Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Цель этого протокола заключается в изоляции лимфатические эндотелиальные клетки, выстилающие человека лимфатическая киста порок, как сосуды и крайнюю плоть с помощью сортировки флуоресценции активированных клеток (FACS). После культивирования и расширение этих клеток клеток позволяет новый уровень сложности для экспериментальной генетических, протеомных, функциональных и дифференцировки клеток исследований.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Лимфатические расстройства системы, такие как первичная лимфедема, лимфатических пороков и лимфатических опухолей редкие условия, которые вызывают значительную заболеваемость, но мало что известно об их биологии. Изоляция очень чистые человеческие лимфатические эндотелиальные клетки (МИК) от больных и здоровых тканей будет способствовать исследования лимфатической эндотелия у генетических, молекулярных и клеточных уровнях. Предполагается, что эти исследования могут выявить целевые показатели для новых методов лечения, которые могут изменить клиническую управление этими условиями. Протокол описания изоляции крайней плоти человека LEC, и лимфатической пороков развития лимфатических эндотелиальных клеток (LM) Lecs представлена. Для получения одного суспензии клеток ткани измельчают и ферментативно лечить с помощью диспазу II и коллагеназы II. В результате суспензию отдельных клеток, то помечены с антителами к кластер дифференцировки (CD) маркеров CD34, CD31, фактора роста эндотелия сосудов-3 (VEGFR-3) и PODOPLANIN. СтаиNED жизнеспособные клетки были отсортированы на флуоресцентно активированного клеточного сортера (FACS), чтобы отделить Поз PODOPLANIN Поз LM LEC население CD34 CD31 низкий Поз VEGFR-3 от других эндотелиальных и не-эндотелиальными клетками. Отсортированные LM МИК культивировали и расширил фибронектина покрытием колбы для дальнейшего экспериментального использования.

Introduction

Основная функция лимфатической сосудистой системы, чтобы поглотить лимфы, избыток тканевой жидкости, содержащей липиды, белки и клеточные компоненты, и вести его к системе венозной крови. Сеть лимфатических капилляров лимфа направляет в лимфатические узлы, где она проверяется на наличие чужеродных антигенов, важного процесса в иммунного надзора и развертывания белых кровяных клеток, чтобы нейтрализовать чужеродные антигены.

Однонаправленный лимфатическая система начинает в тканях с начальной лимфатической капиллярной, уникальной структурой с разрывным одного слоя тонкостенных плоских эндотелиальных клеток со специализированными переходов, которые позволяют клеток лимфы запись 1,2. Эти капилляры прикреплены к соседней соединительной ткани матрицы с помощью анкерных нити, чтобы предотвратить разрушение сосудов в присутствии повышенного давления интерстициальной 3. Начальные лимфатические капилляры впадают в лимфатические капилляры сборачто сливаются в более крупные лимфатические сосуды или вены. По сравнению с первоначальным лимфатические капиллярные сосуды, лимфатические сосуды сбора имеют более толстые стенки сосудов, в сочетании лимфатические клапаны и заключены разрывной базальной мембраны, в которой несколько клеток гладких мышц встроены 4. Скоординированная открытие и закрытие клапанов лимфатических и сокращение гладкомышечных клеток способствует поток лимфы 3. У человека, лимфатические вены из различных областей тела соединяются в лимфатические стволы, которые, сливаясь, образуют два лимфатических протоков: грудной проток и правый лимфатический проток. Грудной проток дренирует лимфу от левой стороны тела и с правой стороны под грудью, а правый лимфатический проток стоков лимфатических от правой руки и правой стороны головы, шеи, и грудной клетки. Оба каналы вести лимфы в подключичной вены на шее 5.

Расстройства лимфатической системы широко сгруппированы в приобрелаго врожденными (Таблица 1). Примеры приобретенных условий лимфангит и вторичной лимфедемы. Лимфангит это воспаление лимфатического сосуда из-за бактериальной инфекции. Затронутые лимфатические расширяются и наполняются экссудата, содержащего полиморфноядерных клеток. В коже, эти лимфатические видны как красное, болезненное подкожной полосы часто сопровождается расширением соответствующей дренажной лимфатического узла (лимфаденита) 6. Вторичный лимфедема возникает вследствие повреждения или обструкции в лимфатический сосуд или обструкции лимфатических узлов. Это приводит к хроническим прогрессирующим отеком из-за накопления лимфы дистальнее повреждения или обструкции. В развитых странах, среднее лимфедема чаще всего связаны со злокачественной опухолью, где метастазирующих опухоли препятствовать лимфатические сосуды или региональных лимфатических узлов, или как следствие противораковой терапии после хирургического удаления лимфатических узлов, после облучения фиброза и пост-воспалительных тромбофлебитbosis и рубцов 7. В других частях мира, среднее лимфедема может быть вторичным по отношению к лимфатической обструкции, вызванной паразитическими червями, такие как Нитчатка Банкрофта 6.

