Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

Misurare reattività freddo nei roditori è importante per migliorare la comprensione dei potenziali meccanismi di sensibilità freddo negli esseri umani sia in condizioni normali e patologiche. The Cold plantare Assay (CPA), originariamente sviluppato diversi anni fa 1, è stato progettato per generare risposte riproducibili, inequivocabili murine comportamentali a uno stimolo freddo consegnato a RT. Miglioramenti più recenti di questo test hanno permesso la misurazione riproducibile di sensibilità fredda in un ampio intervallo di temperature 2. Entrambe le versioni sono inoltre progettati per essere relativamente alto rendimento, e poco costoso da utilizzare.

Una grande quantità di progressi sono stati compiuti nella comprensione dei meccanismi di sensibilità a freddo utilizzando altri metodi comportamentali. Un metodo è il test di evaporazione acetone, che comporta tamponando o spruzzando acetone sulla zampa mouse e misurando la quantità di tempo che il mouse spende portando l'3,4 zampa. Purtroppo,le risposte alla acetone evaporazione sono confusi dalla sensazione umida e l'odore del acetone. Inoltre, lo stimolo fredda che viene applicato durante la prova di evaporazione acetone può variare in base alla quantità di acetone applicata, ed è difficile da quantificare. Infine, i topi hanno risposte indenni minime quantità di acetone al basale, rendendo impossibile misurare l'analgesia in assenza di ipersensibilità con questo metodo.

Un altro test classico per le risposte a freddo è il test coda flick, dove la latenza di recesso viene misurata dopo la coda è immerso in 5,6 acqua fredda. Mentre le risposte comportamentali in questo saggio sono inequivocabili e il test misurano risposte ad una temperatura specifica, gli animali devono essere trattenuti durante la prova, che possono alterare la risposta fredda attraverso ben definite meccanismi analgesici da stress 7.

Un altro strumento comunemente usato è il test della piastra fredda, che misura il comportamentorisposte di topi dopo che sono posti su una piastra di Peltier raffreddato 8-10. Mentre questo strumento fornisce informazioni sulle risposte animale a temperature specifiche, è stato anche utilizzato incoerente; diversi gruppi hanno misurato diversi tipi di risposte incluso il numero di salti 8,11, la latenza alla prima risposta 8,11- 13, e il numero di ascensori paw 11,13,14 con risultati molto diversi. Il saggio piastra fredda è relativamente bassa capacità, come solo un animale può essere testato per volta, e richiede un dispositivo Peltier costosi e fragili.

Il test preferenza temperatura 2-piastra è un derivato comunemente usato per il test della piastra fredda che misura la quantità relativa di tempo che gli animali passano su 2 piastre collegate delle diverse temperature 9,15- 17. Un altro simile test comunemente usato è il saggio gradiente termico, in cui la quantità di tempo che i topi passano in differenti zone di temperaturacompresa tra 5 ° C e 45 ° C su una piastra metallica lunga 16 viene misurata. Mentre questi test permettono il confronto delle temperature, non è chiaro se il comportamento rappresenti avversione temperatura o di preferenza temperatura.

Infine, la dinamica dosaggio piastra fredda è stato usato per misurare quanto topi rispondono alle mutevoli temperatura ambiente 18. Questo metodo prevede il posizionamento mouse su un dispositivo Peltier RT e rampa verso il basso per 1 ° C durante la misurazione di quanto i topi saltano o leccarsi le zampe a temperature diverse placche. Mentre questo test come topi adattarsi ad un ambiente di raffreddamento, non fornisce un modo per testare come topi rispondono ad uno stimolo freddo nella cornice di una temperatura ambiente più fresco. Inoltre, richiede attrezzature costose effettuare e non fornisce un modo per acclimatare topi all'apparecchiatura prova prima di misurare la loro sensibilità fredda.

Per completare questi test, il CPA testa il ACCLIMAted risposte ad uno stimolo fredda ben definito in una varietà di campi di temperatura, o durante il processo di adattamento a temperature ambiente freddo. Si può testare fino a 14 topi alla volta con il nostro apparato attuale, con la possibilità di essere a buon mercato in scala per i test high-throughput.

