Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

Medición de la capacidad de respuesta frío en roedores es importante para mejorar la comprensión de los mecanismos potenciales de sensibilidad al frío en los seres humanos, tanto en condiciones normales y patológicas. El Plantar Ensayo Fría (CPA), originalmente desarrollado hace varios años 1, está diseñado para generar respuestas reproducibles, sin ambigüedades murinos de comportamiento a un estímulo frío entregado a temperatura ambiente. Más recientes mejoras de este ensayo han permitido la medición reproducible de sensibilidad al frío en una amplia gama de temperaturas de 2. Ambas versiones también están diseñados para ser relativamente de alto rendimiento, y barato de usar.

Una gran parte de los avances se han logrado en la comprensión de los mecanismos de la sensibilidad al frío utilizando otros métodos de comportamiento. Un método es la prueba de la evaporación de acetona, que implica frotando o pulverización acetona en la pata del ratón y midiendo la cantidad de tiempo que gasta el ratón agitando el 3,4 pata. Desafortunadamente,las respuestas a la evaporación de acetona son confundidos por la sensación de humedad y el olor de la acetona. Además, el estímulo frío que se aplica en la prueba de la evaporación de acetona puede variar en función de la cantidad de acetona aplicado, y es difícil de cuantificar. Finalmente, los ratones no lesionados tienen respuestas mínimas a acetona al inicio del estudio, por lo que es imposible medir la analgesia en ausencia de hipersensibilidad con este método.

Otro ensayo clásico para las respuestas frías es el ensayo de retirada de la cola, donde se mide la latencia a la retirada después de la cola se encuentra inmersa en 5,6 agua fría. Mientras que las respuestas de comportamiento en este ensayo son inequívocos y el ensayo mide las respuestas a una temperatura específica, los animales deben estar sujetos durante la prueba, lo que puede alterar la capacidad de respuesta fría a través de bien descritos mecanismos analgésicos inducidos por el estrés 7.

Otra herramienta comúnmente usada es la prueba de la placa fría, que mide el comportamientorespuestas de los ratones después de que se colocan en una placa Peltier enfriado 8-10. Mientras que esta herramienta proporciona información sobre respuestas de los animales a temperaturas específicas, también se ha utilizado de manera incompatible; diferentes grupos han medido diferentes tipos de respuestas, incluyendo el número de saltos 8,11, la latencia hasta la primera respuesta 8,11- 13, y el número de la pata ascensores 11,13,14 con resultados muy diferentes. El ensayo de placa de frío es también relativamente bajo rendimiento, ya que sólo un animal puede ser probado a la vez, y requiere un dispositivo peltier caros y frágiles.

La prueba de preferencia la temperatura de la placa 2 es un derivado de uso común de la prueba de la placa fría que mide la cantidad relativa de tiempo que los animales pasan en 2 placas conectadas de diferentes temperaturas 9,15- 17. Otro ensayo comúnmente utilizado similar es el ensayo de gradiente térmico, donde la cantidad de tiempo que los ratones que pasan en diferentes zonas de temperaturaque oscila entre 5 ° C y 45 ° C en una placa de metal larga se mide 16. Si bien estos ensayos permiten la comparación de temperaturas, no está claro si el comportamiento representa la temperatura o la aversión a la preferencia de la temperatura.

Por último, el ensayo de placa fría dinámica ha sido utilizado para medir cómo los ratones responden a los cambios de temperatura ambiente 18. Este método consiste en colocar los ratones en un dispositivo peltier RT y el aumento gradual de abajo a 1 ° C, mientras que la medición de la cantidad de los ratones saltan o se lamen las patas a diferentes temperaturas de la placa. Si bien esta prueba cómo los ratones adaptarse a un entorno de enfriamiento, que no proporciona una forma de probar cómo los ratones responden a un estímulo frío en la configuración de un refrigerador de temperatura ambiente. Adicionalmente, se requiere un equipo costoso para llevar a cabo y no proporciona una manera para aclimatarse a los ratones el equipo de prueba antes de medir su sensibilidad al frío.

Para complementar estos ensayos, el CPA pone a prueba la ACCLIMAted respuestas a un estímulo frío bien definido en una variedad de rangos de temperatura, o durante el proceso de adaptación a climas fríos. Se puede probar hasta 14 ratones a la vez con nuestro aparato actual, con el potencial de ser económicamente a escala para ensayos de alto rendimiento.