Нарушения лимфатической сосудистой системы
Приобретенный Врожденный
Лимфаденит
Вторичный лимфедема
Первичная лимфедема 10 Отдельные Лимфатические Пороки 13 Лимфатическая Пороки, связанные с синдромами 13
например
Милрой синдром
Меж синдром
Простой:
Лимфатические пороки
например
Клиппеля-Tranaunay синдром
Парки Вебер синдром
Стердж-Вебера синдром
Комбинированный:
Капиллярные-лимфатической аномалии
Капиллярная-лимфатической-венозных порок
Капиллярная-лимфатической-артериовенозная мальформация
Капиллярная-лимфатической венозного артериовенозная мальформация

Таблица 1. Обзор нарушений лимфатической сосудистой системы.

Врожденные нарушения лимфатической системы включают в себя первичный идиопатический () лимфедема думал, чтобы быть вызван генетическими мутациями, лимфангиэктазия и аномалий лимфатической системы 8,9. Первичная лимфедема может быть спорадическим, вероятно, вызвано De Novo мутации, или по наследству. Лимфатические расстройства также могут быть изолированы или содержать часть более общей синдрома 10. В педиатрической популяции, 97% лимфыотек носит спорадический характер с отклонениями в лимфатической структуры сосуда, которые препятствуют региональной лимфодренаж 11. Болезнь Милрой является примером первичной лимфедема, вызванной мутацией в гене очевидным при рождении или вскоре после 12 в VEGFR-3. Хотя в основном семейной состоянии, болезнь Милрой также могут быть определены в детей без семейной истории болезни Milroy 32. Тяжесть любой лимфедема зависит от количества лимфы производства и способности транспортировать лимфу обратно венозного 6.

На основании клинической картины и на месте пролиферации эндотелиальных клеток, аномалии лимфатической системы классифицируются как опухолей лимфатических тканей или лимфатических мальформаций 13. Kaposiform lymphangiomatosis является примером LEC опухоли 14. Лимфатические пороки, как полагают, возникают во время эмбрионального развития и растут пропорционально ребенка 15,16. Они редко регрессируют, но может Remaiп бессимптомно до тех пор, травма или инфекция не выпадает быстрый рост, ведущий к клиническим осложнениям. Упорядоченную структуру лимфатической сети и проведения лимфы из тканей в венозное кровообращение, описанной выше возмущается в лимфатических пороков, которые состоят из локализованных коллекций аномальных кист структур, заполненных лимфатической жидкости. В то время как нет клинических или экспериментальных доказательств, что эти кистозные сосуды соединены лимфатической циркуляции, или что они содержат функциональные лимфатические клапаны, их лимфатической идентичность подтверждена путем экспрессии диапазоне лимфатических маркеров клеток, таких как PODOPLANIN, CD31, лимфатический сосуд эндотелиальных рецепторов 1 (LYVE-1), Просперо гомеобоксный белок 1 (PROX-1) и VEGFR-3 15,17,18. Эти кистозные структуры могут быть небольшой (microcystic) или большой (macrocystic), но большинство лимфатических пороки содержать как microcystic и macrocystic компоненты (рис 1) 16. После операции, injectioп склеротерапия и / или радиочастотная абляция лимфатические пороки часто повторяться.

Фигура 1
Рисунок 1. Морфология лимфатических сосудов и лимфатических человека пороков развития. Нормальный человек лимфатической () и лимфатические сосуды пороков (B и C), меченные антитела PODOPLANIN (коричневый этикетка, стрелка). Человека лимфатические сосуды пороков характеризуется выраженной дилатации и значительном изменении размера просвета. Эти локализованные аномальные кистозные структуры могут быть небольшой (microcystic, *) (В) или большие (macrocystic, #) (С). Большинство лимфатических пороки содержать как microcystic и macrocystic компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке. </ P>

Некоторые исследователи предположили, что лимфатические мальформации представляют собой нарушение развития из лимфатических сосудов, в которых МИК не имеют аномальные потенциал роста, но вместо этого не смогли подключиться к нормальной циркуляции 19. Тем не менее, мы обнаружили, что LM МИК пролиферируют быстрее и более устойчивы к апоптозу, чем плоть МИК 15 что свидетельствует о наличии первичного дефекта в LM МИК. Когда LM МИК имплантируются в мышиной модели ксенотрансплантата, они образуют структуры, напоминающие лимфатических пороков 15. Это подтверждает гипотезу о том, лимфатические мальформации может быть вызвано одной или более соматических мутаций, возникающих в LM МИК во время развития плода. Действительно, последние отчеты выявили одну такую ​​мутацию в p110α каталитической субъединицы фосфоинозитидного-3-киназы (PIK3CA) гена 20.