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Protocol

Tutti i protocolli topo erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dal comitato Animal Studies di Washington University School of Medicine (St. Louis, MO).

1. Preparare la piastra di prova e Contenitori

  1. Pulire la superficie del vetro.
  2. Fissare la T-tipo di sonda termocoppia filamento alla superficie al centro della lastra di vetro con il nastro di laboratorio.
  3. Posizionare dello stabulario sulla lastra di vetro in una singola linea lungo il centro del piatto.
  4. Infilare la sonda della termocoppia attraverso il recinto degli animali centro e collegarlo alla data logger. Girare il data logger sulla mentre disattivare la funzione di spegnimento automatico, e collegare il logger al computer con il cavo fornito.
    1. Se si registra la temperatura della piastra durante l'esperimento, aprire il software datalogger per iniziare a registrare le temperature della piastra.
    2. Se necessario, modificare il software di ricavo la temperatura della piastra ogni secondo.
    3. Iniziare il rilevamento della temperatura utilizzando il software fornito con il data logger termico.
  5. Separare il recinto con inserti neri per impedire l'interazione visiva tra i topi.
  6. Posizione rispecchia sotto il vetro in modo tale che la parte inferiore delle recinzioni è visibile da una posizione seduta comoda.

2. riscaldamento / raffreddamento della lastra di vetro

  1. Riempire scatole di alluminio con acqua riscaldata, ghiaccio umido, o ghiaccio secco e posizionare in modo appropriato sulla lastra di vetro (pacchetti di stagnola alluminio riempiti con ghiaccio secco può essere utilizzato anche per raffreddare il vetro; Figura 1) 2.
    1. Per la prova a 30 ° C, posizionare le scatole di alluminio circa 0,25 '' lontano dai recinti degli animali (Figura 2b) 2.
      1. Impostare un circolatore acqua riscaldata su entrambi i lati della piastra di vetro. Impostare il circolatore a 45 - 60 ° C, e civia e per riempire le scatole di alluminio, con un flusso costante di acqua calda (Figura 1C) 2.
      2. Posizionare i circolatori tale che l'acqua calda dalle scatole di alluminio drena direttamente nel serbatoio del circolatore su ciascun lato (Figura 1C) 2.
    2. Per il test a temperatura ambiente, lasciare le caselle vuote (Figura 2) 2.
    3. Per la prova a 17 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 '' lontano dai recinti di animali su entrambi i lati e riempire con ghiaccio umido (Figura 2) 2.
    4. Per la prova a 12 ° C, posizionare le caselle circa 1,25 '' di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2.
    5. Per le prove a 5 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 '' distanti custodie su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2.
      1. Quando il raffreddamento del bicchiere con ghiaccio secco, assicurarsi che vi sia sufficiente ventilazione per evitare l'accumulo di CO 2 nella stanza.
  2. Attendere che il vetro per raggiungere il campo di temperatura desiderata.
  3. Aggiungere i topi ai contenitori sulla piastra.
    NOTA: Un generatore di rumore bianco può essere utilizzato per ridurre i disturbi acustici.
  4. Attendere che i topi si adatti.
    NOTA: Nella nostra struttura questo richiede circa 2,5 ore, ma puo 'variare notevolmente in base stabulazione degli animali e le condizioni di manipolazione.
  5. Mantenere vetro nel range di temperatura desiderato garantendo che le scatole siano pieni di acqua riscaldata, ghiaccio umido o ghiaccio secco.
    NOTA: Con il nostro apparato le caselle devono essere riempite con ghiaccio circa ogni 90 min.
    NOTA: Per la condizione di 17 ° C, è utile svuotare la maggior parte dell'acqua dalle scatole di alluminio attraverso i fori di scarico prima di riempire con ghiaccio. Ciò stabilizzare la temperatura migliore e prtroppopieno evento
    NOTA: La quantità esatta del ghiaccio secco varia stagionalmente, ma in generale mantenendo caselle più di ¼ completi lungo tutta la lunghezza della scatola manterrà costante la temperatura.

