Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

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Summary

O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.

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Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

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Abstract

Do sistema linfático, como linfedema primário, malformações linfáticas e tumores linfáticos são condições raras que causam morbidade significativa, mas pouco se sabe sobre a sua biologia. Isolamento de células altamente puros humanas endoteliais linfáticas (LECs) a partir de tecido doente e saudável iria facilitar estudos sobre o endotélio linfático em níveis genéticos, moleculares e celulares. Prevê-se que estas investigações podem revelar alvos para novas terapias que podem mudar o manejo clínico dessas condições. Um protocolo descrevendo o isolamento de prepúcio humano LECs e células endoteliais linfáticas malformação linfática LM (LECs) é apresentada. Para obter uma única suspensão de células do tecido foi triturada e tratada enzimaticamente usando colagenase e dispase II II. A suspensão de célula única resultante foi, em seguida, marcadas com anticorpos para o aglomerado de diferenciação (CD) marcadores CD34, CD31, Factor de Crescimento Endotelial Vascular-3 (VEGFR-3) e podoplanin. Staicélulas viáveis ​​nidas foram classificados em um separador de células activado por fluorescência (FACS) para separar o CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 população Pos Pos podoplanin LM LEC de outro endoteliais e células não endoteliais. Os LM LECs ordenados foram cultivadas e expandidas em frascos revestidos com fibronectina para uso mais experimental.

Introduction

Uma das principais funções do sistema vascular linfático é absorver linfa, um excesso de fluido intersticial que contém lipídeos, proteínas e componentes celulares, e conduzi-la para o sistema venoso do sangue. Uma rede de capilares linfáticos dirige linfa para os nódulos linfáticos onde é rastreada quanto à presença de antigenes estranhos, um processo importante na vigilância e implantação de células brancas do sangue para neutralizar os antigénios estranhos imune.

O sistema linfático unidireccional começa em tecidos com o capilar linfático inicial, uma estrutura única, com uma única camada descontínua de células endoteliais planas de parede fina com junções de células especializadas que permitem a entrada de linfa 1,2. Estes capilares estão ligados à matriz do tecido conjuntivo vizinho através filamentos de ancoragem para prevenir o colapso navio em presença de um aumento da pressão intersticial 3. Os capilares linfáticos iniciais vazios para recolha de capilares linfáticosque se aglutinam em vasos linfáticos maiores ou veias. Em comparação com o inicial vasos capilares linfáticos, recolha de vasos linfáticos têm paredes mais espessas, válvulas dos vasos linfáticos e emparelhados são revestidos por uma membrana basal descontínua em que algumas células de músculo liso são incorporados 4. Coordenada abertura e fecho de válvulas linfáticos e contracção de células musculares lisas facilita o fluxo de linfa 3. Nos seres humanos, os vasos linfáticos de várias regiões do corpo se juntam para formar troncos linfáticos que se fundem para formar dois canais linfáticos: o ducto torácico e ducto linfático direito. O ducto torácico drena a linfa do lado esquerdo do corpo e do lado direito abaixo do peito, enquanto o duto linfático drena a linfa desde o braço direito e no lado direito da cabeça, pescoço e tórax. Ambas as condutas conduzir linfa nas veias subclávia no pescoço 5.

Desordens do sistema linfático são agrupadas em uma adquiridaND congénita (Tabela 1). Exemplos de condições adquiridas são linfangite e linfedema secundário. Linfangite é uma inflamação de um vaso linfático devido a uma infecção bacteriana. Os vasos linfáticos afetados dilatar e encher com exsudado contendo células polimorfonucleares. Na pele, estes vasos linfáticos são visíveis como faixas vermelha subcutânea, dolorosa muitas vezes acompanhada por alargamento do nó de linfa de drenagem associada (linfadenite) 6. Linfedema secundário surge como consequência de danos ou obstrução do vaso ou linfonodo obstrução linfática. Isto leva ao inchaço crônica progressiva devido ao acúmulo de linfa distal ao dano ou obstrução. Nos países desenvolvidos, linfedema secundário é mais comumente associado com a malignidade onde tumores metastasizing obstruir vasos linfáticos ou linfonodos regionais, ou como consequência da terapia anti-câncer após a remoção cirúrgica dos gânglios linfáticos, fibrose pós-irradiação e Throm pós-inflamatóriaBosis e cicatrizes 7. Em outras partes do mundo, linfedema secundário pode ser secundária à obstrução linfática causada por vermes parasitas, tais como Wuchereria bancrofti 6.

