Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

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Summary

El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular.

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Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

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Abstract

Trastornos del sistema linfático, como el linfedema primario, malformaciones linfáticas y los tumores linfáticos son raras condiciones que causan morbilidad significativa pero poco se sabe sobre su biología. Aislamiento de células altamente puros humanos linfáticas endoteliales (LEC) de tejido enfermo y sano facilitaría estudios del endotelio linfático en los niveles genéticos, moleculares y celulares. Se prevé que estas investigaciones pueden revelar objetivos para nuevas terapias que pueden cambiar el manejo clínico de estas condiciones. Se presenta un protocolo que describe el aislamiento de prepucio humano LEC y las células endoteliales linfáticas malformación linfática (LM LECs). Para obtener una única suspensión de células de tejido se picó y se trató enzimáticamente usando dispasa II y colagenasa II. La suspensión de células única resultante se marcó con anticuerpos frente a grupo de diferenciación (CD) marcadores CD34, CD31, Vascular Endotelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) y podoplanin. STAIcélulas viables NED fueron ordenados en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para separar la población CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LM LEC de otras células no endoteliales endotelial y. Los LEC LM según se cultivaron y expandieron en frascos de fibronectina recubierto para uso experimental.

Introduction

Una función importante del sistema linfático vascular es la de absorber la linfa, un fluido intersticial que contiene el exceso de lípidos, proteínas y componentes celulares, y llevar a cabo al sistema venoso de la sangre. Una red de capilares linfáticos dirige la linfa a los ganglios linfáticos en el que se analiza para detectar la presencia de antígenos extraños, un proceso importante en la vigilancia y el despliegue de las células blancas de la sangre para neutralizar antígenos extraños inmunológico.

El sistema linfático unidireccional comienza en los tejidos con el capilar linfático inicial, una estructura única con una sola capa discontinua de células endoteliales planas de pared delgada con uniones de las células especializadas que permiten la entrada de la linfa 1,2. Estos capilares están unidos a la matriz de tejido conectivo vecina a través de anclaje filamentos para evitar el colapso recipiente en presencia de aumento de la presión intersticial 3. Los capilares linfáticos iniciales vacíos en la recogida de los capilares linfáticosque se unen en los vasos linfáticos o venas más grandes. En comparación con sus iniciales en vasos capilares linfáticos, la recogida de vasos linfáticos tienen más gruesas paredes de los vasos linfáticos, válvulas emparejadas y están encerradas por una membrana basal discontinua en la que unas pocas células musculares lisas se incrustan 4. Coordinado apertura y cierre de las válvulas linfáticos y la contracción de las células musculares lisas facilita el flujo de la linfa 3. En los seres humanos, las venas linfáticos de varias regiones del cuerpo se unen para formar troncos linfáticos que se fusionan para formar dos conductos linfáticos: conducto torácico y el conducto linfático derecho. El conducto torácico drena linfa desde el lado izquierdo del cuerpo y desde el lado derecho debajo del pecho mientras que la derecha linfático drena conducto linfático desde el brazo derecho y el lado derecho de la cabeza, el cuello y el tórax. Ambos conductos conducen la linfa en las venas subclavia en el cuello 5.

Trastornos del sistema linfático se agruparse en una adquiridand congénita (Tabla 1). Ejemplos de condiciones adquiridas son linfangitis y linfedema secundario. La linfangitis es una inflamación de un vaso linfático debido a la infección bacteriana. Los linfáticos afectados se dilatan y se llenan de exudado que contiene células polimorfonucleares. En la piel, estos vasos linfáticos son visibles como rayas rojo subcutánea, dolorosa a menudo acompañada por la ampliación del nodo asociado drenaje linfático (linfadenitis) 6. El linfedema secundario surge como consecuencia de daños o obstrucción al recipiente o de los ganglios linfáticos obstrucción linfática. Esto conduce a la inflamación crónica progresiva debido a la acumulación de linfa distal al daño u obstrucción. En los países desarrollados, el linfedema secundario es más comúnmente asociado con la malignidad en tumores metástasis obstruyen los vasos linfáticos o ganglios linfáticos regionales, o como consecuencia de la terapia contra el cáncer después de la extirpación quirúrgica de los ganglios linfáticos, la fibrosis después de la irradiación y Throm post-inflamatoriaBosis y cicatrización 7. En otras partes del mundo, el linfedema secundario puede ser secundaria a obstrucción linfática causada por gusanos parásitos tales como Wuchereria bancrofti 6.