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Protocol

Todos los protocolos de ratón estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Estudios Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington (St. Louis, MO).

1. Preparación de la Bandeja de Pruebas y Cajas

  1. Limpie la superficie del cristal.
  2. Fije la sonda de termopar de tipo T filamento a la superficie en el medio de la placa de vidrio con cinta de laboratorio.
  3. Coloca los recintos de los animales sobre la placa de vidrio en una sola línea a lo largo del centro de la placa.
  4. Pase la sonda termopar a través del centro recinto de animales y enchufe en el registrador de datos. Gire el registrador de datos en tiempo de desactivar la función de apagado automático, y conecte el registrador de datos al ordenador con el cable suministrado.
    1. Si el registro de la temperatura de la placa durante el experimento, abra el software de registro de datos para comenzar a registrar temperaturas de placas.
    2. Si es necesario, ajustar el software para volvercable de la temperatura de la placa una vez por segundo.
    3. Comience a registrar temperaturas utilizando el software incluido con el registrador de datos térmica.
  5. Separar el recinto con inserciones en negro para evitar la interacción visual entre ratones.
  6. Posición refleja debajo del vidrio de tal manera que la parte inferior de los recintos es visible desde una posición sentada cómoda.

2. El calentamiento / enfriamiento de la placa de vidrio

  1. Llenar cajas de aluminio con agua calentada, hielo húmedo, o hielo seco y la posición apropiada sobre la placa de vidrio (paquetes de papel de aluminio lleno de hielo seco se pueden utilizar también para enfriar el vidrio; Figura 1) 2.
    1. Para la prueba a 30 ° C, colocar las cajas de aluminio de aproximadamente 0,25 '' fuera de los recintos de los animales (Figura 2 B) 2.
      1. Establecer un circulador de agua caliente a cada lado de la placa de vidrio. Ajuste el termostato a 45 - 60 ° C, y nose para llenar las cajas de aluminio con un flujo constante de agua caliente (Figura 1 C) 2.
      2. Coloque los circuladores de tal manera que el agua caliente de las cajas de aluminio drena directamente de vuelta al depósito de la bomba de circulación en cada lado (Figura 1 C) 2.
    2. Para la prueba a temperatura ambiente, deje los cuadros vacíos (Figura 2) 2.
    3. Para la prueba a los 17 ° C, colocar las cajas de aproximadamente 0,25 '' fuera de los recintos de los animales de cada lado y se llenan de hielo húmedo (Figura 2) 2.
    4. Para la prueba a 12 ° C, colocar las cajas de aproximadamente 1,25 '' fuera de los recintos de cualquier lado y se llenan de hielo seco (Figura 2) 2.
    5. Para la prueba a 5 ° C, coloque las cajas de aproximadamente 0,25 '' fuera de los recintos de cualquier lado y se llenan de hielo seco (Figura 2) 2.
      1. Al enfriar el vaso con hielo seco, asegúrese de que haya suficiente ventilación para evitar la acumulación de CO 2 en la habitación.
  2. Espere a que el vidrio para alcanzar el rango de temperatura deseado.
  3. Añadir los ratones a los recintos de la placa.
    NOTA: un generador de ruido blanco puede ser utilizado para disminuir las perturbaciones de ruido.
  4. Espere a que los ratones se aclimate.
    NOTA: En nuestras instalaciones de esto toma aproximadamente 2,5 horas, pero esto puede variar de forma significativa sobre la base de alojamiento de los animales y las condiciones de manejo.
  5. Mantener el vidrio en el intervalo de temperatura deseado, garantizando que las cajas se mantienen llenas de agua caliente, hielo húmedo, o hielo seco.
    NOTA: Con nuestro aparato de las cajas necesita ser rellenado con hielo aproximadamente cada 90 min.
    NOTA: Para obtener la condición de 17 ° C, es útil para vaciar la mayor parte del agua de las cajas de aluminio a través de los orificios de drenaje antes de rellenar con hielo. Esto estabilizará la temperatura mejor, y prdesbordamiento evento
    NOTA: La cantidad exacta del hielo seco variará según la temporada, pero en general mantener las cajas de más de ¼ completo a lo largo de toda la longitud de la caja va a mantener la temperatura constante.