Distúrbios do sistema vascular linfático
Adquirido Congênito
Linfadenite
Linfedema secundário
Linfedema Primário 10 Esporádicos linfáticos Malformações 13 Linfático malformações associadas a síndromes 13
por exemplo,
Síndrome de Milroy
Síndrome de Meige
Simples:
As malformações linfáticas
por exemplo,
Síndrome de Klippel-Tranaunay
Weber Parques
Síndrome de Sturge-Weber
Combinado:
Malformações capilares linfático-
Malformação capilar-linfático-venosa
Malformação capilar-linfático-artério
Capilar-linfático malformação arteriovenosa venosa-

Tabela 1. Visão geral das desordens do sistema vascular linfático.

Doenças congênitas do sistema linfático incluem primária (idiopática) linfedema pensado para ser causado por mutações genéticas, lymphangiectasia e anomalias do sistema linfático 8,9. Linfedema primário pode ser esporádica, presumivelmente causada por mutações de novo, ou herdado. Desordens linfáticas também pode ser isolado ou compreendem parte de uma síndrome mais generalizada 10. Na população pediátrica, 97% da linfaedema é esporádica com anormalidades na estrutura de vasos linfáticos que prejudicam a drenagem linfática regional de 11. Doença de Milroy é um exemplo de linfedema primário causada por uma mutação no gene do VEGFR-3 no momento do nascimento ou evidentes logo após 12. Embora na maior parte condição familiar, doença de Milroy, também podem ser identificados em lactentes sem história familiar de doença de Milroy 32. A gravidade de qualquer linfedema é dependente da quantidade de produção de linfa e capacidade de transporte da linfa de volta para a circulação venosa 6.

Com base na apresentação clínica e na proliferação de células endoteliais situ, anomalias do sistema linfático são classificados como tumores linfáticos ou malformações linfáticas 13. Kaposiforme linfoangiomatose é um exemplo de um tumor LEC 14. As malformações linfáticas são pensados ​​para surgem durante o desenvolvimento embrionário e crescer em proporção à criança 15,16. Eles raramente regridem, mas pode remain assintomática até trauma ou infecção precipita crescimento rápido levando a complicações clínicas. A estrutura ordenada da rede linfática e condução da linfa do tecido a circulação venosa descrito acima é perturbado em malformações linfáticas que consistem em coleções localizadas de estruturas císticas anormais cheias de líquido linfático. Embora não haja evidência clínica ou experimental que estes vasos císticas são ligados à circulação linfática ou que eles contêm válvulas linfáticos funcionais, a sua identidade linfático é confirmada por expressão de gama de marcadores de células linfáticas, como podoplanin, CD31, linfática Veículo Endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) e VEGFR-3 15,17,18. Estas estruturas císticos pode ser pequena (microcístico) ou grande (macrocísticos), mas a maioria das malformações linfáticas conter tanto microcístico e macrocísticas componentes (Figura 1) 16. Após a cirurgia, injection escleroterapia e / ou ablação por radiofreqüência as malformações linfáticas muitas vezes reaparecer.

Figura 1
Figura 1. Morfologia dos vasos linfáticos humanos e malformações linfáticas. Linfático humano normal (A) e vasos linfáticos malformação (B e C) marcados com o anticorpo para podoplanin (etiqueta castanho, seta). Vasos linfáticos humanos malformação são caracterizadas por acentuada dilatação e uma considerável variação no tamanho do lúmen. Estas estruturas anormais císticas localizadas pode ser pequena (microcístico, *) (B) ou grande (macrocísticos, #) (C). A maioria das malformações linfáticas conter ambos os componentes microcísticas e macrocísticas. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura. </ P>

Alguns pesquisadores sugeriram que as malformações linfáticas representam um transtorno do desenvolvimento da vasculatura linfática em que os LECs não tem potencial de crescimento anormal, mas em vez disso não conseguiram se conectar à circulação normal 19. No entanto, verificou-se que os LECs LM proliferar mais rapidamente e são mais resistentes à apoptose de prepúcio LECs 15 sugerindo que existe um defeito primário na LM LECs. Quando LM LECs são implantadas em um rato modelo de xenotransplante, eles formam estruturas que lembram malformações linfáticas 15. Isto suporta a hipótese de que as malformações linfáticas pode ser causada por uma ou mais mutações somáticas que surgem no LM LECs durante o desenvolvimento fetal. De facto, relatórios recentes identificaram uma tal mutação na subunidade catalítica de p110α (PIK3CA) gene 20-Quinase Phosphoinositide-3.