Trastornos del sistema linfático vascular
Adquirido Congénito
La linfadenitis
El linfedema secundario
Primaria linfedema 10 Esporádicos malformaciones linfáticas 13 Linfático malformaciones asociadas con síndromes 13
por ejemplo,
Síndrome de Milroy
Síndrome de Meige
Sencillo:
Malformaciones linfáticas
por ejemplo,
Síndrome de Klippel-Tranaunay
Weber Parques
Síndrome de Sturge-Weber
Combinado:
Malformaciones capilares linfáticos
Malformación capilar-linfático-venosa
Malformación capilar-linfático-arteriovenosa
Malformación venosa-arteriovenosa-capilar linfático

Tabla 1. Descripción general de los trastornos del sistema vascular linfático.

Trastornos congénitos del sistema linfático incluyen el linfedema primaria (idiopática) pensado para ser causada por mutaciones genéticas, linfangiectasia y anomalías del sistema linfático 8,9. El linfedema primario puede ser esporádica, presumiblemente causada por mutaciones de novo o heredada. Trastornos linfáticos también pueden ser aislados o comprender parte de un síndrome más generalizada 10. En la población pediátrica, el 97% de la linfaEl edema es esporádico con anormalidades en la estructura de los vasos linfáticos que deterioran el drenaje linfático regional 11. Enfermedad de Milroy es un ejemplo de linfedema primario causado por una mutación en el gen evidente al nacer o poco después del 12 de VEGFR-3. Aunque la mayoría de condición familiar, la enfermedad de Milroy también se puede identificar en los lactantes sin antecedentes familiares de la enfermedad de Milroy 32. La gravedad de cualquier linfedema es dependiente de la cantidad de producción de linfa y la capacidad de transporte linfático de nuevo a la circulación venosa 6.

Basado en la presentación clínica y en la proliferación de células endoteliales in situ, anomalías del sistema linfático se clasifican como tumores linfáticos o malformaciones linfáticas 13. Kaposiforme linfangiomatosis es un ejemplo de un tumor LEC 14. Malformaciones linfáticas se cree que surgen durante el desarrollo embrionario y crecer en proporción con el niño 15,16. Ellos rara vez regresan, pero pueden REMAIn asintomática hasta un trauma o infección precipitados rápido crecimiento que conduce a complicaciones clínicas. La estructura ordenada de la red linfática y la conducción de la linfa de los tejidos a la circulación venosa descrito anteriormente es perturbado en malformaciones linfáticas que consisten en colecciones localizadas de estructuras quísticas anormales llenos de líquido linfático. Si bien no hay evidencia clínica o experimental que estos vasos quísticas están conectados a la circulación linfática o que contienen válvulas linfáticos funcionales, su identidad linfático se confirma por la expresión de gama de marcadores de células linfáticas, tales como podoplanin, CD31, linfático Embarcación endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) y VEGFR-3 15,17,18. Estas estructuras quísticas pueden ser pequeña (microquística) o grandes (macroquístico), pero la mayoría de las malformaciones linfáticas contener tanto microquística y componentes macroquísticas (Figura 1) 16. Después de la cirugía, injection escleroterapia y / o Ablación por Radiofrecuencia las malformaciones linfáticas menudo reaparecen.

Figura 1
Figura 1. Morfología de los vasos linfáticos humanos y malformaciones linfáticas. Linfático humano normal (A) y los vasos linfáticos malformación (B y C) marcadas con anticuerpo para podoplanin (etiqueta marrón, flecha). Vasos malformación linfática Humanos se caracterizan por la dilatación marcada y una considerable variación en el tamaño del lumen. Estas estructuras quísticas anormales localizadas pueden ser pequeña (microquística, *) (B) o grandes (macroquístico, #) (C). La mayoría de las malformaciones linfáticas contienen componentes microquísticas y macroquísticas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura. </ P>

Algunos investigadores han sugerido que las malformaciones linfáticas representan un trastorno del desarrollo de la vasculatura linfática en el que los LECs no tienen potencial de crecimiento anormal, pero han fracasado en lugar de conectarse a la circulación normal 19. Sin embargo, hemos encontrado que los LECs LM proliferan más rápido y son más resistentes a la apoptosis de prepucio LEC 15 que sugiere que hay un defecto primario en el LM LEC. Cuando LM LEC se implantan en un modelo de xenoinjerto de ratón, forman estructuras que recuerdan a las malformaciones linfáticas 15. Esto apoya la hipótesis de que las malformaciones linfáticas pueden ser causados ​​por una o más mutaciones somáticas que surgen en LM LEC durante el desarrollo fetal. En efecto, informes recientes han identificado uno de tales mutación en la subunidad catalítica p110α de fosfoinositida-3-quinasa (PIK3CA) gene 20.

