifique se não há ventilação suficiente para evitar o acúmulo de CO 2 no quarto.
  2. Espera para o vidro para atingir a gama de temperatura desejada.
  3. Adicionar os ratos para os compartimentos da placa.
    NOTA: Um gerador de ruído branco podem ser utilizados para diminuir as perturbações de ruído.
  4. Aguarde até que os ratos para se aclimatar.
    NOTA: Em nosso serviço isso leva aproximadamente 2,5 horas, mas isso pode variar significativamente com base nas condições de manipulação e de alojamento dos animais.
  5. Manter o vidro no intervalo de temperatura desejado, garantindo que as caixas são mantidas cheias de água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco.
    NOTA: Com o nosso aparelho as caixas precisam ser recarregados com gelo aproximadamente a cada 90 min.
    NOTA: Para a 17 ° C condição, é útil para esvaziar a maior parte da água das caixas de alumínio através dos furos de drenagem antes de enchê-lo com gelo. Isto irá estabilizar a temperatura melhor, e prevento estouro
    NOTA: A quantidade exacta do gelo seco irá variar sazonal, mas, em geral, mantendo as caixas de mais do que ¼ cheio ao longo de todo o comprimento da caixa, será manter a temperatura constante.

3. Teste o Mice em temperaturas fixas

  1. Do lado de fora da sala de comportamento, encher um balde de gelo sobre meio cheio de gelo seco.
  2. Usando um martelo ou malho, esmagar o gelo seco em um pó fino.
    NOTA: O excesso de balde irá tornar mais difícil para esmagar completamente o gelo seco em pó.
  3. Usando uma lâmina de navalha ou tesoura, corte a parte de cima de uma seringa de 3 ml.
  4. Usando uma agulha de 21 G, picar 3 furos em lados opostos da seringa (total de 6 furos).
    NOTA: Estes furos vai diminuir a pressão gerada por sublimação, enquanto comprime o gelo seco. A seringa de corte pode ser reutilizada para vários experimentos.
  5. Pegue na seringa, o pó de gelo seco, e um cronômetro de mão na sala de comportamento.
  6. Encha a câmara de seringa meio cheio de pó de gelo seco. Segurar a extremidade cortada da seringa de encontro a um objecto chato, e firmemente comprimir o pó usando o êmbolo. Seja cuidadoso; o êmbolo plástico pode entortar ou quebrar com a pressão. Se isso acontecer, substitua o êmbolo de uma seringa nova.
  7. Estender a ponta do comprimido sedimento gelo seco além da extremidade da seringa.
  8. Ratos de teste que são completamente em repouso.
    1. A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, os ratinhos de teste, que têm todas as 4 patas sobre o vidro e não se deslocam, mas não totalmente 19 adormecido.
    2. A 12 ° C e 5 ° C, os ratos de teste que são em 2 patas ou 4 patas e não em movimento ou de salto.
  9. Usando os espelhos para segmentação, gentil mas firmemente alisar o resplendor pellet contra a superfície de vidro debaixo da pata traseira do mouse (Figura 1A) 2. Comece a mão-timer.
  10. Parar o temporizador e remover o sedimento quando o rato afasta-se do vidro arrefecida.
    NOTA: O movimento de retrocesso pode ser vertical ou horizontal.
    1. Se o mouse se move muito rapidamente a pata e, em seguida, retorna para a superfície de refrigeração, continuar a cronometragem e estimulando até que o rato faz um movimento permanente de distância.
      NOTA: O nosso laboratório usa um tempo máximo de 20 segundos de estímulo para os ratos, na maioria dos casos.
  11. Repita este procedimento até que o teste pelo menos três valores em cada pata de cada animal são coletados. Experimentações separadas testando as patas opostos no mesmo rato por, pelo menos, 7 min, e ensaios consecutivos separados em qualquer única pata por, pelo menos, 15 min.
  12. Se for necessário, utilizam diferentes espessuras de vidro para gerar diferentes taxas de arrefecimento (Figura 3) 1.
    NOTA: A taxa de arrefecimento está inversamente correlacionada com a espessura do vidro.