Учитывая достижения в секвенирования ДНК технологии, соответствующие мутации грУальд быть более легко идентифицировать в изолированных LM МИК, направляя будущие исследования этих условиях. Изоляция жизнеспособных МИК бы облегчить сравнение между аномальными и нормальными LEC, в анализах, таких как миграция, распространение, способность трубы формирования и выживания в ответ на снижение доступности питательных веществ или проапоптотических агентов 15. Изолированные МИК далее позволило бы нам выполнить экспрессию гена соты и протеомические исследования, чтобы очертить новые LEC субпопуляции и открыть новые фармакологические агенты, пригодные для клинического управления лимфатических пороков развития.

Ранее мы опубликовали LEC метод изоляции на основе магнитной сепарации бусинок МИК от неонатальной крайней плоти и лимфатических пороков 15. Мы сообщали о стратегии разделения нормальных и пораженных Lecs из сосудистых эндотелиальных клеток, основанных на отсутствие экспрессии CD34, после чего подвергают клеточной фракции CD34 Отрицательное положительного отбора CD31.Тем не менее, этот метод был затруднен из-за наличия остаточных без эндотелиальных клеток. Это не зависит от удаления эпидермиса до последующего соединительной ткани пищеварения. Эти загрязняющие вещества, как правило распространились быстрее и, таким образом, в конечном итоге переросла в эндотелиальных клеточных культур, несмотря на последующие попытки повторить изоляции LEC. Действительно, начальное загрязнение без эндотелиальных клеток, как низко как 2% до 5% было достаточно, чтобы подавить LEC население 15. Это побудило нас исследовать флуоресцентно активированной метод сортировки клеток в качестве опции для улучшения LEC выход клеток и чистоту. Кроме того, мы использовали мульти-параметр сортировки для повышения специфичности LEC населения, добавив, VEGFR-3 и PODOPLANIN маркерам отбора для выявления CD34 CD31 низкий поз VEGFR-3 поз PODOPLANIN поз Lecs.

Основанием для выбора этих маркеров на основе докладов, которые в то время МИК и кровеносная эндотелия CEзаполняет много маркеры клеточной поверхности общие, такие как CD31, МИК показать фенотипическую вариацию в их выражения CD34, PODOPLANIN и VEGFR-3 клеточной поверхности маркера по сравнению с кровью сосудистых эндотелиальных клеток 21-23. CD31 представляет собой 130 кДа трансмембранный гликопротеин также известный как тромбоцитов молекулы клеточной адгезии эндотелиальных 1 (РЕСАМ-1). Это считается пан-эндотелиального маркера клеток, поскольку он экспрессируется на всех типах кровеносных и лимфатических сосудов 21,24,25. CD34 110 кДа трансмембранный гликопротеин присутствует на самых гемопоэтических предшественников и стволовых клеток, сосудистые эндотелиальные клетки и некоторые лимфатические сосуды 26.

VEGFR-3, рецептор для роста сосудистого эндотелия факторы С и D, изначально присутствующих на развивающихся вен у эмбрионов мыши, но после лимфатической спецификации регулируемой факторов транскрипции SRY связанную HMG-бокс (SOx) -18, C Hicken О valbumin у pstreaм р romoter т ranscription е актер 2 (COUPTF-II), и PROX-1, VEGFR-3 венозная выражение теряется и становится ограниченной эмбрионального МИК 25,27. PODOPLANIN, 38 кДа мембрана мукопротеина, сначала отметил на лимфатические сосуды примерно эмбриональных 11 день (~ E11.0) мышиного эмбрионального развития 28 и в то время он сильно выражена микрососудистых лимфатических сосудов, PODOPLANIN выражения по macrocystic лимфатической эндотелия в лимфатических пороков более 15 Переменная. Проточной цитометрии эксперименты показывают, что по крайней мере некоторые CD34 CD31 высокий Pos эндотелиальные клетки выразить лимфатическую маркер PODOPLANIN 29. Хотя систематическая оценка LYVE-1 и PODOPLANIN окрашивания в лимфатических пороков человека показали, что оба являются эффективными в окрашивания лимфатическую порок эндотелий 30, в нормальных тканях, LYVE-1, как сообщается, настоятельно присутствует в начальной лимфатическойэндотелия капилляров, но снижается и даже отсутствуют в коллекторной лимфатической эндотелия 31. Поскольку наша цель состоит в том, чтобы изолировать и начальные и сбор лимфатические эндотелиальные клетки, мы решили не использовать LYVE-1, как часть нашей стратегии отбора клеток. Наконец, решение использовать эти маркеры была также основана на наличии антител, которые используются для маркировки диагностически лимфатические сосуды для микроскопических изображений, особенность, которая позволила бы корреляцию между проточной цитометрии и иммунофлуоресцентных исследований.