3. Prueba de los ratones a temperaturas fijas

  1. Fuera de la sala de comportamiento, llenar un cubo de hielo alrededor de la mitad llena de hielo seco.
  2. Con un martillo o mazo, machacar el hielo seco en un polvo fino.
    NOTA: Si sobrecarga el cubo hará que sea difícil para aplastar por completo el hielo seco en polvo.
  3. Utilizando una hoja de afeitar recta o tijeras, corte la parte superior de una jeringa de 3 ml.
  4. Utilizando una aguja de 21 G, meter 3 agujeros en los lados opuestos de la jeringa (total de 6 hoyos).
    NOTA: Estos agujeros se reducirá la presión generada por la sublimación mientras comprime el hielo seco. La jeringa de corte puede ser reutilizado para múltiples experimentos.
  5. Tome la jeringa, polvo de hielo seco, y un cronómetro de mano en la sala de comportamiento.
  6. Llene la cámara de la jeringa medio lleno de polvo de hielo seco. Mantenga el extremo cortado de la jeringa contra un objeto plano, y comprimir firmemente el polvo utilizando el émbolo. Ten cuidado; el émbolo de plástico puede doblarse o romperse por la presión. Si esto ocurre, vuelva a colocar el émbolo de una jeringa nueva.
  7. Extender la punta de la pastilla de hielo seco comprimido más allá del borde de la jeringa.
  8. Ratones de prueba que son totalmente en reposo.
    1. A 30 ° C, 23 ° C y 17 ° C, los ratones de prueba que tengan todas las 4 patas en el vidrio y no se mueve, pero no completamente dormido 19.
    2. A los 12 ° C y 5 ° C, los ratones de prueba que se encuentran en 2 patas o 4 patas y no se mueven o saltan.
  9. El uso de los espejos para la orientación, con suavidad pero con firmeza, presione el rubor pellet plana contra la superficie de cristal debajo de la pata trasera del ratón (Figura 1) 2. Inicie la mano automático.
  10. Detener el temporizador y retirar el sedimento cuando el ratón se aleja del vidrio enfriado.
    NOTA: El movimiento de retroceso puede ser vertical u horizontal.
    1. Si el ratón se mueve muy brevemente la pata y luego devuelve a la superficie de enfriamiento, continúe sincronización y la estimulación hasta que el ratón hace un movimiento permanente de distancia.
      NOTA: Nuestro laboratorio utiliza un tiempo máximo estímulo de 20 seg para ratones en la mayoría de los casos.
  11. Repita este procedimiento de prueba hasta que se recogen al menos 3 valores en cada pata de cada animal. Ensayos separados de prueba patas opuestas en el mismo ratón por al menos 7 min, y los ensayos consecutivos separados en una sola pata por al menos 15 min.
  12. Si es necesario, utilizar diferentes espesores de vidrio para generar diferentes tasas de enfriamiento (Figura 3) 1.
    NOTA: La velocidad de enfriamiento se correlaciona inversamente con el espesor del vidrio.

4. Prueba de la Ratones Durante Fría Adaptación

NOTA: Este es un protocolo alternativo que permite realizar pruebas como la plataforma de cristale enfría, en lugar de una vez que la placa se ha estabilizado y los ratones se han adaptado plenamente al ambiente frío.

  1. Siga las instrucciones que figuran en la Sección 1 para configurar el aparato.
  2. Siga las instrucciones que figuran en la Sección 3 para tomar mediciones de referencia a RT (Figura 7A) 2.
  3. Pre-enfriar las cajas de aluminio con hielo seco.
  4. Una vez que se han medido las latencias de retirada de línea de base, coloque las cajas preenfriados en la placa de aproximadamente 1,25 '' fuera de los recintos de cualquier lado (Figura 7A, flecha etiquetada como "hielo seco añadió") 2.
  5. Siga las instrucciones que figuran en la Sección 3 para tomar medidas como la placa de vidrio se enfría, tomando medidas tan a menudo como sea posible.