4. Testando o Ratos Durante Fria Adaptação

NOTA: Este é um protocolo alternativo que permite testar como o plat de vidroe esfria, ao invés de uma vez que a placa se estabilizou e os ratos estão totalmente adaptados ao ambiente frio.

  1. Siga as instruções listadas na Seção 1 para configurar o aparelho.
  2. Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas de base na RT (Figura 7A) 2.
  3. Pré-resfriar as caixas de alumínio com gelo seco.
  4. Uma vez que as latências de retirada da linha de base foram medidos, posicione as caixas pr�arrefecida na placa aproximadamente 1,25 '' longe dos gabinetes de ambos os lados (Figura 7A, seta rotulado como "gelo seco adicionado") 2.
  5. Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas como a placa de vidro esfria, tomando medidas o mais rápido possível.

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Representative Results

As respostas comportamentais induzidos de ratinhos a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C são altamente reprodutível (Figura 4A) 20. A fim de medir o estímulo frio sendo gerado sob a pata traseira, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina / acepromazina e cocktail suas patas foram assegurados no vidro na parte superior de um termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. O vidro foi arrefecida ou aquecida para a faixa de teste desejada. Embora a placa é arrefecida de maneira uniforme ao longo do comprimento da placa (Figura 5A) 2, deve notar-se que um gradiente de frio é gerada entre os compartimentos de comportamento (Figura 5B) 2. As partes do invólucro que estão mais próximos do gelo seco em ambos os lados dos compartimentos são mais frias, enquanto que as partes centrais são ligeiramente mais quente (Figura 5B) 2. Em temperaturas mais baixas used, os ratos passam a maior parte do seu tempo nas partes centrais do gabinete. Uma vez que a temperatura da placa de vidro tinha estabilizado, um estímulo gelo seco focal foi colocado sobre o vidro por baixo da pata / thermode. Com base nos vestígios de temperatura registadas a partir desta configuração, é evidente que os estímulos frios gerados usando o CPA são altamente reprodutíveis em cada intervalo de temperatura (Figura 4C) 20.

O estímulo frio gerado na PCR também foi medida com três espessuras diferentes de vidro para variar a intensidade do arrefecimento (Figura 3). A taxa de arrefecimento está inversamente relacionada com a espessura do vidro, e qualquer destas espessuras podem ser utilizadas para medir a sensibilidade ao frio, conforme necessário (Figura 3).

Trabalhos anteriores mostraram que o APG pode detectar a analgesia e hipersensibilidade em ratinhos. 30 min após a injecção subcutânea de 1,5 mg / kg de morfina, os ratos têm significativamente longer latência de retirada de ratinhos que receberam injecções subcutâneas de solução salina (Figura 6A: 2-way ANOVA principal efeito * p <0,05 com Bonferroni post-hoc; 30 min ** p <0,01; n = 12 por grupo) 1. Por 60 min após a morfina / soro fisiológico, não há diferença entre a saline- e grupos de injecção de morfina, o que é consistente com a taxa de metabolismo da morfina em ratos.

Adjuvante Completo de Freund (CFA) foi previamente demonstrado que causam inflamação e hipersensibilidade após injecção 21 da pata traseira. Após injecções CFA, as latências de retirada da CPA diminuir 2 e 3 h pós-injecção (Figura 6B: 2-way ANOVA principal efeito p <0,001 com Bonferroni post-hoc de teste; 2 hr * p <0,05, 3 h ** p <0,01 n = 12 por grupo). 4 horas após a injecção de CFA, os ratinhos receberam injecções subcutâneas de 1,5 mg / kg de morfina. 30 min após a injecção de morfina, tanto CFA- e ratinhos injectados com soro fisiológico tinha aumentado withdrawal latências em relação às suas latências em 3 horas (Figura 6B: 1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnett; CFA 3 hr vs. CFA 4,5 hr $$$ p <0,001, salina 3 hr vs. salina 4,5 hr $$$ p <0,001). Uma hora mais tarde, uma vez que a morfina tinha sido metabolizada, os ratinhos injectados com CFA mais uma vez teve latências de retirada mais baixos do que os ratinhos de controlo injectados com soro fisiológico (Figura 6B: 2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p <0,01) 1.