Teniendo en cuenta los avances en la tecnología de secuenciación de ADN, mutaciones pertinentes could ser identificados más fácilmente en aislados LM LEC, guiando los estudios futuros de estas condiciones. El aislamiento de los LEC viables facilitaría las comparaciones entre los LEC anormales y normales en ensayos tales como la migración, la proliferación, la capacidad de formación de tubo y la supervivencia en respuesta a la disponibilidad de nutrientes reducida o agentes pro-apoptóticos 15. LEC aislados nos permitirían además de realizar la expresión génica de células específicas y estudios proteómicos, para delinear nuevas subpoblaciones LEC y descubrir nuevos agentes farmacológicos adecuados para el manejo clínico de las malformaciones linfáticas.

Hemos publicado previamente un método de aislamiento LEC basada en la separación de cuentas magnéticas de LEC de prepucio neonatal y malformaciones linfáticas 15. Hemos informado una estrategia de separar los LEC normales y enfermos de las células endoteliales vasculares en base a la ausencia de expresión de CD34, seguido de someter la fracción de células CD34 Neg a la selección positiva para CD31.Sin embargo, este método se ve obstaculizada por la presencia de células no endoteliales residuales. Esto era independiente de la eliminación de la epidermis antes de la posterior digestión del tejido conectivo. Estos contaminantes generalmente proliferan más rápidamente y por lo tanto el tiempo overgrew los cultivos de células endoteliales a pesar de los intentos posteriores para repetir el aislamiento LEC. De hecho, una contaminación inicial de células no endoteliales tan bajas como 2% a 5% era suficiente para saturar la población LEC 15. Esto nos llevó a explorar método de clasificación de células con fluorescencia activado como una opción para mejorar el rendimiento de células LEC y pureza. Además, se utilizó multi-parámetro de clasificación para mejorar la especificidad de las poblaciones de LEC, añadiendo VEGFR-3 y podoplanin a los marcadores de selección para identificar CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LEC.

La razón para la selección de estos marcadores se basa en los informes que mientras ce LEC y vascular endotelial sangreLLS tener muchos marcadores de superficie celular en común, tales como CD31, LEC mostrar la variación fenotípica en su expresión de CD34, podoplanin y VEGFR-3 marcador de superficie celular en comparación con las células endoteliales vasculares sanguíneos 21-23. CD31 es una glicoproteína transmembrana de 130 kDa también conocido como plaquetas molécula de adhesión celular endotelial 1 (PECAM-1). Se considera que es un marcador de células pan-endotelial, ya que se expresa en todos los tipos de vasos sanguíneos y linfáticos 21,24,25. CD34 es 110-kDa glicoproteína transmembrana presente en más progenitor hematopoyético y las células, las células endoteliales vasculares y algunos vasos linfáticos 26 del vástago.

VEGFR-3, el receptor para el crecimiento endotelial vascular factores de C y D, está presente inicialmente en las venas en desarrollo en el embrión de ratón, pero siguiente especificación linfático regulado por los factores de transcripción de la HMG-box relacionados con SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor de 2 (COUPTF-II) y PROX-1, VEGFR-3 de expresión venosa se ​​pierde y se restringe a embrionaria LEC 25,27. Podoplanin, una membrana 38 kDa mucoproteína, se observó por primera vez en los vasos linfáticos en aproximadamente embrionarias día 11 (~ E11.0) del desarrollo embrionario del ratón 28 y mientras que se expresa fuertemente por los vasos linfáticos microvasculares, podoplanin expresión por endotelio linfático macroquístico en malformaciones linfáticas es más variable 15. La citometría de flujo experimentos sugieren que al menos algunas células endoteliales CD34 CD31 de alta Pos expresan el marcador linfático podoplanin 29. Aunque la evaluación sistemática de tinción LYVE-1 y podoplanin en malformaciones linfáticas humanos mostró que ambos son eficaces en la tinción del endotelio linfático malformación 30, en tejidos normales, se informó LYVE-1 para ser fuertemente presente en el linfático inicialendotelio capilar pero redujo e incluso ausente en el endotelio linfático recolectar 31. Como nuestro objetivo es aislar tanto las células endoteliales linfáticas iniciales y de recogida que hemos optado por no utilizar LYVE-1 como parte de nuestra estrategia de selección de celda. Finalmente, la decisión de emplear estos marcadores también se basa en la disponibilidad de anticuerpos que se utilizan para el diagnóstico para el etiquetado de los vasos linfáticos para imágenes microscópicas, una característica que permita correlación entre la citometría de flujo y estudios de inmunofluorescencia.