Эта статья будет описывать метод ткани пищеварения, окрашивание клеток и настройки FACS, необходимое для успешного выделения CD34 CD31 низкий Поз VEGFR-3 Pos Pos PODOPLANIN LEC, а также CD34 CD31 высокий Поз рецептор-3 Поз PODOPLANIN Pos эндотелиальных клеток из плоти и лимфатической пороков ткань.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этика заявление: Этическое одобрение коллекции лимфатических пороков развития и крайней плоти тканей была получена из комитетов по этике научных исследований человека в Королевской детской больницы в Мельбурне, Австралия. Подписано согласие было получено от родителей пациентов до операции. Образцы тканей были собраны от пациентов с диагнозом лейомиом проходящих хирургических процедур в рамках их клинического управления и пациентов, перенесших выборные обрезание. Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами национального здравоохранения и медицинского исследовательского совета, Австралии.

1. Подготовка клеточной суспензии из крайней плоти и лимфатической тканей порок

  1. Буферы и СМИ Подготовка.
    1. Подготовить всю эндотелиальных клеток носитель с помощью имеющихся в продаже внеочередного-2 мВ Пуля Kit путем нагревания внеочередного-2 СМИ и аккуратно оттаивания компоненты набора в 37 ° С на водяной бане. В класс II биобезопасности кабинета, в асептических условияхдобавить каждый компонент в ВОСА-2 средства массовой информации. После того, как все компоненты добавляются в средствах массовой информации, обратитесь к этому СМИ как «полного эндотелиальных клеток СМИ». Использование стерильных 50 мл пипетки, чтобы смешать содержимое перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, имеющие отношение к культуре клеток осуществляется в биологической кабинета класса II. Все растворы хранили при 4 ° С в соответствии с инструкциями производителей и нагревают до комнатной температуры перед использованием. Полные эндотелиальных клеток средств массовой информации, культуры клеток буферы и растворы ферментов которые нагревали при 37 ° С в течение 20 мин перед использованием.
    2. Дополнение полный эндотелиальных клеток носитель с 50 нг / мл VEGF-C. Алиготе, дополненную эндотелиальных клеток СМИ в 50 мл стерильные пробирки и хранят при температуре 4 ° С до использования. Носитель стабилен в течение по крайней мере, 4 недель при хранении при 4 ° С.
    3. Подготовьте кальций и магний свободный фосфатно-солевом буфере (PBS) путем растворения 8,752 г NaCl, 1,416 г Na 2 HPO 4 · 2H 2 O и0,395 г KH 2 PO 4 в 1000 мл воды. Регулировка рН до 7,4. Фильтр стерилизовать с помощью PBS 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° С. Перед использованием добавить антибиотик / противогрибковым решение (используется в соотношении 1: 100).
    4. Чтобы приготовить человеческого фибронектина, растворить 1 мг фибронектина в 10 мл стерильной воды. Хранение восстановленной решение в 100 мкл аликвотах при -20 ° C. В день применения добавляют 10 мл стерильного PBS до 100 мкл аликвоты фибронектина (с получением конечной рабочей концентрации 10 мкг / мл).
    5. Для ферментных сред, приготовить раствор, содержащий 0,04% диспаза II, 0.25% коллагеназы II и 0,01% ДНКазы I в стерильной PBS. Во-первых, вес диспазу и коллагеназы, место в стерильную пробирку на 50 мл, добавляют необходимый объем PBS и инкубируют в течение 30 мин при встряхивании при 37 ° С, чтобы растворить. После растворения, фильтр стерилизуют (0,22 мкм фильтр) диспаза / коллагеназа решение в капот биобезопасности. Соблюдая правила асептики, добавьте ДНКазы I. хранить ферментативной решение при 37 ° С до тех пор,использовать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКазы I является коммерческой культуры клеток хч доступны стерильного лиофилизированного порошка.