Tendo em conta os avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, mutações relevantes cOuld ser mais facilmente identificadas em isolados LM LECs, orientando futuros estudos sobre essas condições. O isolamento de LECs viáveis ​​seria facilitar as comparações entre LECs anormais e normais em ensaios, tais como a migração, proliferação, capacidade tubo de formação e sobrevivência em resposta à reduzida disponibilidade de nutrientes ou agentes pró-apoptóticos 15. Isolado LECs iria mais permitir-nos de realizar a expressão de genes específicos de células e estudos de proteômica, para delinear novas subpopulações LEC e descobrir novos agentes farmacológicos adequados para o manejo clínico de malformações linfáticas.

Nós já publicou um método de isolamento LEC com base na separação magnética talão de LECs de prepúcio neonatal e malformações linfáticas 15. Nós relatou uma estratégia de separar LECs normais e doentes a partir de células endoteliais vasculares com base na ausência de expressão CD34, seguida por sujeição fração de células CD34 Neg a selecção positiva para CD31.No entanto, este método foi prejudicado pela presença de células não endoteliais residuais. Isto foi independente da epiderme remoção antes da digestão posterior do tecido conjuntivo. Estes contaminantes geralmente proliferam mais rapidamente e, assim, eventualmente overgrew as culturas de células endoteliais, apesar das tentativas posteriores de repetir LEC isolamento. Com efeito, uma inicial de contaminação de células não endoteliais tão baixas como 2% a 5% era suficiente para submergir a população LEC 15. Isto levou-nos a explorar método separação de células activadas por fluorescência como uma opção para melhorar o rendimento das células LEC e pureza. Além disso, utilizou-se vários parâmetros de classificação para aumentar a especificidade das populações LEC, a adição de VEGFR-3 e podoplanin para os marcadores de selecção para identificar CD34 CD31 de baixo Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LECs.

A justificativa para selecionar esses marcadores baseou-se nos relatórios que enquanto ce LECs e vascular endotelial sangueLLS tem muitos marcadores da superfície celular em comum, tais como CD31, LECs mostrar variação fenotípica em sua expressão de CD34, podoplanin e VEGFR-3 marcador da superfície celular quando comparado ao sangue células endoteliais vasculares 21-23. CD31 é uma glicoproteína transmembranar de 130 kDa, também conhecido como molécula de adesão de plaquetas de células endoteliais 1 (PECAM-1). Ele é considerado como um marcador celular pan-endotelial, uma vez que é expresso em todos os tipos de vasos sanguíneos e linfáticos 21,24,25. CD34 é 110 kDa transmembranar da glicoproteína presente em células progenitoras hematopoiéticas e mais células estaminais, células endoteliais vasculares e alguns vasos linfáticos 26.

VEGFR-3, o receptor para os factores de crescimento vascular endotelial C e D, é inicialmente presente nas veias do embrião de rato em desenvolvimento, mas seguinte especificação linfático regulada por factores de transcrição HMG-box relacionada-SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor 2 (COUPTF-II) e PROX-1, VEGFR-3 expressão venosa está perdido e torna-se restrita a embrionária LECs 25,27. Podoplanin, uma membrana de 38 kDa mucoproteína, é observado pela primeira vez em vasos linfáticos em cerca de 11 dias embrionários (~) de rato E11.0 desenvolvimento embrionário 28 e enquanto ele é fortemente expresso por vasos linfáticos microvasculares, podoplanina por endotélio linfático macrocístico em malformações linfáticas é mais variável 15. A citometria de fluxo experiências sugerem que pelo menos algumas células endoteliais CD34 CD31 alta Pos expressar o marcador linfático podoplanin 29. Embora a avaliação sistemática de coloração LYVE-1 e podoplanin em malformações linfáticos humanos mostrou que ambos são eficazes na coloração malformação endotélio linfático 30, em tecidos normais, LYVE-1 foi relatada como sendo fortemente presente na linfático inicialendotélio capilar, mas reduzida e até mesmo ausente no endotélio linfático coleta 31. Como nosso objetivo é isolar tanto as células endoteliais linfáticas iniciais e de coleta, optaram por não usar LYVE-1 como parte de nossa estratégia de seleção de célula. Finalmente, a decisão de utilizar estes marcadores também baseou-se na disponibilidade de anticorpos que são utilizados diagnosticamente para a marcação de vasos linfáticos para imagem microscópica, uma característica que permita correlação entre estudos de citometria de fluxo e imunof luorescência.