En este artículo se describirá el método de digestión de tejido, tinción de células y la configuración de FACS requerido para el aislamiento con éxito de CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LEC así como las células endoteliales CD34 CD31 de alta Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin de prepucio y malformación linfática tejido.

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Protocol

Declaración de Ética: La aprobación ética para la recogida de tejidos de malformación y prepucio linfáticos se obtuvo de los Comités Éticos de Investigación Humanos del Hospital Royal Children de Melbourne, Australia. Firmado el consentimiento se recibió de los padres de los pacientes antes de la cirugía. Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes con diagnóstico de LM sometidos a procedimientos quirúrgicos como parte de su manejo clínico y los pacientes sometidos a la circuncisión electiva. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica, Australia.

1. Preparación de la suspensión de células de prepucio y Malformación linfática tejidos

  1. Los tampones y Preparación de Medios.
    1. Preparar completa de medios de células endoteliales utilizando comercialmente disponible EGM-2 Kit Bullet MV calentando EGM-2 medios y suavemente descongelar los componentes del kit de 37 ° C baño de agua. En cabina de bioseguridad de clase II, asépticamenteagregar cada componente para los EGM-2 medios de comunicación. Una vez que todos los componentes se añaden a los medios de comunicación, se refieren a este medio de comunicación como "medio completo de las células endoteliales. Utilice estéril pipeta 50 ml para mezclar el contenido antes de su uso.
      NOTA: Todas las etapas relativas a cultivo celular se llevan a cabo en un gabinete de riesgo biológico de clase II. Todas las soluciones se almacenan a 4 ° C según las instrucciones del fabricante y se calientan a la temperatura ambiente antes de su uso. Los medios de comunicación completos de células endoteliales, tampones de cultivo celular y soluciones de enzima se calientan a 37 ° C durante 20 min antes de su uso.
    2. Suplemento completo medios de comunicación de las células endoteliales con 50 ng ml VEGF-C /. Alícuota de los medios de comunicación de las células endoteliales complementado en tubos de 50 ml estériles y se almacena a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación es estable durante al menos 4 semanas cuando se almacena a 4 ° C.
    3. Preparar el calcio y el magnesio libre de buffer fosfato salino (PBS) disolviendo 8,752 g de NaCl, 1,416 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O y0.395 g KH 2 PO 4 en 1000 ml de agua. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar esterilizar PBS utilizando 0,22 micras filtro y se almacena a 4 ° C. Antes de su uso añadir solución de antibiótico / antimicótico (utilizado en 1: 100).
    4. Para preparar la fibronectina humana, disolver 1 mg de fibronectina en 10 ml de agua estéril. Tienda reconstituyó solución en alícuotas de 100 mu l a -20 ° C. En el día de uso agregar 10 ml de PBS estéril para 100 l de alícuota fibronectina (para dar una concentración de trabajo final de 10 mg / ml).
    5. Para los medios de enzimas, preparar una solución que contiene 0,04% dispasa II, 0,25% de colagenasa II y 0,01% de DNasa I en PBS estéril. En primer lugar, pesar dispasa y colagenasa, lugar en un tubo de 50 ml estéril, añadir el volumen requerido de PBS y se incuba durante 30 min con agitación a 37 ° C para disolver. Una vez disuelto, esterilizar filtro (0,22 micras filtro) solución dispasa / colagenasa en campana de bioseguridad. Añadir asépticamente la DNasa I. tienda la solución enzimática a 37 ° C hastausar.
      NOTA: DNasa I es un grado reactivo cultivo celular comercial disponible como polvo liofilizado estéril.