3. Test del Mice a temperature fisse

  1. Al di fuori della sala del comportamento, riempire un secchio di ghiaccio pieno per metà di ghiaccio secco.
  2. Con un martello o mazzuolo, schiacciare il ghiaccio secco in una polvere finissima.
    NOTA: eccessivo del secchio renderà difficile schiacciare completamente il ghiaccio secco in polvere.
  3. Utilizzando una lama di rasoio o forbici, tagliare la parte superiore di una siringa da 3 ml.
  4. Utilizzando un ago 21 G, colpire 3 fori ai lati opposti della siringa (totale di 6 buche).
    NOTA: Questi fori diminuirà la pressione generata dalla sublimazione comprimendo il ghiaccio secco. La siringa cut-off può essere riutilizzato per diversi esperimenti.
  5. Prendere la siringa, polvere ghiaccio secco, e un cronometro portatile nella stanza comportamentale.
  6. Riempire la camera di siringa di mezzo pieno di polvere di ghiaccio secco. Tenere l'estremità tagliata del siringa contro un oggetto piatto, e saldamente comprimere la polvere utilizzando lo stantuffo. Stai attento; lo stantuffo di plastica può piegarsi o rompersi dalla pressione. Se questo accade, sostituire lo stantuffo di una nuova siringa.
  7. Estendere la punta del pellet ghiaccio secco compressa oltre il bordo della siringa.
  8. Topi di prova che sono completamente a riposo.
    1. A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, i topi che hanno tutte 4 zampe sul vetro e non si muove, ma non completamente addormentato 19.
    2. Al 12 ° C e 5 ° C, i topi di prova che sono su 2 zampe o 4 zampe e non in movimento o saltare.
  9. Utilizzando gli specchi per il targeting, delicatamente ma con fermezza premere il filo pellet piatto contro la superficie di vetro sotto il mouse hindpaw (Figura 1A) 2. Avviare la mano-timer.
  10. Arrestare il timer e rimuovere il pellet quando il mouse si allontana dal vetro raffreddato.
    NOTA: Lo spostamento di retrocessione può essere verticale o orizzontale.
    1. Se il mouse si muove molto brevemente la zampa e poi ritorna alla superficie di raffreddamento, continuano i tempi e stimolando il mouse fino a quando fa una mossa permanente di distanza.
      NOTA: Il nostro laboratorio utilizza un tempo massimo di 20 sec stimolo per topi nella maggior parte dei casi.
  11. Ripetere questa procedura di test fino a quando vengono raccolti almeno 3 valori per ogni zampa di ciascun animale. Prove separate test zampe opposte sulla stessa mouse almeno 7 min, e prove consecutive separati per ciascuna zampa di almeno 15 min.
  12. Se necessario, utilizzare diversi spessori di vetro per generare differenti tassi di raffreddamento (Figura 3) 1.
    NOTA: Il tasso di raffreddamento è inversamente correlato con lo spessore del vetro.

4. Verifica del Mice Durante fredda Adattamento

NOTA: Questo è un protocollo alternativo che consente di testare la piattaforma di vetroe si raffredda, piuttosto che una volta che il piatto si è stabilizzata ei topi hanno completamente adattato per l'ambiente freddo.

  1. Seguire le istruzioni di cui alla sezione 1 per impostare l'apparecchio.
  2. Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misurazioni di base a RT (Figura 7A) 2.
  3. Pre-raffreddare le scatole in alluminio con ghiaccio secco.
  4. Una volta latenze ritiro di base sono stati misurati, posizionare le caselle preraffreddato sul piatto circa 1,25 '' di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati (Figura 7A, freccia etichettato come "ghiaccio secco ha aggiunto") 2.
  5. Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misure come la lastra di vetro si raffredda, le misurazioni il più spesso possibile.

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Representative Results

Le risposte comportamentali indotte da topi a partire da 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C sono altamente riproducibili (Figura 4A) 20. Per misurare lo stimolo freddo generato sotto il hindpaw, i topi sono stati anestetizzati con ketamina / xilazina / acepromazina cocktail e le zampe sono state fissate sul vetro sulla cima di una termocoppia di tipo T filamento (Figura 4B) 20. Il vetro è stato raffreddato o riscaldato alla gamma di test desiderato. Sebbene la piastra viene raffreddato uniformemente lungo la lunghezza della piastra (Figura 5A) 2, va notato che un gradiente fredda viene generato attraverso le custodie comportamento (Figura 5B) 2. Le parti del contenitore che sono più vicini al ghiaccio secco su entrambi i lati dei contenitori sono più fredde, mentre le parti centrali sono leggermente più caldo (Figura 5B) 2. Nelle temperature più fredde used, i topi trascorrono la maggior parte del loro tempo nelle parti centrali del contenitore. Una volta che la temperatura della piastra di vetro si era stabilizzato, uno stimolo ghiaccio secco focale è stato posizionato sul vetro sotto la zampa / thermode. Sulla base delle tracce temperatura registrati da questa configurazione, è chiaro che gli stimoli freddi generati utilizzando CPA sono altamente riproducibili ad ogni intervallo di temperatura (Figura 4C) 20.

Lo stimolo fredda generata nel CPA è stata determinata sulla base di tre differenti spessori di vetro per variare l'intensità del raffreddamento (Figura 3). Il tasso di raffreddamento è inversamente proporzionale allo spessore del vetro, e qualsiasi di questi spessori può essere utilizzata per misurare la sensibilità fredda come necessario (Figura 3).

Il lavoro precedente ha mostrato che il CPA può rilevare analgesia e ipersensibilità nei topi. 30 min dopo iniezioni sottocutanee di 1,5 mg / kg di morfina, i topi hanno significativamente longer latenza per il ritiro di topi dato iniezioni sottocutanee di soluzione fisiologica (Figura 6 a: 2-way ANOVA principale effetto * p <0.05 con il test di Bonferroni post-hoc; 30 min ** p <0.01; n = 12 per gruppo) 1. Con 60 min dopo la morfina / soluzione salina, non c'è differenza tra il saline- e gruppi morfina-iniettato, che è coerente con il tasso di metabolismo morfina in topi.

Completa di Freund Adjuvant (CFA) è stato precedentemente dimostrato di causare infiammazione e ipersensibilità dopo hindpaw iniezione 21. Dopo iniezioni CFA, le latenze ritiro CPA diminuiscono 2 e 3 ore dopo l'iniezione (Figura 6B: 2-way ANOVA effetto principale p <0,001 con Bonferroni post-hoc test; 2 ore * p <0,05, 3 ore ** p <0.01 n = 12 per gruppo). 4 ore dopo l'iniezione CFA, i topi hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di 1,5 mg / kg di morfina. 30 minuti dopo l'iniezione di morfina, sia CFA- e topi soluzione salina iniettata era aumentato withdrAwal latenze rispetto ai loro latenze alle 3 ore (Figura 6B: 1 ANOVA con test post-hoc di Dunnett, CFA 3 ore contro CFA 4,5 hr $$$ p <0,001, saline 3 ore contro salina 4.5 hr $$$ p <0.001). Un'ora più tardi, una volta che la morfina è stata metabolizzata, i topi CFA-iniettati, ancora una volta ha avuto latenze ritiro inferiori rispetto ai topi di controllo Salina-iniezione (figura 6B: 2-way ANOVA con test di Bonferroni post-hoc; ** p <0.01) 1.

La maggior parte delle specie di mammiferi hanno la capacità di adattare la loro sensibilità alla temperatura per abbinare il loro ambiente. In vitro, gli studi hanno suggerito che questo processo di adattamento dipende PIP 2 idrolisi 22- 24, ma gli strumenti comportamentali precedenti non erano in grado di convalidare questa ipotesi in vivo. Il CPA è in grado di quantificare questo adattamento in due modi diversi. Testando la latenza ritiro di topi come raffredda il vetro ( 2. In condizioni normali la latenza di ritiro è invariato come la piastra si raffredda, suggerendo che l'adattamento al freddo avviene più velocemente di quanto può essere quantificato con il CPA (Figura 7B: 0 min = 12.13 ± 0,8 sec, 30 min = 12.1 ± 1.6 sec, 60 min = 13.2 ± 1.1 sec, 90 min = 10,8 ± 1,2 sec 1 ANOVA con Bonferroni post hoc di prova p> 0.05, n = 6) 2. Tuttavia, quando i topi sono date intraplantar iniezioni della fosfolipasi C-inibitore U73122 25 prima che il piatto è raffreddato (Figura 7C) le latenze di astinenza sono diminuite, il che suggerisce che l'adattamento è compromessa (Figura 7D: baseline = 11.29 ± 0.53 sec, 30 min = 8.09 ± 1.17 sec, 1 ANOVA con test di Dunnett post-hoc, effetto principale p = 0,02, individuale basale vs 30 min p = 0.02, n = 9).

Il CPA può anche misurare l'ability di adattarsi a freddo temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo. Quando topi wild-type sono testati utilizzando CPA dopo essere acclimatati per 3 ore a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C la latenza recesso stesse temperature affatto partenza, suggerendo che il wild-type topi adattato alla temperatura ambiente più fredda (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sec, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sec, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sec, 12 ° C = 12.8 ± 0.5 sec, 1- ANOVA con test di Bonferroni post-hoc, p> 0.05 n = 6 per 30 ° C, n = 15 a 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C) 20. A differenza dei topi wild-type, mentre la temperatura iniziale diminuisce le latenze ritiro di topi TRPM8-KO diminuire, suggerendo che esse sono in grado di adattare la loro soglia di risposta per soddisfare il loro ambiente (Figura 8: 1-way ripetute misure ANOVA con Bonferroni post- Test hoc; maschi effetto principale p = 1.5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C 23 ° C vs p = 0,004; femmine effetto principale p = 3.6 x 10 -5, 12 ° C rispetto a 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C rispetto a 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 maschi e 11 femmine) 20.

Figura 1
Figura 1. Il freddo plantare Assay (CPA) apparato 2. (A) Schema per eseguire la CPA. I topi sono acclimatati su una lastra di vetro in custodie comportamentali plastica fino a quando sono a riposo. Un pellet di ghiaccio secco viene applicato alla parte inferiore del vetro sotto il hindpaw, e la latenza di ritirarsi dal vetro raffreddamento viene misurata. (B) Immagine dell'apparato CPA, in configurazione per raffreddare la piastra a 5 ° C. Il data logger termico è al centro delle custodie, E le scatole di alluminio fiancheggiano il contenitore su entrambi i lati. (C) Immagine dell'apparato CPA, in configurazione per riscaldare la piastra a 30 ° C. Il circolatore acqua scorre acqua calda nella scatola di alluminio, che poi fuoriesce lo scarico sul lato posteriore nel serbatoio del circolatore. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. La temperatura della lastra di vetro durante il CPA 2. (A) Averaged tracciati temperatura della lastra di vetro durante gli esperimenti comportamentali nella CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) diagrammi schematici demonstrating come generare le diverse condizioni di temperatura nel CPA. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Lo spessore del vetro è inversamente correlato con la velocità di raffreddamento 1. (A) Schema diagrammi disegno sperimentale (BD). La temperatura durante fredda plantare stimolo sotto la zampa è stato misurato su tutte tre spessori di vetro in condizioni normali, e distanziali polistirolo propping la zampa lontano dalla superficie del vetro. In tutti i casi, propping la zampa di distanza dal vetro causato una diminuzione drammatica nella stimolo freddo misurata alla zampa (n = 6 per spessore del vetro). ( et al. 2012 1 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. latenze ritiro CPA sono coerenti 20. (A) di latenza media di ritiro per i topi a partire da 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. (B) Configurazione per misurare CPA stimolo freddo. La zampa di un mouse anestetizzato è fissato sulla lastra di vetro con il nastro di laboratorio in cimadi un tipo T filamenti termocoppia. Lo stimolo CPA è posto sul lato inferiore del vetro sottostante sia zampa e termocoppia. (C) Temperature generati nella CPA a partire dal 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. Le frecce nere rappresentano le latenze medie di ritiro per topi svegli in ogni condizione. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. temperature lastra di vetro sono coerenti nella CPA 2. (A) termocoppia t1 (nero) è stato posto al centro della piastra. Termocoppia t2 (rosso) è stata posta nel contenitore comportamentale più vicino al bordo destro della piastra. TRA temperaturacings e il grafico all'estrema destra (t1-t2) mostrano temperature quasi identici a t1 e t2 durante tutto il corso dell'esperimento. (B) t1 termocoppia (nero) è stato posto al centro della piastra. Termocoppia t2 (rosso) è stata posta nel contenitore comportamentale centrale, in corrispondenza della parete più vicino alle scatole di alluminio ghiaccio secco-riempita. I tracciati di temperatura e il grafico all'estrema destra (t1-t2) mostrano che vi è una differenza di circa 3 ° C tra t1 e t2 quando la piastra ha raggiunto una temperatura stabile. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Il CPA può misurare analgesia e ipersensibilità 1. (A) Subcutaneous iniezione di 1,5 mg / kg di morfina aumenta la latenza ritiro di topi 30 min dopo l'iniezione (2 ANOVA con test di Bonferroni post-hoc; 30 min dopo l'iniezione ** p <0.01). 60 minuti dopo l'iniezione, non vi è alcuna differenza significativa tra la morfina-iniettato e topi saline-iniettato. (B) Intraplantar iniezione di 10 ul adiuvante completo di Freund (CFA) riduce la latenza ritiro di topi 2 e 3 ore dopo l'iniezione (2 ANOVA con Bonferroni post-hoc test; * p <0.05, ** p <0.01). Tutti i topi hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di morfina a 4 ore, e tutte le latenze di ritiro a 4,5 ore erano significativamente più alti rispetto a 3 ore (1 ANOVA con test post-hoc di Dunnet; $$$ p <0.001). 5.5 ore dopo l'iniezione di CFA (1,5 ore dopo l'iniezione di morfina), topi CFA-iniettati aveva ancora latenze ritiro inferiori rispetto topi soluzione salina iniettata (2-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test; ** p <0.01). Riutilizzati con il permesso diBrenner et al. 2012 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Misurazione adattamento freddo come la lastra di vetro si raffredda dinamicamente 20. (A) Schema per eseguire il CPA come la lastra di vetro si raffredda. Temperature basali sono misurati a temperatura ambiente, i contenitori di ghiaccio secco vengono aggiunti alla piastra, e la latenza recesso viene misurata come la lastra di vetro si raffredda. (B) topi wild-type hanno la stessa latenza ritiro come la lastra di vetro si raffredda, suggerendo che si adattano a temperature di raffreddamento più velocemente di quanto può essere misurato con il CPA (Baseline = 12.8 ± 0.3 sec, 30 min = 13.67 ± 0,9 sec, 60 min = 11.03 ± 1.0 sec, 90 min = 11,31 ± 0,6 sec, n = 3 topi; 1 ANOVA con test post-hoc di Bonferroni, nessuna differenza significativa tra tutti i gruppi). (C) Schema per eseguire la CPA come lastra di vetro si raffredda, dopo intraplantar iniezioni del U73122 inibitore PLC o l'U73343 compound di controllo. (D) I topi hanno latenze astinenza significativamente inferiori mentre la piastra si raffredda dopo l'iniezione U73122, U73122 suggerendo che interferisce con la capacità di adattarsi al raffreddamento temperatura ambiente. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 20. Questa figura è stato riprodotto con il permesso della Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (IASP). Il dato non può essere riprodotto per qualsiasi altro scopo senza autorizzazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Figure Topi Figura 8. TRPM8-KO non adattarsi al raffreddamento ambientale 20 topi TRPM8-KO hanno latenze ritiro più elevati rispetto wild-type fratellini a tutte le temperature misurate a partire (2-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test;. *** P < 0,001). La latenza ritiro di topi TRPM8-KO diminuisce anche al diminuire della temperatura di partenza (1-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test; ## p <0.01, ### p <0.001), mentre non vi è alcun cambiamento significativo nel ritiro la latenza di wild-type fratellini come cominciando diminuire della temperatura. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 20. Questa figura è stato riprodotto con il permesso della Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (IASP). Il dato non può essere riprodotto per qualsiasi altro scopo, senza il permesso. Si prega CLICk qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

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