2. Подготовка клеточной суспензии из крайней плоти и лимфатических мальформаций

  1. Взвешивают 50 мл пробирку, содержащую 10 мл / 2% противогрибкового антибиотика раствора DMEM. Эта трубка будет использоваться для сбора ткани.
  2. После хирургического удаления лимфатических пороков и крайней плоти тканей, в асептических условиях добавить образец ткани к трубе и передачи на льду в лабораторию для культивирования клеток.
  3. Взвесить трубки, содержащей ткани и рассчитать вес ткани. Используйте этот вес, чтобы рассчитать объем ферментативного раствора, необходимого для переваривания ткани.
  4. В кабинете класса II биобезопасности, использовать стерильные щипцы для передачи ткани и СМИ в 100 мм блюдо культуры ткани. Используйте стерильные ножницы, чтобы мелко рубите ткани в ~ 1 мм 3 штук.
  5. Передача измельченной ткани смешиваются со средствами массовой информации Iас в 50 мл пробирку, содержащую дополнительные 10 мл стерильного DMEM / 2% противогрибкового антибиотика раствора. Смешайте обращением к вновь приостановить ткани. Центрифуга образца при 300 х г в течение 5 мин.
  6. Удалить супернатант. На основании веса ткани, добавить 1 мл подогретого (37 ° С) коллагеназы II / пищеварения раствора ДНКазы I / II диспазу на 100 мг фарша ткани. Как правило, используют 10 мл раствора фермента в течение приблизительно 1 г измельченной ткани.
  7. Инкубируйте ткани в 37 ° C инкубаторе в течение 20-90 мин с постоянным встряхиванием при 200 оборотах в минуту. В конце этого периода, гарантировать, что почти все ткани переваривается на мелкие фрагменты.
    Примечание: Воздействие на клетки в коллагеназы и диспаза во время выделения из тканей влияет выживания первичной клетки. Мы нашли эмпирически, что большинство новорожденных крайняя плоть образцы оптимально требуют 20-30 мин пищеварения, в то время как фиброзные лимфатические образцы пороков может потребовать 60-90 мин пищеварения. Л.М. LEC выходс влияют на сумму фиброза настоящего, более волокнистой ткани получают меньше клеток, возможно из-за вредных эффектов длительного воздействия коллагеназы II и диспаза II.
  8. После расщепления, передать трубку к шкафу биологической безопасности и передать переваренной ткани раствор через 70 мкм сито помещают в стерильную пробирку на 50 мл. Использование 3 мл шприц поршень с резиновым поршнем, стачивать оставшуюся ткань до тех пор, пока наблюдаются лишь небольшие следы внеклеточной матрицы.
  9. Промыть клеточный фильтр с объемом эндотелиальных клеток среднего эквивалентного объема диссоциации фермента среду для восстановления клеток налипшие на сито и для инактивации ферментов. Например, в течение 2 мл диссоциации фермента среды переваривать измельченной ткани, добавляют 2 мл среды эндотелиальных клеток с целью инактивации ферментов.
  10. Центрифуга клеток раствора при 300 х г в течение 5 мин и надосадочную жидкость аспирации. R> электронной суспендирования клеток в 10 мл PBS. Центрифуга клетки при 300 мкгв течение 5 мин, удалить супернатант затем повторить два раза для промывки ячеек. > Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл среды эндотелиальных клеток. Граф клеток с использованием трипанового синего затем семена 2 х 10> 6 клеток в 150 см> 2 колбу, предварительно покрытые фибронектином, в конечном объеме 20 мл эндотелиальных клеток среды. Культура при 37 ° С в 5% CO> 2 в увлажненном инкубаторе воздуха.>
    Примечание: Предполагается, что 75% -90% ядерных клеток выживать ткани пищеварение, как оценивается трипанового синего. Первоначальный подсчет клеток отражает все ядерные клетки в клеточной суспензии (т.е. кератиноциты, лейкоциты, макрофаги, клетки соединительной ткани и клетки кровеносных сосудов). Количество клеток в 5-7 дней отражает клеток, которые прикреплены, выжили и распространились во клеточной культуре. Покрытие ткани культуры колб с фибронектина также улучшает последующую LEC и Л.М. LEC выживание.
  11. После инкубации в течение ночи, смыть несвязанных клеток в трех промывок P/ 1% раствор антибиотиков противогрибковое BS и добавить свежий эндотелиальных клеток среду. Провести трех промывок для эффективного удаления несвязанных клеток и красных кровяных клеток, присутствующих в колбу. Изменить СМИ каждый второй день. Клетки будет ~ 80% сливной после 5-7 дней.

3. Антитела Окрашивание клеток для лимфатической эндотелиальных клеток поверхностных маркеров для проточной цитометрии