Este artigo irá descrever o método de digestão de tecidos, coloração de células e configurações FACS necessário para isolamento de células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 POS podoplanin Pos LECs, bem como as células endoteliais CD34 CD31 alta Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin do prepúcio e malformação linfática tecido.

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Protocol

Declaração de Ética: A aprovação ética para a recolha de tecidos e malformação prepúcio linfáticos foi obtido a partir de Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital do Royal Children, Melbourne, Austrália. Consentimento assinado foi recebido de pais dos pacientes antes da cirurgia. As amostras de tecidos foram coletadas de pacientes com diagnóstico de LMs submetidos a procedimentos cirúrgicos, como parte de sua gestão clínica e os pacientes submetidos a circuncisão eletivo. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho de Investigação Médica Nacional de Saúde e, na Austrália.

1. Preparação de suspensão de células de prepúcio e malformação linfática Tecidos

  1. Buffers e Preparação de Mídia.
    1. Prepare a mídia de células endoteliais completo utilizando comercialmente disponível EGM-2 MV Kit bala pelo aquecimento EGM-2 media e gentilmente descongelar os componentes do kit em 37 ° C banho de água. Na classe II gabinete de biossegurança, de forma assépticaadicionar cada componente para os EGM-2 media. Uma vez que todos os componentes são adicionados aos meios de comunicação, consulte esta mídia como 'media de células endoteliais completo'. Use estéril 50 ml de pipeta para misturar o conteúdo antes da utilização.
      NOTA: Todas as etapas referentes à cultura de células são realizadas em um armário de risco biológico classe II. Todas as soluções são armazenadas a 4 ° C de acordo com as instruções dos fabricantes e são aquecidos à temperatura ambiente antes de usar. Os meios completos de células endoteliais, tampões de cultura de células e soluções enzimáticas são aquecidos a 37 ° C durante 20 min antes da utilização.
    2. Suplemento de meio completo de células endoteliais com 50 ng ml de VEGF-C /. Alíquota o meio celular endotelial suplementado em tubos de 50 ml estéreis e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Os meios de comunicação é estável durante pelo menos 4 semanas, quando armazenado a 4 ° C.
    3. Prepare de cálcio e magnésio livre salina tamponada com fosfato (PBS) por dissolução de 8,752 g de NaCl, 1,416 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O e0,395 g de KH 2 PO 4, em 1000 ml de água. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar esterilizar PBS utilizando filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. Antes da utilização adicionar solução de antibiótico / antimicótico (utilizada a 1: 100).
    4. Para preparar a fibronectina humana, dissolver 1 mg de fibronectina em 10 ml de água estéril. Loja solução em alíquotas de 100 uL a -20 ° reconstituído C. No dia da utilização, adicionar 10 ml de PBS estéril para 100 ul de fibronectina alíquota (para dar uma concentração de trabalho final de 10 ug / mL).
    5. Para os meios de enzimas, preparar uma solução contendo 0,04% de Dispase II, 0,25% de colagenase II e 0,01% de DNase I em PBS estéril. Em primeiro lugar, pesam dispase e colagenase, lugar num tubo estéril de 50 ml, adicionar o volume necessário de PBS e incubar durante 30 minutos com agitação a 37 ° C para dissolver. Uma vez dissolvido, Esterilizar por filtração (filtro de 0,22 nm) de solução de dispase / colagenase na capa biosegurança. Adicionar assepticamente a ADNase I. loja a solução enzimática a 37 ° C atéusar.
      NOTA: ADNase I é um reagente de qualidade de cultura de células comercialmente disponível como pó liofilizado estéril.

2. Preparação de suspensão de células de prepúcio e Linfáticas Malformações

  1. Pesar um tubo de 50 ml contendo 10 ml de DMEM / 2% de solução de antibiótico antimicótico. Este tubo irá ser utilizado para a recolha de tecido.
  2. A seguir à remoção cirúrgica da malformação linfático e tecidos de prepúcio, assepticamente adicionar amostra de tecido para o tubo em gelo e transferência para o laboratório de cultura de células.
  3. Pesa-se o tubo contendo o tecido e calcular o peso do tecido. Use este peso para calcular o volume de solução enzimática necessária para digerir o tecido.
  4. Em uma cabine de segurança biológica Classe II, use uma pinça estéril para transferir o tecido e mídia em um 100 milímetros prato de cultura de tecidos. Use uma tesoura esterilizada para picar finamente o tecido em ~ 1 mm3 peças.
  5. Transferência de tecido picada misturada com i medianpara um tubo de 50 ml contendo um adicional de 10 ml de 2% de solução estéril antimicótico DMEM / antibiótico. Misture por inversão para voltar a suspender o tecido. Centrifugar a amostra a 300 xg durante 5 min.
  6. Remover o sobrenadante. Com base no peso do tecido, adicionar 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) a colagenase II / solução de digestão com DNase I / Dispase II por 100 mg de tecido moído. Geralmente, utilizar 10 ml da solução de enzima para cerca de 1 g de tecido moído.
  7. Incubar o tecido num banho a 37 ° C incubadora durante 20-90 minutos com agitação constante a 200 rpm. No final deste período, garantir que quase todo o tecido é digerido em fragmentos finos.
    NOTA: A exposição das células à colagenase e dispase na altura do isolamento da sobrevivência das células dos tecidos influências primário. Temos encontrado empiricamente que a maioria das amostras de prepúcio neonatal optimamente exigem 20-30 min de digestão, ao passo que as amostras malformação linfática fibróticas podem necessitar de 60-90 min de digestão. Rendimento LEC LMs são influenciados pela quantidade de fibrose presente, produzindo mais tecido fibroso menos células, possivelmente devido aos efeitos deletérios da exposição prolongada a colagenase e dispase II II.
  8. Após a digestão, transferir o tubo para o cabine de segurança biológica e passar a solução tecido digerido através de uma peneira de 70 um colocado num tubo estéril de 50 ml. Usando 3 ml pistão seringas com um êmbolo de borracha, triturar o tecido remanescente até que são observados apenas pequenos vestígios de matriz extracelular.
  9. Lavar o filtro de células com um volume de célula endotelial forma equivalente ao volume médio de dissociação da enzima para recuperar as células aderiram a peneira e para inactivar as enzimas. Por exemplo, para 2 ml de meio de dissociação da enzima para digerir o tecido moído, adicionar 2 ml de meio de células endoteliais para inactivar as enzimas.
  10. Centrifugar a solução de células a 300 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. R> e-suspender as células em 10 ml de PBS. Centrifugar células a 300 xgdurante 5 minutos, remover o sobrenadante em seguida, repita lavagem de células duas vezes. > Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de meio de células endoteliais. Contar as células utilizando azul de tripano, em seguida, as sementes 2 x 10> 6 células em 150 centímetros> 2 balão pré-revestidos com fibronectina em um volume final de 20 ml de meio de células endoteliais. Cultura a 37 ° C em 5% de CO> 2 na incubadora de ar humidificado.>
    NOTA: Espera-se que 75% -90% de células nucleadas sobreviver digestão do tecido, tal como estimado por exclusão de azul de tripano. A contagem de células inicial reflecte todas as células nucleadas na suspensão de células (isto é, queratinócitos, leucócitos, macrófagos, células do tecido conjuntivo e das células dos vasos sanguíneos). A contagem de células em 5-7 dias reflete células que têm anexos, sobreviveram e proliferaram durante a cultura de células. Revestimento de tecido frascos de cultura com fibronectina também melhora LEC subseqüente e LM LEC sobrevivência.
  11. Após incubação durante a noite, lavar as células não ligadas distância em três lavagens com PSolução de antibiótico-antimicótico BS / 1% e adicionar meio fresco de células endoteliais. Realizar três lavagens para remover eficazmente as células não ligadas e células vermelhas do sangue presentes no balão. Mudança de mídia a cada segundo dia. As células vão ser ~ 80% confluentes após 5-7 dias.

3. Coloração de anticorpos de células endoteliais para Linfática marcadores da superfície celular para citometria de fluxo

  1. Depois que as células atingiram 80% de confluência, médio aspirado e as células de lavagem com PBS.
  2. Separe as células aderentes por incubação de células com 7 ml de solução de separação celular tal como Accutase por 150 centímetros 2 balão durante 5-7 min a 37 ° C.
  3. Células colheita individual, inactivar a solução separação celular por adição de 3 volumes de meio de células endoteliais e transferir a suspensão de células para um novo tubo de ensaio estéril.
  4. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min.
  5. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em 5 ml de PBS. Centrifugar células a 300 xg durante 5 minutos, retire as supernatant repita lavagem celular. Re-suspender as células em 5 ml de PBS.
  6. Contar o número de células viáveis. Misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,4% de azul de tripano. Transferem-se 10 ul desta suspensão de hemocitómetro para contagem.
    NOTA: O rendimento celular final dependerá do tamanho da amostra processada. O rendimento celular habitual por 150 intervalos de 2 cm do balão a partir de 7 x 10 5-1,2 x 10 6 de células viáveis.
  7. Preparar as soluções de anticorpo para coloração de células.
    NOTA: As seguintes diluições foram titulados para a coloração de 1 x 10 6 num volume de 100 ul de coloração.
    1. Dilui-PE anti-humano de ratinho conjugado VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 rato conjugado com CD34 anti-humano conjugado (1: 200); APC-rato conjugado CD31 anti-humano (1: 100) e Alexa 488-rato conjugado anti-humano podoplanin (1: 200) num volume total de 100 ul de solução estéril a 5% de FBS / PBS por amostra de tecido. Após a preparação desolução de anticorpo, manter em gelo até à utilização. Da mesma forma preparar mistura de anticorpo de controlo de isotipo diluído para facilitar a configuração de citometria de fluxo portões.
  8. Para reduzir a ligação não específica dos anticorpos, as células de centrifugação a 300 xg durante 2 min, em seguida, remover o sobrenadante suspender as células em 100 ul estéril 5% de FBS / solução de PBS por amostra a ser coradas. Incubar as células em gelo durante 20 min a 4 ° C.
  9. Células centrifugar a 300 xg durante 5 min, em seguida, remover o sobrenadante as células na mistura de anticorpos conjugados com re-suspender. Também manchar uma alíquota menor de células (1 x 10 5) em 100 ul de mistura de anticorpo de controlo de isotipo. Incubar as células em gelo durante 20 min.
  10. Para remover o anticorpo não ligado, adicionar 2 ml de solução de 2% de FBS / PBS e centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e repetir a lavagem.
  11. Ressuspender o sedimento celular durante o controlo de isotipo e o anticorpo corados amostra a ser classificados em 300 ul de 0,5 mg / ml de propídio iodide / 2% solução de FBS / PBS. Coloque tubos em gelo até a classificação.

4. celular Seleção

  1. Utilize os seguintes materiais para configurar o instrumento; grânulos de alinhamento, tais como partículas disponíveis comercialmente fluorescentes, com base salina do fluido do invólucro tampão fosfato e contas de atraso gota, tais como partículas fluorescentes Accudrop.
  2. Isolar os LECs humanos purificados sobre um instrumento de triagem de células activadas por fluorescência de múltiplos parâmetros. Configure o instrumento e alinhar conforme as recomendações do fabricante. Além disso, executar os controles individuais de compensação mancha com cada espécie para gerar a matriz de compensação e eliminar, assim, sangramento substancial através da emissão de fluorocromos tais como PE no canal PE-Cy.
    NOTA: A maior parte das células separadas por FACS sobreviver ao isolamento se um bocal de 100 um é utilizado e as células são separadas em meio de células endoteliais.

5. Cultura Celular Pós FACS Ordenaring

  1. Na sequência de ordenação, centrifugar células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5-10 ml de meio (dependendo do frasco utilizado para semear a célula). Se menos do que 50.000 células são classificadas, as células são cultivadas em fibronectina revestido frasco de 25cm 2.
  2. Caso contrário, as células de cultura em balão revestido 2-fibronectina 75 centímetros a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2, incubadora humidificada de ar. Mudar mídia após 2 dias.
    NOTA: meios de comunicação celular é trocado a cada segundo dia, porque o prolongamento do tempo entre as mudanças de suporte parece favorecer a sobrevivência das células não endoteliais. Nós validar o fenótipo da célula endotelial linfático usando detecção imunohistoquímica de marcadores: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 e CD31 quando as células são de primeira divisão para uma maior expansão 15.

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Representative Results

Após a digestão do tecido inicial, após 24 horas em cultura de amostras não fraccionadas, as colónias de células endoteliais podem ser observadas (Figura 2A), juntamente com as células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas. Seguindo triagem e após 24 horas em cultura de células, as células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 células Pos Pos podoplanina anexar e mostram a morfologia típica de calçada (Figura 2B e C). Utilizando o método FACS acima descrito, que são capazes de purificar as células até 99,8% de pureza e distingui-las das células CD34 CD31 alta Pos VEGFR-3 células endoteliais Pos Pos podoplanina. Os resultados representativos de gating estratégia de triagem e são apresentados na Figura 3. Este resolveu os problemas experimentada quando se utiliza o método de isolamento magnético-grânulo. Até à data, temos passadas estas células até à passagem 13. Após esta passagem, a LM LECs e prepúcio LECs começar a senescência, acompanhado por alterações morfológicas e divisão celular reduzida.

Figura 2
Figura 2. prepúcio LECs e LM-LEC. Vinte e quatro horas após a digestão enzimática, as células endoteliais não triados contêm ambos (seta) e as células não endoteliais (A). Na sequência CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 Pos podoplanina Pos FACS isolamento de células, prepúcio LECs (B) e LM-LECs (C) são desprovidos de células não endoteliais e manter morfologia paralelepípedos. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura .

Figura 3
Figura 3. células activadas por fluorescência estratégias para separação de células de propagação de célula endotelial vascular e linfáticos. (A) As células vivas são primeiramente fechado em CD34 e a expressão de CD31, seguido de endotélio linfático (células C) e VEGFR-3 podoplanin gating de tipo vascular (B) e, respectivamente. (D) Re-análise de classificados CD34 CD31 alta Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos células shows de> 98% fenótipo celular endotelial vascular. (E) células LEC ordenados em CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos fenótipo são também> 98% puro. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

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Discussion

LECs desempenhar um papel importante na manutenção da homeostase dos fluidos, resposta imunitária a antigénios estranhos e a absorção e transporte de alguns nutrientes. Homeostase LEC pode ser afectada por processos de doenças, tais como infecções bacterianas e metástases de tumores, mas também pode desenvolver LECs mutações somáticas que resultam na formação de vasos linfáticos disfuncionais e morbidade significativa para os pacientes afectados. Para ganhar mais compreensão da etiologia malformação linfática através do implante in vivo e ex vivo experimentação, e descobrir novas opções de tratamento, primeiro desenvolveu um método de isolamento LEC com base na estratégia de seleção grânulo magnético usando CD34 CD31 Neg Pos estratégia de seleção 15. No entanto, as culturas resultantes frequentemente contida excepto as células endoteliais que eram difíceis de remover as células. Subsequentemente, o método foi refinada usando FACS para classificar LECs que expressam CD34 CD31 Baixa Pos VEGR3 POS podoplanin Pos fenótipo. Esta abordagem resultou em culturas LEC relativamente homogêneas contendo <0,5% de células não-CD34 CD31 Baixa Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos em cheque pós-classificação. Em termos práticos, a vantagem de separar as células por FACS é que a redução da presença LECs não a <0,5%. LECs cultivadas e LM LECs têm uma morfologia típica calçada portuguesa e tornam-se senescentes em torno de passagem 13.

Neste estudo nós descrevemos um protocolo baseado citometria de fluxo para o isolamento e cultura de LECs altamente enriquecido a partir de tecidos normais e anormais com base na sua expressão de um conjunto de marcadores de superfície celular (CD34 CD31 Baixa Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos). As células foram separadas a partir de tecidos primários após 5-7 dias de expansão in vitro, de um passo que resultou no enriquecimento substancial do LCE em relação à sua frequência em tecidos na altura do isolamento. Durante surgery obtemos tecidos que vão desde várias dezenas de microgramas a gramas em peso. Esse tecido pode variar muito na sua composição em relação ao volume de navios malformação linfática presentes, tecido cicatricial e presença de trombos malformação linfática cisto. Todos estes componentes irão influenciar quantas células podem ser isoladas a partir do tecido doente. Portanto, o número de células de partida pode variar de alguns milhares de células a vários milhões de células. Da mesma forma, esta irá influenciar a composição da suspensão de células e o número de células de partida o que significa que o número de células classificadas também será diferente de uma amostra para outra.

A frequência de LECs em amostras de prepúcio não triados seguinte 5-7 dias em cultura varia de 0,52% a 4,7%, enquanto que LM LECs variam de 0,8% a 12,43%. As culturas LEC composta> 99% CD34 CD31 Baixa Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos células depois de pós-triagem re-análise e manteve uma típica cobblestone morfologia em cultura até à senescência na passagem ~ 13 anos sem crescimento excessivo por elementos não-endoteliais.

É necessário expandir as células ex vivo a seguir a digestão inicial do tecido e triagem porque o rendimento de utilização de células de prepúcio ou malformação linfáticos é geralmente baixa. Assim, a expansão antes de células endoteliais linfáticas i n vitro permite a geração de 2x10 ~ 6 células necessárias para semear uma câmara de rato. Isto requer uma fase de expansão in vitro de 5-7 dias. Enquanto que aceitar que a cultura celular pode induzir alterações fenotípicas nas células primárias, que têm demonstrado que estas células cultivadas conservam a sua capacidade para formar estruturas semelhantes a malformação linfáticas num modelo de xenoenxerto de ratinho 15.

Existem vários passos críticos dentro do protocolo que determinam o grau de sucesso ao classificar as células por FACS. O passo mais importante é o tempo de exposição das células a colagenasee dispase durante o isolamento a partir de tecidos primários, tal como descrito na etapa 2.7. Isto não só é influenciada pela quantidade e tipo de tecido presente, mas também pelo grupo de enzimas utilizadas. Além disso, os anticorpos marcados com fluorescência utilizados para caracterizar as populações de células precisa de ser titulado e de um modo preferido monoclonal. Nós testamos várias soluções diferentes descolamento celular, tais como tripsina / EDTA, EDTA, TrypLE Select e solução de desprendimento de células. Descobrimos que o EDTA teve de ser utilizado durante um período prolongado de tempo para separar as células e aglomerados de células residuais frequentemente permaneceram. Em contraste, as suspensões de células únicas foram gerados dentro de 3-5 minutos de incubação em tripsina / EDTA, solução de separação celular e TrypLE Select. Nós não encontramos nenhuma diferença substancial na expressão de CD31, CD34, podoplanina e VEGFR-3 após o tratamento com qualquer uma das soluções enzimáticas. As amostras manchadas individuais também deve ser feito com todas as experiências de triagem para garantir que o espectro de emissão de fluorocromo não se sobrepõem eportanto, dar leituras incorretas. Estas etapas críticas também constituem etapas onde modificações no protocolo de células possam ser necessárias ou resolução de problemas durante a citometria de fluxo de classificação.

Quando comparado com o nosso previamente publicado isolamento esférulas magnéticas de LECs 15, a vantagem de isolar LECs por FACS inclui o seguinte: isolamento mais rápida de células com elevado grau de pureza e de identificação de subpopulações de células e populações discretas raros dentro de uma amostra heterogénea. As principais limitações do LEC baseada em FACS e LM LEC isolamento gira em torno de um número limitado de células disponíveis para validação seguintes resultados célula de triagem. Além disso, enquanto é feito todos os esforços para padronizar nossos ensaios e instrumento de set-up, estes mesmos parâmetros podem não necessariamente ser reproduzível em outros laboratórios. Portanto, alguma variabilidade nos resultados podem ocorrer. Além disso, um dos problemas que os biólogos linfáticos enfrentam é a ausência de marcadores específicos de célulasque diferenciar entre os marcadores iniciais LEC capilar e coleta de marcadores LEC capilares. Nesta fase, nós ainda não identificados marcadores LEC que distinguem entre LECs saudáveis ​​e LM LECs. Uma vez que o tecido linfático malformação também contém de aparência normal vasos linfáticos (Figura 1A), a resultante da baixa CD34 CD31 Pos VEGR3 Pos Pos podoplanin irá conter uma proporção de LECs normais, bem como as do fenótipo doente. Futuros estudos examinando LEC e expressão gênica LM LEC e proteômica pode ser capaz de nos orientar no sentido de marcadores LEC LM mais específicos que poderão distinguir LM LECs de LECs no mesmo tecido.

No futuro, esperamos utilizar FACS e esses novos marcadores LEC na tentativa de identificar subconjuntos raros de populações LEC tanto no prepúcio e malformações linfáticas. Isto permitiria isolar estas populações de células e estudar o seu papel no desenvolvimento da lympsistema vascular hatic e malformações linfáticas.

Isolando LECs e LM LECs com base em CD34 CD31 Baixa Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos reduziu significativamente a contaminação de células não-endotelial. Além disso, a tecnologia de FACS permite separar LECs em subtipos com base na expressão de CD31, podoplanin e VEGFR-3 e marcadores de superfície celular para compreender este no contexto do desenvolvimento da linhagem celular. Para doentes LECs, isto permite estudos específicos de células que irão lançar luz sobre os genes que provocam doenças LEC e LEC capacidade para responder a vários estímulos de células in vitro e em modelos de xenotransplante de animais.

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Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Fundação Baker e 'Mulheres na Ciência Fellowship »do Royal Children Foundation apoio de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty e Edouard G. Stanley são NHMRC Senior Bolseiros de Investigação. Trabalho em seus laboratórios foi apoiada por NHMRC e Células-Tronco Austrália.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

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