2. Preparación de la suspensión de células de prepucio y del sistema linfático Malformaciones

  1. Pesar un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de DMEM / 2% de solución antimicótica antibiótica. Este tubo será utilizado para la recogida de tejidos.
  2. Después de la eliminación quirúrgica de malformación linfática y tejidos de prepucio, añadir asépticamente muestra de tejido al tubo y la transferencia en hielo al laboratorio de cultivo celular.
  3. Pesar el tubo que contiene el tejido y calcular el peso del tejido. Utilice este peso para calcular el volumen de solución enzimática necesaria para digerir el tejido.
  4. En un gabinete de bioseguridad Clase II, utilice pinzas estériles para transferir el tejido y los medios de comunicación en una placa de 100 mm de cultivo de tejidos. Con unas tijeras estériles para picar finamente el tejido en ~ 1 mm 3 piezas.
  5. Transferencia de tejido picado mezclado con i mediosnto un tubo de 50 ml que contiene un adicional de 10 ml de 2% de solución antimicótica estéril DMEM / antibiótico. Mezclar por inversión para volver a suspender el tejido. Centrifugar la muestra a 300 xg durante 5 min.
  6. Eliminar el sobrenadante. Basado en el peso de tejido, añadir 1 ml de pre-calentado (37 ° C) de colagenasa II solución de digestión / DNasa I / dispasa II por 100 mg de tejido picado. Generalmente, utilizar 10 ml de solución de enzima durante aproximadamente 1 g de tejido picado.
  7. Incubar el tejido en un 37 ° C incubadora durante 20-90 min con agitación constante a 200 rpm. Al final de este período, asegúrese de que casi todo el tejido se digiere en fragmentos finos.
    NOTA: La exposición de las células a la colagenasa y dispasa en el momento de aislamiento de los tejidos influencias primaria supervivencia celular. Hemos encontrado empíricamente que la mayoría de las muestras de prepucio neonatal óptima requieren 20 a 30 min de la digestión, mientras que las muestras de malformaciones linfáticas fibróticas pueden requerir 60-90 minutos de la digestión. Rendimiento LEC LMs están influenciados por la cantidad de fibrosis presente, más tejido fibroso dando menos células, posiblemente debido a los efectos nocivos de la exposición prolongada a la colagenasa II y dispasa II.
  8. Después de la digestión, transferir el tubo a la cabina de bioseguridad y pasar la solución tejido digerido a través de un filtro de 70 micras colocado en un tubo de 50 ml estéril. El uso de 3 ml émbolo de la jeringa con el émbolo de goma, moler abajo el tejido restante hasta que se observaron sólo pequeñas trazas de la matriz extracelular.
  9. Lavar el filtro de células con un volumen equivalente de medio de células endoteliales con el volumen de disociar medio enzima para recuperar las células pegadas a tamiz y para inactivar las enzimas. Por ejemplo, para 2 ml de medio de disociación de la enzima para digerir el tejido picado, añadir 2 ml de medio de células endoteliales para inactivar las enzimas.
  10. Centrifugar la solución de células a 300 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. R> e-suspender las células en 10 ml de PBS. Centrifugar las células a 300 xgdurante 5 minutos, retirar el sobrenadante después repita lavado de células dos veces. > Resuspender el sedimento celular en 20 ml de medio de células endoteliales. Contar las células usando azul de tripano después de semilla de 2 x 10> 6 células en 150 cm> 2 matraz de pre-recubiertas con fibronectina en un volumen final de 20 ml de medio de células endoteliales. Cultura a 37 ° C en un 5% de CO> 2 en incubadora de aire humidificado.>
    NOTA: Se espera que el 75% -90% de las células nucleadas sobrevivir la digestión del tejido estimada por exclusión de azul tripán. El recuento de células inicial refleja células nucleadas todo en la suspensión celular (es decir, queratinocitos, leucocitos, macrófagos, células del tejido conectivo y células de los vasos sanguíneos). El recuento de células en 5-7 días refleja células que se han adherido, sobrevivido y proliferado durante el cultivo celular. Recubrimiento frascos de cultivo de tejidos con fibronectina también mejora posterior LEC y la supervivencia LM LEC.
  11. Después de la incubación durante la noche, lavar las células de distancia no unidos en tres lavados con PBS solución antibiótico-antimicótico / 1% y añadir medio fresco de células endoteliales. Llevar a cabo tres lavados para eliminar eficazmente las células no unidas y células rojas de la sangre presentes en el matraz. Cambie medios cada dos días. Las células serán ~ 80% confluentes después de 5-7 días.

3. Anticuerpo La tinción de células endoteliales para Linfático marcadores de superficie celular para Citometría de Flujo