  1. После того как клетки достигли 80% слияния, аспирация среды и промыть клетки с PBS.
  2. Отделить прилипшие клетки путем инкубации клеток с 7 мл раствора открепления клеток, таких как Accutase за 150 см 2 колбы 5-7 мин при 37 ° С.
  3. Урожай отдельные клетки, инактивации открепления клеток путем добавления раствора 3 объема эндотелиальных клеток среды и передачи клеточной суспензии в новую стерильную пробирку.
  4. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 мин.
  5. Отберите супернатант и повторно приостанавливать клетки в 5 мл PBS. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин, снять Supernatant затем повторите клеток мыть. Re-приостановить клетки в 5 мл PBS.
  6. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл 0,4% трипанового синего. Передача 10 мкл этой суспензии гемоцитометре для подсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: выход последней ячейки будет зависеть от размера выборки обрабатывается. Обычно выход клеток на 150 диапазонов см 2 колбах с 7 × 10 5 до 1,2 × 10 6 жизнеспособных клеток.
  7. Подготовка антител решения для окрашивания клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие разведения титруют для окрашивания 1 х 10 6 в объеме окрашивания 100 мкл.
    1. Развести ЧП сопряженный мыши против человеческого VEGFR-3 (1:50); ПЭ-конъюгированного Cy7 мыши против человеческого CD34, конъюгированного (1: 200); APC-сопряженных мыши против человеческого CD31 (1: 100) и Alexa 488, конъюгированных крысы против человеческого PODOPLANIN (1: 200) в общем объеме 100 мкл стерильной 5% FBS / PBS раствора на образце ткани. После подготовкираствор антитела, не держать на льду до использования. Аналогично готовят разбавленную смесь контроля изотипа, чтобы облегчить установку проточной цитометрии ворота.
  8. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание антител, центрифуги клетки при 300 мкг в течение 2 мин, затем удалить супернатант суспендирования клеток в 100 мкл стерильной 5% FBS / PBS раствора на образце, чтобы быть окрашены. Инкубируйте клетки на льду в течение 20 мин при 4 ° С.
  9. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин, затем удалить супернатант повторно приостанавливать клетки в коктейль конъюгированного антитела. Кроме окрасить меньший аликвоту клеток (1 × 10 5) в контрольной смеси изотипа 100 мкл антител. Инкубируйте клетки на льду в течение 20 мин.
  10. Для удаления несвязанного антитела, добавить 2 мл 2% FBS / решение PBS и центрифуги клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и повторите мытье.
  11. Ресуспендируют осадок клеток для контроля изотипа и образца окрашивали антителами быть отсортированы в 300 мкл 0,5 мг / мл пропидиума IOДидье / 2% -ный раствор ФБС / PBS. Поместите трубки на льду до сортировки.

4. Сотовый Сортировка

  1. Используйте следующие материалы для установки прибора; выравнивания шарики, такие как коммерчески доступных флуоресцентных частиц, забуференный фосфатом физиологический раствор на основе оболочки жидкости и бисером задержки падение, таких как флуоресцентные шарики Accudrop.
  2. Изолировать очищенные человеческие Lecs на многопараметрической флуоресценции активирован сортировки клеток инструмента в. Установите инструмент и выровняйте в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Кроме того, запустить один контроля компенсации пятно с каждого вида генерации компенсации матрицу и, таким образом, устранить существенный кровотечение через эмиссии флуорохромов, таких как PE в канал ПЭ-Су.
    ПРИМЕЧАНИЕ: выше доля FACS отсортированных клетки выживают изоляции, если сопло 100 мкм используется и клетки сортируются в эндотелиальных клеток среды.

5. Культура клеток FACS сообщение СортироватьING

  1. После сортировки, центрифуг клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 5-10 мл среды (в зависимости от используемой колбу, чтобы отобрать клетки). Если менее 50000 клеток сортируются, клетки культивируют в фибронектина покрытием 25 см 2 колбу.
  2. В противном случае культура клеток в 75 см 2 фибронектина покрытием колбы при 37 ° С в 5% CO 2, воздух увлажненным инкубатора. Изменить журналистам после 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовый медиа меняется каждый второй день, потому что продлевая время между изменениями медиа появляется в пользу выживания без эндотелиальных клеток. Мы проверить фенотип лимфатическую эндотелиальных клеток с помощью иммуногистохимического обнаружения маркеров: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 и CD31, когда клетки первый раскол для дальнейшего расширения 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После первоначального ткани пищеварения, после 24 часов в культуре нефракционированного образцов, отдельные колонии эндотелиальных клеток может наблюдаться (фиг.2А) вместе с фибробластоподобных клеток и клеток гладкой мускулатуры. После сортировки и после 24 часов в культуре клеток, то CD34 CD31 низкий Поз VEGFR-3 Поз Podoplanin Pos клетки приложить и показать типичный булыжник морфологии (рис 2B и C). Используя метод, описанный выше FACS, мы способны очистить клетки до 99,8% чистоты и отличить их от CD34 CD31 высокий Поз VEGFR-3 Поз Podoplanin Pos эндотелиальных клеток. Представитель результаты стробирования стратегию и сортировки представлены на рисунке 3. Это решены вопросы испытали при использовании метода изоляции магнитного шарик. На сегодняшний день, мы пассировать эти клетки до прохода 13. После этого отрывка, Л.М. МИК и крайней плоти LECначнем с старения, сопровождается морфологическими изменениями и снижением клеточного деления.