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Representative Results

Las respuestas de comportamiento inducidos a partir de ratones a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, y 12 ° C son altamente reproducible (Figura 4A) 20. Con el fin de medir el estímulo frío que se genera bajo la pata trasera, los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina / xilazina / acepromazina cóctel y sus patas fueron asegurados en el cristal en la parte superior de un termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. El vidrio se enfría o se calienta a la gama de prueba deseada. Aunque la placa se enfría de manera uniforme a lo largo de la longitud de la placa (Figura 5A) 2, debe tenerse en cuenta que un gradiente de frío se genera a través de los recintos de comportamiento (Figura 5B) 2. Las partes de la carcasa que están más cerca del hielo seco a cada lado de los recintos son más frías, mientras que las partes centrales son un poco más caliente (Figura 5B) 2. En las temperaturas más frías used, los ratones pasan la mayor parte de su tiempo en las partes centrales de la caja. Una vez que la temperatura de la placa de vidrio se había estabilizado, un estímulo hielo seco focal fue colocado en el cristal debajo de la pata / thermode. En base a las huellas de temperatura registrados de esta configuración, es evidente que los estímulos de frío generados usando el CPA son altamente reproducibles en cada rango de temperatura (Figura 4C) 20.

El estímulo frío generado en el CPA también se midió usando tres diferentes espesores de vidrio para variar la intensidad de la refrigeración (Figura 3). La velocidad de enfriamiento está inversamente relacionada con el espesor del vidrio, y cualquiera de estos espesores se puede utilizar para medir la sensibilidad al frío según sea necesario (Figura 3).

El trabajo previo ha demostrado que el CPA puede detectar la analgesia y la hipersensibilidad en ratones. 30 min después de las inyecciones subcutáneas de 1,5 mg / kg de morfina, los ratones tienen significativamente longer latencia a la retirada de los ratones que recibieron inyecciones subcutáneas de solución salina (Figura 6A: 2-way ANOVA principal efecto * p <0,05 con la prueba de Bonferroni post-hoc; 30 min ** p <0,01; n = 12 por grupo) 1. Por 60 min después de la morfina / solución salina, no hay diferencia entre la solución salina- y los grupos de morfina inyectada, lo que es consistente con la tasa de metabolismo de la morfina en ratones.

Adyuvante completo de Freund (CFA) se ha demostrado previamente para causar la inflamación y la hipersensibilidad después de la pata trasera de inyección 21. Después de las inyecciones de CFA, las latencias de retirada CPA disminuyen 2 y 3 horas después de la inyección (Figura 6B: 2-way ANOVA principal efecto p <0,001 con Bonferroni post-hoc test; 2 h * p <0.05, 3 h ** p <0,01 n = 12 por grupo). 4 horas después de la inyección de CFA, los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 1,5 mg / kg de morfina. 30 min después de la inyección de morfina, tanto CFA- y los ratones inyectados con solución salina habían aumentado withdrawal latencias en relación con sus latencias a las 3 horas (Figura 6B: 1-way ANOVA con test post-hoc de Dunnett; CFA 3 hr vs. CFA 4,5 hr $$$ p <0,001, solución salina 3 hr vs. solución salina 4,5 hr $$$ p <0,001). Una hora más tarde, una vez que la morfina había sido metabolizado, los ratones inyectados con CFA tenían una vez retirada latencias más bajas que los ratones de control inyectados con solución salina (Figura 6B: 2-way ANOVA con la prueba de Bonferroni post-hoc; ** p <0,01) 1.

La mayoría de las especies de mamíferos tienen la capacidad de adaptar su sensibilidad a la temperatura para que coincida con su entorno. In vitro, los estudios han sugerido que este proceso de adaptación depende de PIP 2 hidrólisis 22- 24, pero las herramientas de comportamiento anteriores no pudieron validar esta hipótesis in vivo. La CPA es capaz de cuantificar esta adaptación de dos maneras diferentes. Al probar la latencia de retirada de los ratones como el vidrio se enfría ( 2. En condiciones normales, la latencia de retirada es sin cambios como la placa se enfría, lo que sugiere que la adaptación en frío ocurre más rápido que se puede cuantificar con el CPA (Figura 7B: 0 min = 12,13 ± 0,8 seg, 30 min = 12,1 ± 1,6 seg, 60 min = 13,2 ± 1,1 seg, 90 min = 10,8 ± 1,2 seg 1-way ANOVA con post hoc de Bonferroni test, p> 0,05, n = 6) 2. Sin embargo, cuando se dan los ratones intraplantar inyecciones de la U73122 inhibidor de la fosfolipasa C-25 antes de la placa se enfría (Figura 7C) sus latencias de retirada se reducen, lo que sugiere que la adaptación se ve afectada (Figura 7D: línea de base = 11,29 ± 0,53 seg, 30 min = 8,09 ± 1,17 s; 1 ANOVA de un factor con el test de Dunnett post-hoc, el principal efecto p = 0,02, línea de base individual vs. 30 min p = 0,02, n = 9).