A maioria das espécies de mamíferos têm a capacidade de se adaptar a sua sensibilidade à temperatura para coincidir com o seu ambiente. In vitro, estudos têm sugerido que este processo de adaptação depende PIP 2 hidrólise 22- 24, mas as ferramentas comportamentais anteriores não foram capazes de validar essa hipótese in vivo. A A CPA é capaz de quantificar esta adaptação de duas maneiras diferentes. Ao testar a latência de retirada de ratinhos como o vidro arrefece ( 2. Em condições normais, a latência de retirada é alterado conforme o prato esfria, o que sugere que a adaptação ao frio acontece mais rápido do que pode ser quantificado com o CPA (Figura 7b: ​​0 min = 12,13 ± 0,8 seg, 30 min = 12,1 ± 1,6 seg, 60 min = 13,2 ± 1,1 seg, 90 min = 10,8 ± 1,2 s 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni p> 0,05, n = 6) 2. No entanto, quando os ratinhos são dadas injecções intraplantar da fosfolipase-C U73122 25 inibidor antes da placa é arrefecida (Figura 7C) suas latências de retirada são diminuídos, sugerindo que a adaptação é prejudicada (Figura 7D: linha de base = 11,29 ± 0,53 sec, 30 min = 8,09 ± 1,17 s; 1-way ANOVA com teste de Dunnett post-hoc, o efeito principal p = 0,02, individuais de linha de base vs. 30 min p = 0,02, n = 9).

A CPA também pode medir a abilid a adaptar-se a temperaturas ambientes frios durante longos períodos de tempo. Quando ratinhos do tipo selvagem são testados usando o CPA depois de ter sido aclimatados durante 3 horas a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C, a latência de retirada é a mesma temperatura em toda a partir, sugerindo que o de tipo selvagem ratos adaptados à temperatura ambiente mais frio (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 seg, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 segundos, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 seg, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 s, 1- ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, p <0,05 n = 6 para 30 ° C, n = 15 para 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C) 20. Ao contrário dos camundongos selvagens, como a temperatura de partida diminui as latências de retirada de camundongos TRPM8-KO diminuir, sugerindo que eles são incapazes de adaptar o seu limiar de resposta para se adequar ao seu ambiente (Figura 8: 1-way ANOVA de medidas repetidas com Bonferroni pós- teste hoc; machos principal efeito p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C, p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,004; fêmeas principal efeito p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 machos e 11 fêmeas) 20.

Figura 1
Figura 1. The Cold Plantar Assay (CPA) aparelho 2. (A) Esquema para a realização do CPA. Ratos são aclimatados em uma placa de vidro em caixas plásticas de comportamento até que eles estão em repouso. Um sedimento de gelo seco é aplicado ao lado de baixo do vidro debaixo da pata traseira, e a latência para retirar o vidro de arrefecimento é medido. (B) Imagem do aparelho CPA, em configuração para arrefecer a chapa até 5 ° C. O registrador de dados térmica está no centro das caixas, E as caixas de alumínio flanquear o invólucro em ambos os lados. (C) de imagem do aparelho de CPA, em configuração de aquecer a placa a 30 ° C. O circulador de água flui a água quente para a caixa de alumínio, que, em seguida, flui para fora da fuga no lado de trás para dentro do reservatório da bomba de circulação. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A temperatura da placa de vidro durante o CPA 2. (A) Média de traçados de temperatura da placa de vidro no decurso de experiências comportamentais no CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C, n = 7, 12 ° C, n = 7, 4 ° C n = 5. (B) os diagramas esquemáticos demmonstrando como gerar as diferentes condições de temperatura na CPA. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A espessura do vidro é inversamente correlacionada com a taxa de arrefecimento 1. (A) Esquema de diagramação do projeto experimental (BD). A temperatura durante o estímulo frio debaixo da planta do pé da pata foi medido em todos os três espessuras de vidro sob condições normais, e que os espaçadores de isopor sustentando a pata de distância da superfície do vidro. Em todos os casos, sustentando a pata longe do vidro causou uma diminuição dramática no estímulo frio medida na pata (n = 6 por espessura de vidro). ( et al. 2012 1 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. latências de retirada são consistentes CPA 20. (A) a latência de retirada de ratinhos médio a partir de 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. (B) Configuração para medir CPA estímulo frio. A pata de um rato anestesiado é preso na placa de vidro com fita de laboratório em cimade um filamento de termopar de tipo T. O estímulo de CPA é colocado no lado inferior do vidro debaixo tanto pata e termopar. (C) As temperaturas geradas no CPA a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. As setas pretas representam as latências médias de retirada para os ratos acordados em cada condição. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. temperaturas da chapa de vidro são consistentes na CPA 2. (A) Termopar t1 (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento comportamental mais próximo da extremidade direita da placa. Os tra temperaturacings e o gráfico na extremidade direita (t1-t2) mostram temperaturas quase idênticas, t1 e t2 durante todo o decurso da experiência. (B) t1 termopar (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento de comportamento central, na parede mais próxima das caixas de alumínio cheio de gelo seco. Os traçados no gráfico de temperatura e na extremidade direita (t1-t2) mostram que existe uma diferença de cerca de 3 ° C entre t1 e t2, uma vez que a chapa tenha atingido uma temperatura estável. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. A CPA pode medir analgesia e hipersensibilidade 1. (A) Subcutaneous injecção de 1,5 mg / kg de morfina aumenta a latência de retirada de ratinhos 30 minutos após a injecção (2-way ANOVA com Bonferroni post-hoc, 30 min após injecção ** p <0,01). 60 min após a injecção, não há nenhuma diferença significativa entre os ratos injectados com soro fisiológico e injectados morfina. (B) injecção intraplantar de 10 ul Adjuvante Completo de Freund (CFA) diminui a latência de retirada de ratinhos 2 e 3 h pós-injecção (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; * p <0,05, ** p <0,01). Todos os ratos receberam injeções subcutâneas de morfina em 4 horas, e todas as latências de retirada em 4,5 horas foram significativamente maiores em comparação com 3 horas (1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnet; $$$ p <0,001). 5,5 horas após a injecção de CFA (1,5 h após a injecção de morfina), os ratinhos injectados com CFA ainda tinham latências de retirada mais baixas do que os ratos injectados com soro fisiológico (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p <0,01). Reutilizado com permissão deBrenner et al. 2012 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Medição de adaptação ao frio, como a placa de vidro esfria dinamicamente 20. (A) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando. As temperaturas de linha de base são medidos à temperatura ambiente, os recipientes de gelo seco são adicionados à placa, e a latência de retirada é medida como a placa de vidro arrefece. (B) ratinhos de tipo selvagem tem o mesmo como latência de retirada da placa de vidro arrefece, o que sugere que eles se adaptam a temperaturas de arrefecimento mais rápido do que pode ser medido com o CPA (linha de base = 12,8 ± 0,3 seg, 30 min = 13,67 ± 0,9 seg, 60 min = 11,03 ± 1,0 seg, 90 min = 11,31 ± 0,6 seg, n = 3 murganhos; 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, não há diferenças significativas entre todos os grupos). (C) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando, após intraplantar injeções da U73122 inibidor PLC ou o U73343 composto de controlo. (D) Os ratos têm latências de retirada significativamente mais baixas, enquanto a placa é de arrefecimento após injecção U73122, U73122 sugerindo que interfere com a capacidade de se adaptar a arrefecer temperatura ambiente. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figure Camundongos Figura 8. TRPM8-KO não se adaptam ao resfriamento ambiental 20 ratos TRPM8-KO têm latências de retirada mais altas do que do tipo selvagem ninhada em todas as temperaturas a partir medidos (2-way ANOVA com teste de Bonferroni post-hoc;. *** P < 0,001). A latência de retirada de camundongos TRPM8-KO também diminui à medida que a temperatura diminui de partida (1-way ANOVA com Bonferroni post-hoc teste; ## p <0,01, ### p <0,001), enquanto não há nenhuma mudança significativa na retirada latência da mesma ninhada de tipo selvagem como as diminuições de temperatura de partida. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. Por favor, cliquemk aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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