Рисунок 2
Рисунок 2. крайней плоти МИК и LM-LEC. Двадцать четыре часа после ферментативного расщепления, несортированные клетки содержат эндотелиальных (стрелка) и не-эндотелиальные клетки (а). После выделения CD34 CD31 низкий Поз рецептор-3 Поз Podoplanin Поз FACS клеток, крайняя плоть МИК (B) и LM-LEC, (C) лишены без эндотелиальных клеток и поддерживать булыжником морфологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке ,

Рисунок 3
Рисунок 3. флуоресценции активирован сортировки клеток стратегии стробирования для сортировки клеток сосудистой и лимфатической эндотелиальной клеткис. (А) Живые клетки сначала закрытого на CD34 и CD31 экспрессии, с последующей VEGFR-3 и PODOPLANIN стробирования для рода сосудистой (б) и лимфатической эндотелия (С) клеток, соответственно. (D), Re-анализ сортируются CD34 CD31 высокий Поз VEGFR-3 Поз PODOPLANIN Pos клеток шоу> 98% фенотипа эндотелиальных клеток. (E) LEC клетки отсортированы по CD34 CD31 низкой Поз VEGFR-3 фенотипа Поз PODOPLANIN Pos также> 98%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

МИК играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, иммунный ответ на чужеродные антигены и поглощения и транспорта некоторых питательных веществ. LEC гомеостаз могут быть затронуты болезненные процессы, такие как бактериальные инфекции и метастазов опухоли, но МИК может развиваться соматические мутации, которые приводят к образованию неблагополучных лимфатических сосудов и значительной заболеваемости для больных. Чтобы получить более глубокое понимание лимфатической пороков этиологии через имплантации в естественных условиях и экс естественных экспериментов, и открыть для себя новые варианты лечения, мы впервые разработали метод изоляции LEC на основе магнитного борта стратегии селекции с использованием CD34 CD31 отр Pos стратегию выбора 15. Тем не менее, в результате культуры часто содержатся другие, чем эндотелиальные клетки, которые трудно удалить клетки. Впоследствии, метод был усовершенствован с помощью FACS для сортировки Lecs, которые выражают CD34 CD31 низкий Pos VEGR3 PОС PODOPLANIN Поз фенотип. Этот подход привел к относительно однородных LEC культур, содержащих <0,5% не- CD34 CD31 низкий Поз VEGR3 Поз PODOPLANIN Pos клеток на пост сортировки проверки. С практической точки зрения, преимущество сортировки клеток с помощью FACS, что снижение не- Lecs присутствии чтобы <0,5%. Искусственный МИК и LM МИК имеют типичную морфологию булыжника и стать стареющей вокруг прохода 13.

В этом исследовании мы описали цитометрии основе протокола потока для изоляции и культуры высоко обогащенных МИК от нормальных и аномальных тканей на основе их выражения набора маркеров клеточной поверхности (CD34 CD31 низкий Поз VEGR3 Поз PODOPLANIN Pos). Клетки были классифицированы от первичных тканей следующие 5-7 дней расширением в пробирке, шаг, который привел к значительному обогащению LEC по сравнению с их частотой в тканях во время изоляции. Во Surgery получаем тканей, начиная от нескольких микрограммов до нескольких десятков граммов в весе. Эта ткань может сильно варьироваться в своем составе по отношению к объему лимфатических сосудов мальформации присутствующих, ткани рубцов и наличие лимфатической порок кисты тромбов. Все эти компоненты будут влиять, сколько клетки могут быть выделены из пораженных тканей. Следовательно, начиная количество клеток может варьироваться от нескольких тысяч клеток до нескольких миллионов клеток. Кроме того, это будет влиять на состав клеточной суспензии и начинают числа клеток означает, что количество отсортированных клеток также отличаются от одного образца к другому.

Частота LEC, в несортированных образцов крайней плоти следующие 5-7 дней в культуре колеблется от 0,52% до 4,7%, в то время как LM МИК варьируются от 0,8% до 12,43%. В LEC культуры состоит> 99% CD34 CD31 низкий Поз VEGR3 Поз PODOPLANIN Поз клетки после после сортировки повторный анализ и поддерживается типичной cobblestonе морфология культуры до старения при прохождении ~ 13 без зарастания по не-эндотелиальных элементов.

Это необходимо расширить клетки экс естественных условиях после первоначального ткани пищеварения и сортировки, потому что выход либо крайней плоти или лимфатических клеток пороков развития, как правило, низкая. Таким образом, расширение до лимфатических эндотелиальных клеток I N пробирке позволяет генерировать на ~ 2x10 6 клеток, необходимых, чтобы отобрать камеру мыши. Это требует стадии расширения в пробирке 5-7 дней. В то время как мы признаем, что культура клеток может вызвать фенотипические изменения в первичных клеток, мы показали, что эти культивируемые клетки сохраняют способность к образованию лимфатические мальформации, как структуры в модели ксенотрансплантата мыши 15.