La CPA también puede medir la ability para adaptarse a temperaturas ambiente frías durante largos períodos de tiempo. Cuando los ratones de tipo salvaje se sometieron a pruebas de la CPA después de haber sido aclimatada durante 3 horas a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C, la latencia de retirada es la misma temperatura en absoluto de partida, lo que sugiere que la de tipo salvaje ratones adaptada a la temperatura ambiente más frío (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 seg, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 seg, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 seg, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 seg, 1- ANOVA de un factor con el test de Bonferroni post-hoc, p> 0,05 n = 6 para 30 ° C, n = 15 para 23 ° C, 17 ° C y 12 ° C) 20. A diferencia de los ratones de tipo salvaje, como la temperatura de partida disminuye las latencias de retirada de ratones TRPM8-KO disminuir, lo que sugiere que no son capaces de adaptar su umbral de respuesta para adaptarse a su entorno (Figura 8: 1-way ANOVA de medidas repetidas con Bonferroni post- hoc test; machos principal efecto p = 1.5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs 23 ° C p = 0,004; hembras efecto principal p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C frente a 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C frente a 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 varones y 11 mujeres) 20.

Figura 1
Figura 1. El Plantar Ensayo Fría (CPA) aparato 2. (A) Esquema para la realización de la CPA. Los ratones se aclimataron en una placa de vidrio en recintos de comportamiento plástico hasta que estén en reposo. Una de gránulos de hielo seco se aplica a la parte inferior del cristal por debajo de la pata trasera, y la latencia para retirar desde el cristal de refrigeración se mide. (B) Imagen del aparato CPA, en la configuración se enfríe la placa a 5 ° C. El registrador de datos térmica está en el centro de los recintosY las cajas de aluminio flanquean el recinto de cualquier lado. (C) Imagen del aparato de CPA, en la configuración para calentar la placa a 30 ° C. La circulación de agua que fluye el agua caliente en la caja de aluminio, que luego sale el desagüe en la parte posterior en el depósito de la bomba de circulación. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Temperatura de la placa de vidrio durante el CPA 2. (A) Promedio de trazados de temperatura de la placa de vidrio durante los experimentos de comportamiento en el CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) Diagramas esquemáticos demonstrating cómo generar las diferentes condiciones de temperatura en el CPA. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. El espesor del vidrio se correlaciona inversamente con la velocidad de enfriamiento 1. (A) Esquema de diagramas el diseño experimental (BD). La temperatura durante estímulo plantar frío por debajo de la pata se midió en los tres espesores de vidrio en condiciones normales, y los espaciadores de espuma de poliestireno que apuntalar la pata lejos de la superficie de vidrio. En todos los casos, apoyando la pata del vidrio causó una disminución dramática en el estímulo frío medida en la pata (n = 6 por espesor del vidrio). ( et al. 2012 1 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. latencias de retirada CPA son consistentes 20. (A) Promedio de latencia de retirada para los ratones a partir de 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. (B) Configuración para medir CPA estímulo frío. La pata de un ratón anestesiado se asegura en la placa de vidrio con cinta en la parte superior de laboratoriode un filamento de termopar de tipo T. El estímulo CPA se coloca en la parte inferior del cristal por debajo tanto de la pata y el termopar. (C) Las temperaturas generadas en el CPA a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. Las flechas negras representan las latencias medias de abstinencia para los ratones despiertos en cada condición. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. temperaturas placa de vidrio son consistentes en el CPA 2. (A) t1 termopar (negro) se colocó en el centro de la placa. T2 Termopar (rojo) se colocó en el recinto de comportamiento más próximo al borde derecho de la placa. Los tra temperaturacings y el gráfico en el extremo derecho (t1-t2) muestran temperaturas casi idénticos en t1 y t2 en todo el curso del experimento. (B) t1 termopar (negro) se colocó en el centro de la placa. T2 Termopar (rojo) se colocó en el recinto de comportamiento central, en la pared más cerca de las cajas de aluminio lleno de hielo seco. Los trazados de temperatura y el gráfico en el extremo derecho (t1-t2) muestran que hay una diferencia más o menos 3 ° C entre t1 y t2 vez que la placa ha alcanzado una temperatura estable. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. El CPA puede medir la analgesia y la hipersensibilidad 1. (A) Subcutaneous inyección de 1,5 mg / kg de morfina aumenta la latencia de retirada de los ratones 30 min después de la inyección (2-way ANOVA con la prueba de Bonferroni post-hoc; 30 min después de la inyección ** p <0,01). 60 min después de la inyección, no hay ninguna diferencia significativa entre la morfina y los ratones inyectados con solución salina inyectada. (B) la inyección intraplantar de 10 ul adyuvante completo de Freund (CFA) disminuye la latencia de retirada de los ratones 2 y después de la inyección de 3 horas (2-way ANOVA con la prueba de Bonferroni post-hoc; * p <0.05, ** p <0,01). Todos los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de morfina a las 4 horas, y todas las latencias de retirada de 4,5 horas fueron significativamente mayores en comparación con 3 horas (1-way ANOVA con test post-hoc de Dunnet; $$$ p <0,001). 5.5 hr después de la inyección de CFA (1,5 hr después de la inyección de morfina), los ratones inyectados con CFA todavía tenía las latencias de retirada más bajas que los ratones inyectados con solución salina (2-way ANOVA con prueba de Bonferroni post-hoc; ** p <0,01). Reutilizado con permiso deBrenner et al. 2012 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Medición de adaptación al frío como la placa de vidrio se enfría de forma dinámica 20. (A) Esquema para la realización de la CPA como la placa de vidrio se está enfriando. Temperaturas basales se midieron a temperatura ambiente, los contenedores de hielo seco se añaden a la placa, y la retirada de latencia se mide como la placa de vidrio se enfría. (B) los ratones de tipo salvaje tienen la misma latencia de retirada como la placa de vidrio se enfría, lo que sugiere que se adapten a las temperaturas de enfriamiento rápido que se puede medir con el CPA (LB = 12,8 ± 0,3 seg, 30 min = 13,67 ± 0,9 seg, 60 min = 11,03 ± 1,0 seg, 90 min = 11,31 ± 0,6 seg, n = 3 ratones; 1-way ANOVA con test post-hoc de Bonferroni, no hay diferencias significativas entre los grupos). (C) Esquema para la realización de la CPA como la placa de vidrio se está enfriando, después intraplantar inyecciones de la U73122 inhibidor de PLC o el U73343 compuesto de control. (D) los ratones tienen las latencias de retirada significativamente más bajos mientras que la placa se está enfriando después de la inyección U73122, U73122 lo que sugiere que interfiere con la capacidad de adaptarse a temperaturas ambiente de refrigeración. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 20. Esta figura ha sido reproducido con el permiso de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). La cifra no puede ser reproducida para ningún otro propósito sin permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"Figure Ratones Figura 8. TRPM8-KO no adaptarse a la refrigeración del medio ambiente 20 ratones TRPM8-KO tienen latencias de retirada más altas que sus compañeros de camada de tipo salvaje en todas las temperaturas a partir de medición (2-way ANOVA con la prueba de Bonferroni post-hoc;. *** P < 0,001). La latencia de retirada de los ratones TRPM8-KO también disminuye a medida que disminuye la temperatura de partida (ANOVA de 1 vía con Bonferroni post-hoc de ensayo; ## p <0,01, ### p <0,001), mientras que no hay cambio significativo en la retirada latencia de camada de tipo salvaje a medida que disminuye la temperatura de partida. Reutilizado con permiso de Brenner et al. 2014 20. Esta figura ha sido reproducido con el permiso de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). La cifra no puede ser reproducida para ningún otro propósito sin permiso. Por favor CLICk aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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