  1. Después de que las células han alcanzado el 80% de confluencia, el medio aspirado y las células de enjuague con PBS.
  2. Separar las células adherentes mediante la incubación de las células con 7 ml de solución de desprendimiento celular tal como Accutase por 150 cm 2 matraz durante 5-7 min a 37 ° C.
  3. Células de la cosecha individual, inactivar la solución de desprendimiento de las células mediante la adición de 3 volúmenes de medio de células endoteliales y transferir la suspensión celular a un nuevo tubo estéril.
  4. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min.
  5. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 5 ml de PBS. Células centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, retire el supernatant luego repetir lavado celular. Volver a suspender las células en 5 ml de PBS.
  6. Contar el número de células viables. Mezclar 10 l de suspensión celular con 90 l de 0,4% de azul de tripano. Transferencia de 10 l de esta suspensión a hemocitómetro para recuento.
    NOTA: El rendimiento celular final dependerá del tamaño de la muestra procesada. El rendimiento celular usual por rangos de 150 cm 2 matraz de 7 x 10 5 a 1,2 x 10 6 de células viables.
  7. Preparar las soluciones de anticuerpos para tinción celular.
    NOTA: Las siguientes diluciones se titularon para la tinción de 1 x 10 6 en un volumen de tinción de 100 l.
    1. Diluir PE ratón conjugado anti humana VEGFR-3 (1:50); Ratón conjugado anti CD34 PE-Cy7 humana conjugado (1: 200); Ratón CD31 APC-conjugado anti humana (1: 100) y Alexa 488 rata conjugado anti-humano podoplanin (1: 200) en el volumen total de 100 l estéril 5% de FBS / solución de PBS por muestra de tejido. Después de la preparación desolución de anticuerpos, mantener en hielo hasta su uso. Del mismo modo preparar mezcla de anticuerpos de control de isotipo diluido para facilitar la configuración de la citometría de flujo puertas.
  8. Para reducir la unión no específica de los anticuerpos, las células de centrifugación a 300 xg durante 2 minutos, retire sobrenadante entonces suspender las células en 100 l estéril 5% de SFB / solución de PBS por muestra para ser manchado. Se incuban las células en hielo durante 20 min a 4 ° C.
  9. Células centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, retire sobrenadante entonces las células en el cóctel de anticuerpos conjugados volver a suspender. También manchar una alícuota pequeña de las células (1 x 10 5) en 100 l mezcla de anticuerpo de control de isotipo. Se incuban las células en hielo durante 20 min.
  10. Para eliminar el anticuerpo no unido, añadir 2 ml de solución de 2% de FBS / PBS y centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado.
  11. Resuspender el sedimento celular para el control de isotipo y la muestra de anticuerpo manchado sean ordenados de 300 l de 0,5 mg / ml de propidio iodide / solución de FBS / PBS 2%. Colocar tubos en hielo hasta la clasificación.

4. Cell Sorting

  1. Utilice los materiales siguientes para configurar el instrumento; perlas de alineación tales como partículas fluorescentes disponibles comercialmente, solución salina basado fluido de funda tamponada con fosfato y el retardo de caída de perlas, tales como perlas fluorescentes Accudrop.
  2. Aislar los LEC humanos purificados en un instrumento de clasificación de células activadas por fluorescencia de múltiples parámetros. Coloque el instrumento y alinear según las recomendaciones del fabricante. Además, ejecutar los controles de compensación mancha individuales con cada especie para generar la matriz de compensación y de purga para eliminar de este modo sustancial a través de la emisión de los fluorocromos tales como PE en el canal de PE-Cy.
    NOTA: Una mayor proporción de los FACS células clasificadas sobrevivir al aislamiento si una boquilla de 100 micras se utiliza y las células están ordenadas en el medio de las células endoteliales.

5. Cultivo Celular Publicar FACS Ordenaring

  1. Después de clasificación, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5-10 ml de medio (dependiendo del matraz utilizado para sembrar la célula). Si están ordenadas de menos de 50.000 células, las células se cultivan en recubiertos de fibronectina 25 cm 2 matraz.
  2. De lo contrario, cultivar las células en 75 cm 2 frasco de fibronectina recubierto a 37 ° C en un 5% de CO 2, aire humidificado incubadora. Cambie los medios después de 2 días.
    NOTA: los medios de comunicación de la célula se cambia cada segundo día porque prolongar el tiempo entre los cambios de los medios de comunicación parece favorecer la supervivencia de las células no endoteliales. Validamos el fenotipo de la célula endotelial linfática usando la detección inmunohistoquímica de marcadores: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 y CD31 cuando las células son primero dividida para una mayor expansión 15.

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Representative Results

Después de la digestión inicial del tejido, después de 24 horas en cultivo de muestras no fraccionadas, las colonias de células endoteliales se pueden observar distintas (Figura 2A) junto con células similares a fibroblastos y células musculares lisas. Después de la clasificación y después de 24 horas en cultivo celular, las células CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 células Pos Pos Podoplanin adjuntar y mostrar la morfología de adoquín típica (Figura 2B y C). Utilizando el método FACS descrito anteriormente, somos capaces de purificar las células hasta el 99,8% de pureza y distinguirlos de CD34 CD31 de alta Pos VEGFR-3 células endoteliales Pos Podoplanin Pos. Los resultados representativos de gating estrategia y la clasificación se presentan en la Figura 3. Esto ha resuelto los problemas experimentados al utilizar método de aislamiento magnético-perla. Hasta la fecha, hemos pases estas células hasta el paso 13. Después de este pasaje, el LM LEC y el prepucio LECs comienzan a senescencia, acompañado por cambios morfológicos y la reducción de la división celular.

Figura 2
Figura 2. Prepucio LEC y LM-LEC. Veinticuatro horas después de la digestión enzimática, las células endoteliales sin clasificar que contienen tanto (flecha) y células no endoteliales (A). Tras el aislamiento de células CD34 Baja CD31 Pos VEGFR-3 Pos Pos Podoplanin FACS, prepucio LEC (B) y LM-LEC (C) están desprovistos de células no endoteliales y mantener la morfología de adoquines. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura .

Figura 3
Figura 3. celular activada por fluorescencia estrategias de activación periódica para la clasificación de células de células endoteliales vascular y linfáticos. (A) Las células vivas son una verja primero en CD34 y CD31 expresión, seguidas por las células del endotelio linfático (C) VEGFR-3 y podoplanin compuerta de tipo vascular (B) y, respectivamente. (D) Re-análisis de alta ordenados CD34 CD31 Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin células espectáculos> 98% vascular fenotipo de las células endoteliales. células LEC (E) ordenados en CD34 Baja CD31 Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin fenotipo también son> 98% de pureza. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

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Discussion

LEC juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de fluidos, la respuesta inmune a los antígenos extraños y la absorción y el transporte de algunos nutrientes. Homeostasis LEC puede verse afectada por los procesos de enfermedad, tales como infecciones bacterianas y la metástasis del tumor, pero los LEC también se puede desarrollar mutaciones somáticas que resultan en la formación de vasos linfáticos disfuncionales y morbilidad significativa para los pacientes afectados. Para obtener una mayor comprensión de la etiología malformación linfática a través de la implantación in vivo y ex vivo experimentación, y descubrir nuevas opciones de tratamiento, primero desarrollamos un método de aislamiento LEC basado en estrategia de selección de perlas magnéticas usando estrategia de selección de CD34 CD31 Neg Pos 15. Sin embargo, los cultivos resultantes a menudo contenían células distintas de las células endoteliales que eran difíciles de eliminar. Posteriormente, el método se perfeccionó mediante FACS para ordenar los LEC que expresan CD34 Baja CD31 Pos VEGR3 Pos fenotipo podoplanin Pos. Este enfoque resultó en culturas LEC relativamente homogéneos que contienen <0,5% de las células no-CD34 Baja CD31 Pos VEGR3 Pos Pos podoplanin en el check-post clasificación. En términos prácticos, la ventaja de clasificación de células por FACS es que la reducción de la no presencia LEC a <0,5%. LEC cultivadas y LM LEC tienen una morfología típica de adoquines y se vuelven senescentes alrededor paso 13.

En este estudio hemos descrito un protocolo basado en citometría de flujo para el aislamiento y cultivo de los LEC altamente enriquecido a partir de tejidos normales y anormales basándose en su expresión de un conjunto de marcadores de superficie celular (CD34 CD31 Low Pos Pos VEGR3 podoplanin Pos). Las células fueron ordenadas por tejidos primarios siguiente 5-7 días de expansión in vitro, un paso que dio como resultado el enriquecimiento sustancial de LEC en comparación con su frecuencia en los tejidos en el momento de aislamiento. Durante surgery obtenemos tejidos que van desde varios microgramos a decenas de gramos de peso. Este tejido puede variar mucho en su composición con respecto al volumen de los vasos linfáticos malformación presentes, la cicatrización del tejido y la presencia de trombos quiste linfático malformación. Todos estos componentes influirán en la cantidad de células puede ser aislado de tejido enfermo. Por lo tanto el número de células de partida puede variar desde unos pocos miles de células a varios millones de células. Del mismo modo, esto influirá en la composición de la suspensión de células de partida y el número de células lo que significa que el número de células clasificadas también diferirá de una muestra a otra.

La frecuencia de los LEC en muestras de prepucio sin clasificar siguiente 5-7 días en cultivo varía de 0,52% a 4,7%, mientras que LM LEC van desde 0,8% a 12,43%. Las culturas LEC compuestas> 99% CD34 Baja CD31 Pos VEGR3 Pos Pos podoplanin células después de post-clasificación de re-análisis y mantenido una cobbleston típicae morfología en la cultura hasta la senescencia en el paso ~ 13 sin sobrecrecimiento por elementos no endoteliales.

Es necesario para expandir células ex vivo después de la digestión inicial del tejido y la clasificación porque el rendimiento de cualquiera de las células de prepucio malformación o linfáticos es generalmente baja. Por lo tanto, antes de la expansión de las células endoteliales linfáticas i n vitro permite la generación de los 2x10 6 células ~ necesarios para sembrar una cámara de ratón. Esto requiere una etapa de expansión in vitro de 5-7 días. Aunque se acepta que el cultivo de células puede inducir cambios fenotípicos en las células primarias, hemos demostrado que estas células cultivadas conservan su capacidad para formar estructuras-malformación como linfáticos en un modelo de xenoinjerto de ratón 15.

Hay varios pasos críticos en el protocolo que determinan el grado de éxito al clasificar las células por FACS. El paso más crítico es el tiempo de exposición de las células a la colagenasay dispasa durante el aislamiento de los tejidos primarios como se describe en el paso 2.7. Esto no sólo está influenciada por la cantidad y tipo de tejido presente, sino también por el lote de enzimas utilizadas. Además, los anticuerpos marcados con fluorescencia utilizados para caracterizar las poblaciones de células necesitan ser valorada y preferiblemente monoclonal. Hemos probado varias soluciones desprendimiento de células diferentes, tales como la tripsina / EDTA, EDTA, TrypLE Seleccione y solución de desprendimiento celular. Hemos encontrado que el EDTA tuvo que ser utilizado durante un período prolongado de tiempo para separar las células y grupos de células residual a menudo permanecido. En contraste, suspensiones de células individuales se generaron dentro de 3-5 minutos de incubación en tripsina / EDTA, solución desprendimiento celular y TrypLE Select. No encontramos ninguna diferencia sustancial en la expresión de CD31, CD34, Podoplanin y VEGFR-3 después del tratamiento con cualquiera de las soluciones enzimáticas. Muestras individuales de color también se debe hacer con todos los experimentos de clasificación para asegurarse de que los espectros de emisión fluorocromo no se superponen ypor lo tanto, dar lecturas incorrectas. Estos pasos críticos también constituyen pasos donde pueden ser necesarios o localización de fallos modificaciones en el protocolo de la célula durante la citometría de flujo clasificación.

Cuando se compara con nuestra publicado previamente aislamiento perla magnética de LEC 15, la ventaja de aislar los LEC por FACS incluye lo siguiente: más rápido aislamiento de células con alta pureza y la identificación de subgrupos de células discretas y poblaciones raras dentro de una muestra heterogénea. Las principales limitaciones de la LEC basado en FACS y aislamiento LM LEC gira en torno a número de células disponibles para la validación siguientes celular clasificación resultados limitados. Además, si bien cada intento se hace para estandarizar nuestros ensayos y configuración del instrumento, estos mismos parámetros pueden no necesariamente ser reproducible en otros laboratorios. Por lo tanto, se puede producir cierta variabilidad en los resultados. Además, una de las cuestiones que los biólogos linfáticos cara es la ausencia de marcadores específicos de célulashabría que diferenciar entre los marcadores LEC capilar iniciales y la recogida de marcadores LEC capilares. En esta etapa, todavía no hemos identificado marcadores LEC que distinguirían entre LEC saludables y LM LEC. Dado que el tejido linfático malformación contiene también normal mirando vasos linfáticos (Figura 1A), la resultante CD34 CD31 Low Pos VEGR3 Pos Pos podoplanin contendrá una proporción de LEC normales, así como las del fenotipo enfermo. Los estudios futuros examinar LEC y de expresión génica LM LEC y la proteómica pueden ser capaces de dirigirnos hacia marcadores LEC LM más específicas que podrían distinguir LM LEC de LEC en el mismo tejido.

En el futuro, esperamos utilizar FACS y estos nuevos marcadores LEC en el intento de identificar subconjuntos raras de poblaciones LEC, tanto en prepucio y malformaciones linfáticas. Esto nos permitiría aislar estas poblaciones de células y estudiar su papel en el desarrollo de la lympsistema vascular hatic y malformaciones linfáticas.

LEC aislar y LM LEC basado en CD34 Baja CD31 Pos VEGR3 Pos Pos podoplanin redujo significativamente la contaminación de células no endoteliales. Además, la tecnología FACS nos permite separar los LEC en subtipos basados ​​en la expresión de CD31, podoplanin y VEGFR-3 marcadores de superficie celular y que entendamos esto en el contexto del desarrollo linaje celular. Para LEC enfermas, esto permite que los estudios específicos de células que arrojar más luz sobre los genes que causan enfermedades LEC y la capacidad LEC para responder a diversos estímulos celulares in vitro y en modelos de xenoinjerto animal.

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Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la Fundación Baker y 'Mujeres en la Ciencia de becas "Fundación de la Real Niños apoyo de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty y Edouard G. Stanley son NHMRC mayores becarios de investigación. El trabajo en sus laboratorios fue apoyado por NHMRC y Células Madre Australia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

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