Есть несколько важных шагов в рамках протокола, которые определяют степень успеха при сортировке клетки FACS. Наиболее важным шагом является время воздействия на клетки, чтобы коллагеназыи диспазу в процессе выделения из первичных тканей, как описано в шаге 2.7. Это не только зависит от количества и типа ткани настоящем, но и партии ферментов, используемых. Кроме того, флуоресцентно меченые антитела, используемые для характеристики клеточных популяций необходимо титровать и предпочтительно моноклональными. Мы протестировали несколько различных клеток отряд решения, такие как трипсин / ЭДТА, ЭДТА, TrypLE Выберите и открепления клеток решения. Мы обнаружили, что ЭДТА было использовать в течение длительного периода времени, чтобы отделить клетки и остаточного скопления клеток часто оставались. В отличие от суспензии отдельных клеток были получены в течение 3-5 минут инкубации в трипсина / ЭДТА, мобильный отряд решения и TrypLE Select. Мы не нашли никакого существенного различия в экспрессии CD31, CD34, Podoplanin и VEGFR-3 после лечения с любым из растворов фермента. Холост окрашенные образцы также должно быть сделано с каждым сортировки эксперимента, чтобы обеспечить, что спектры излучения флуорохромом не перекрываются иПоэтому дать неверные показания. Эти важные шаги являются также шаги, где изменения в протокол клеток могут потребоваться или устранения неполадок в проточной цитометрии сортировки.

По сравнению с ранее опубликованными изоляции магнитного бусинок МИК 15, преимущество изолирующих МИК по FACS включает в себя следующее: более быстрое выделение клеток с высокой степенью чистоты и идентификации дискретных подмножеств клеток и редких популяций в гетерогенной образца. Основными ограничения FACS на основе LEC и изоляции Л.М. LEC вращается вокруг ограниченного числа клеток, доступных для проверки следующих клеток сортировки результатов. Кроме того, в то время как каждый попытка стандартизировать наши анализы и инструмент настройку, эти же параметры могут не обязательно быть воспроизводимым в других лабораториях. Таким образом, некоторые различия в результатах может произойти. Кроме того, одним из вопросов, которые лимфатические биологи сталкиваются является отсутствие специфических маркеров клетокчто бы различать начальные маркеры капиллярной LEC и сбора капиллярные LEC маркеры. На этом этапе мы еще не определили LEC маркеры, которые бы различие между здоровыми и МИК МИК LM. С лимфатической ткани порок также содержит нормальный вид лимфатические сосуды (рис 1а), в результате чего CD34 CD31 низкий Поз VEGR3 Поз PODOPLANIN Поз будет содержать долю нормальных LEC, а также тех, больной фенотип. Будущие исследования изучения LEC и экспрессии генов Л.М. LEC и протеомики могут быть в состоянии направить нас к более конкретным LM LEC маркеры, которые могли бы отличить LM Lecs из МИК в той же ткани.

В будущем, мы ожидаем, чтобы использовать FACS и эти новые LEC маркеры в попытке идентифицировать редкие подмножества LEC населения, как в крайней плоти и лимфатических пороков развития. Это позволит нам выделить эти клеточные популяции и изучить их роль в развитии lymphatic сосудистой системы и лимфатических пороки.

Изолирующие МИК и Л.М. МИК на основе CD34 CD31 низкой Pos VEGR3 Pos Pos PODOPLANIN значительно снижается загрязнение без эндотелиальных клеток. Кроме того, технология FACS позволяет отделить Lecs на подтипы на основе выражения CD31, PODOPLANIN и VEGFR-3 маркеров клеточной поверхности и, чтобы понять это в контексте развития клеточных клонов. Для больных МИК, это позволяет для сотовых конкретных исследований, которые проливают дополнительный свет на гены, вызывающие заболевания LEC и способность LEC в ответ на различных клеточных стимулов в пробирке и на животных моделях ксенотрансплантатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Бейкер фонд и «Женщины в науке» Товарищества Фонда Королевского Детские поддержке Zerina Lokmic. Андрей Г. Elefanty и Эдуард Г. Стэнли NHMRC Старшие научные сотрудники. Работа в лабораториях при поддержке NHMRC и стволовых клеток Австралии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204, (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180, (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7, (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25, (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27, (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127, (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124, (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164, (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17, (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2, (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7, (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7, (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56, (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26, (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32, (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154, (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22, (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194, (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41, (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19, (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124, (6), 625-631 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics