Alloimmune प्रेरित संवहनी अस्वीकृति और प्रत्यारोपण धमनीकाठिन्य के माउस मॉडल

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Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

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Abstract

Introduction

पिछले 30 + साल से अधिक है, immunosuppressive दवाओं के क्षेत्र में प्रगति के कारण तीव्र अस्वीकृति को भ्रष्टाचार अस्वीकृति कम है लेकिन पुरानी अस्वीकृति एक मुख्य चुनौती बनी हुई है। जीर्ण हृदय प्रत्यारोपण अस्वीकृति की मुख्य अभिव्यक्ति प्रत्यारोपण धमनीकाठिन्य (टीए) 1,2 है। इस हालत intimal हाइपरप्लासिया और allograft धमनियों की vasomotor में शिथिलता की विशेषता है और प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रतिरक्षात्मक लक्ष्य-निर्धारण का एक परिणाम के रूप में विकसित कर रहा है। मेजबान जहाजों 3 बख्शते जबकि वजह से विदेशी पेप्टाइड प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) की मान्यता को भ्रष्टाचार vasculature की विशिष्ट लक्षित विशेष रूप से भ्रष्टाचार धमनियों में प्रादेशिक सेना के विकास से प्रकाश डाला है। इस के साथ ध्यान में रखते हुए प्राप्तकर्ता दाता या जब प्राप्तकर्ता टी और बी कोशिकाओं 4 का अभाव करने के लिए आनुवंशिक रूप से समान है जब प्रादेशिक सेना प्रयोगात्मक उत्पन्न नहीं होती है कि प्रेक्षण है। प्रतिरक्षा की मध्यस्थता संवहनी चोट और dysfunctioएन टीए 5 में, intimal मोटा होना और फाइब्रोसिस के विकास, साथ ही लिपिड और ईसीएम प्रोटीन की न्यायपालिका संचय का कारण बनता है। Intimal उमड़ना पूरे धमनी पेड़ 4-6 भर में गाढ़ा हो जाता है। भ्रष्टाचार घटाने और मौत आमतौर पर allograft धमनियों 4 की luminal रोड़ा से उत्पन्न प्रगतिशील ischemia के एक परिणाम के रूप में होते हैं।

1991 में, Mennander एट अल। 7 टीए मॉडल करने के लिए चूहों में एक महाधमनी दखल मॉडल का बीड़ा उठाया है। कई समूहों ने बाद चूहों में इस्तेमाल के लिए इस प्रक्रिया को ढाल लिया है। इस मॉडल में, allograft महाधमनी खंडों टा करने के लिए तुलनीय सुविधाओं नैदानिक ​​प्रत्यारोपण में देखा है कि घावों का विकास। यह चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की तरह है और प्राप्तकर्ता ल्यूकोसाइट्स 7 के संचय के द्वारा होती intimal मोटा होना भी शामिल है। पिछले 2 दशकों में इस मॉडल संवहनी चोट, अस्वीकृति और प्रादेशिक सेना के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह हमें हो सकता हैएड धमनी विकृति के दौरान प्रतिरक्षा और नाड़ी प्रतिक्रियाओं से संबंधित सवालों की जांच करने के लिए। प्रतिजन बेमेल प्रभावों के चुनाव को उचित रूप से इन सवालों को संबोधित करने की क्षमता।

पूरा MHC बाधाओं को पार प्रत्यारोपण अंग प्रत्यारोपण अस्वीकृति में शामिल होने के लिए जाना जाता है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक व्यापक मूल्यांकन के सभी देता है। इस भ्रष्टाचार के व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत प्रत्यक्ष CD4 और CD8 टी सेल मान्यता और विदेशी पेप्टाइड MHC को लक्ष्य भी शामिल है, अप्रत्यक्ष सीडी 4 (और संभवतः सीडी 8) टी सेल मान्यता और कोशिकाओं पेश प्राप्तकर्ता प्रतिजन द्वारा प्रस्तुत भ्रष्टाचार व्युत्पन्न alloantigens का निशाना और antibody- संवहनी सेल सतहों पर 8 alloantigens की मध्यस्थता मान्यता। हालांकि, पूरा MHC-बेमेल प्रयोगों में चोट करने के लिए संवहनी प्रतिक्रिया चिकित्सकीय मनाया है कि अधिक से अलग हो सकता है। जॉनसन एट अल। 9 से पता चला है, कि ज्यादातर के लिए एक पूरा MHC बेमेल बाधा पार प्रतिरोपित महाधमनी दखल ग्राफ्ट मेंneointimal कोशिकाओं प्राप्तकर्ता मूल के और न दाता मूल के हैं। यह सबसे intimal चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं दाता मूल 9,10 के हैं जहां मानव प्रत्यारोपण में मनाया तुलना में अलग है। इस सीमा के लिए खाते में करने के लिए, नाबालिग उतक अनुरूपता प्रतिजन बेमेल भर में कलम बांधने का काम शामिल है कि वैकल्पिक प्रयोगात्मक मॉडल और अधिक बारीकी से नैदानिक ​​प्रत्यारोपण 11 में मनाया उन जैसे लगते हैं कि नाड़ी प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर है कि विकसित किया गया है। इन वैकल्पिक मॉडल महत्वपूर्ण निष्कर्ष के लिए अनुमति देते हैं जबकि टीए, पूरी तरह से नैदानिक ​​सेटिंग में पाए जाते हैं जो उन लोगों को फिर से हथियार डाल देना नहीं है मामूली उतक अनुरूपता प्रतिजन बेमेल ग्राफ्ट में संवहनी अस्वीकृति का कारण है कि प्रतिरक्षात्मक प्रक्रियाओं के विकास ड्राइव कि नाड़ी प्रतिक्रियाओं के बारे में बनाया जाना है। उदाहरण के लिए, नाबालिग उतक अनुरूपता एंटीजन भ्रष्टाचार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी 12 से खराब पहचाने जाते हैं। उपरोक्त विचारों को देखते हुए यह रोग questi है पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैएक महाधमनी दखल मॉडल में इस्तेमाल प्रतिजन बेमेल के प्रकार का चयन करते समय पर जांच की जा रही है। यहाँ हम murine महाधमनी दखल ग्राफ्टिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन। हम पूरा MHC-बेमेल चूहों लेकिन एक ही प्रोटोकॉल अन्य प्रतिजन बेमेल माउस उपभेदों भर में कलम बांधने का काम के लिए प्रयोग किया जाता है के बीच दखल ग्राफ्टिंग का वर्णन है।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा की और साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय जानवरों की देखभाल आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। का प्रयोग करें / Balb cYJ (एच 2 डी) दाता चूहों और C57BL / 6 (एच 2 बी) प्राप्तकर्ता चूहों अल्लोजीनिक प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए। चूहे 8 से 12 सप्ताह की आयु के बीच के प्रयोगों के लिए किया जाता है। महिला या पुरुष या तो चूहों का उपयोग करें। Syngeneic नियंत्रण C57BL / 6 प्राप्तकर्ताओं में C57BL / 6 दाताओं से महाधमनी खंडों से मिलकर बनता है।

1. दाता और प्राप्तकर्ता तैयारी

नोट: दाता और प्राप्तकर्ता दोनों anesthetized और भ्रष्टाचार के ischemia के लिए कम से कम करने के लिए सर्जरी से पहले तैयार कर रहे हैं। इंजेक्शन anesthetics साँस anesthetics के वितरण के लिए आवश्यक उपकरणों से पशु की बाधा को रोकने के लिए प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाता है। हालांकि, अगर वांछित, साँस संवेदनाहारी एक उपयुक्त विकल्प है। निश्चेतक की प्रारंभिक इंजेक्शन से, पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लगभग 90 मिनट लगते हैं। भ्रष्टाचार के इस्केमिक समय कम था हैएन 30 मिनट।

  1. Ketamine की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize (100 मिलीग्राम / किग्रा, 10 मिलीग्राम / एमएल) और xylazine (10 मिलीग्राम / किलो, 1 मिलीग्राम / एमएल)। माउस 10 से 15 मिनट के भीतर बेहोश कर दिया जाएगा। पशु पैर पैड के फैटी हिस्सा बन्द रखो द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें। जरूरत के रूप में पशु वापसी पलटा प्रदर्शन नहीं करता है, जब तक संवेदनाहारी कॉकटेल के मूल खुराक का 1/3 प्रशासन। हर कॉकटेल दिलाई है बारीकी के बाद सांस की दर पर नजर रखने। सर्जरी के दौरान, संदंश की एक जोड़ी के साथ पूर्वकाल पेट की दीवार बन्द रखो द्वारा संज्ञाहरण के स्तर पर हर 15 मिनट का आकलन करें। चूहों गहरा 60 से 90 मिनट के लिए anaesthetized रहना चाहिए।
  2. संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए एक नेत्र मरहम के साथ माउस की आँखों चिकनाना।
  3. जघनरोम के मध्य छाती से पेट उदर क्षेत्र पर संभव के रूप में त्वचा के करीब बाल दाढ़ी। किसी भी त्वचा निक के लिए विशेष रूप से सावधान नहीं रहो। यह मैं अवशोषित किया जा सकता है क्योंकि लोमनाशक क्रीम का प्रयोग न करेंत्वचा Nto और सूजन हो सकता है।
  4. हीटिंग टेबल या पैड के ऊपर एक तौलिया पर लापरवाह स्थिति में पशु रखें।
  5. 2% chlorohexidine के साथ एक प्रारंभिक हाथ धोने के साथ शल्य साइट को साफ करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए एक बड़े क्षेत्र में काम करने को तैयार है। शल्य साइट के केंद्र में शुरू scrubbing और एक रेखीय या परिपत्र ढंग से बाहर करने के लिए चाल है। धुंध के निपटान के। इस प्रक्रिया में कम से कम 5 बार दोहराएँ। एक ही क्षेत्र में एक शराब प्रस्तुत करने का पैड लागू करें। शराब सूखी है एक बार, बाँझ धुंध के साथ betadine समाधान और टांगना के साथ स्वच्छ क्षेत्र तैयार करते हैं।

2. एंड-टू-एंड सम्मिलन प्रक्रिया

  1. दाता ऑपरेशन
    1. आपरेशन के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखें। का उपयोग करने से पहले 0.5% त्वरित हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ सभी countertop और शल्य चिकित्सा की मेज सतहों को साफ करें। लपेटें और उपयोग करने से पहले सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों, Gauzes, पर्दे और गाउन आटोक्लेव। एक भाप के साथ उपकरणों की बाँझपन सत्यापित करेंप्रत्येक पैकेट में रखा अजीवाणु सूचक पट्टी। बाँझ सर्जिकल दस्ताने का इस्तेमाल किया और सर्जरी के बीच का निपटारा कर रहे हैं। कई सर्जरी के लिए, गिलास गर्म मनका अजीवाणु के साथ उपयोग करता है के बीच शल्य चिकित्सा उपकरण बाँझ।
    2. 8-30X बढ़ाई ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत बाँझ कपड़ा के साथ लिपटे एक साफ, पतली Plexiglas बोर्ड पर एक लापरवाह स्थिति में दाता माउस रखें।
    3. खंड 1.1 में उल्लिखित के रूप में पर्याप्त शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के बाद, शल्य चिकित्सा के साथ आगे बढ़ें।
    4. बाँझ कैंची का प्रयोग, xyphoid प्रक्रिया को जघनरोम से, एक भी midline के निचले अनुदैर्ध्य पेट चीरा बनाते हैं।
    5. पेट की दीवारों के एक छोटे से प्रतिकर्षक ओपन का उपयोग कर गुहा को बेनकाब करने के लिए।
    6. Applicators बाँझ कपास इत्तला दे दी प्रयोग, धीरे से ऊंचा जानवर की बाईं करने के लिए आंतों को वापस लेना और खारा समाधान के साथ सिक्त धुंध के साथ कवर किया। Inferiorly प्रजनन अंगों ले जाएँ और infrarenal महाधमनी और अवर रग Cava (आईवीसी) का पता लगाने। Moisसमय-समय पर खारा समाधान के साथ दस उजागर ऊतकों।
    7. चिकित्सा नंबर 5 संदंश का प्रयोग, विभाजन करने के लिए छोड़ दिया वृक्क धमनी के स्तर से, आईवीसी से महाधमनी अलग। महाधमनी के पास छोटी शाखाओं ligate को 10-0 पॉलियामाइड monofilament टांके का उपयोग करें।
    8. दाता महाधमनी आईवीसी से अलग कर दिया गया है, सिक्त धुंध के साथ उजागर गुहा को कवर, नमक के साथ पोत तर और एक बाँझ क्षेत्र पर एक तरफ दाता निर्धारित किया है। दाता (श्वसन और हृदय समारोह, और संज्ञाहरण की गहराई) हर 15 मिनट की स्थिति की जाँच करें। (कदम 2.2.7 के लिए 2.2.1) के नीचे वर्णित के रूप में महाधमनी अलग, प्राप्तकर्ता पर परिचालन शुरू।
    9. प्राप्तकर्ता महाधमनी आईवीसी से अलग और अलग निर्धारित किया गया है, माइक्रोस्कोप के तहत दाता वापसी। क्रॉस दबाना (समीपस्थ और ब्याज के क्षेत्र के लिए बाहर का) दाता महाधमनी, दो 4 मिमी माइक्रोवैस्कुलर clamps के साथ के अलावा लगभग 5 मिमी।
    10. Vannas-Tubingen microscissors का उपयोग करना,उदर महाधमनी के एक छोटे से भ्रष्टाचार के खंड (लंबाई में 3 से 4 मिमी) आड़ा काट।
    11. एक सिरिंज से जुड़ी एक 25 जी 5/8 सुई का प्रयोग, heparinized (100 यू / एमएल) खारा समाधान के साथ excised महाधमनी फ्लश। पोत के साथ संपर्क में नहीं आया है सुई की नोक सुनिश्चित करें।
    12. Heparinized में रखें महाधमनी (100 यू / एमएल) खारा बर्फ पर समाधान और अलग निर्धारित करें। अभी भी गहरी संज्ञाहरण के तहत, माइक्रोवैस्कुलर clamps के जारी है। Exsanguination द्वारा दाता euthanize।
    13. छांटना के 30 मिनट के भीतर दाता पोत प्रत्यारोपण। यह महाधमनी का एक बड़ा लंबाई excising से अधिक प्राप्तकर्ताओं के लिए एक दाता पोत का उपयोग करने के लिए संभव है, कम से कम 30 मिनट के लिए इस्कीमिक समय रहते हैं।
  2. प्राप्तकर्ता ऑपरेशन
    1. दाता आपरेशन के रूप में, आपरेशन के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखें।
    2. 8-30X बढ़ाई ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत बाँझ कपड़ा के साथ लिपटे एक पतली Plexiglas बोर्ड पर एक लापरवाह स्थिति में प्राप्तकर्ता माउस रखें।
    3. वायु सेनापशु वापसी पलटा प्रदर्शन नहीं करता है जब पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने आतंकवाद, शल्य चिकित्सा के साथ आगे बढ़ें।
    4. बाँझ कैंची का प्रयोग, xyphoid प्रक्रिया को जघनरोम से, एक भी midline के निचले अनुदैर्ध्य पेट चीरा बनाते हैं।
    5. पेट की दीवारों के एक छोटे से प्रतिकर्षक ओपन का उपयोग कर गुहा को बेनकाब करने के लिए।
    6. Applicators बाँझ कपास इत्तला दे दी प्रयोग, धीरे से ऊंचा जानवर की बाईं करने के लिए आंतों को वापस लेना और खारा समाधान के साथ सिक्त धुंध के साथ कवर किया। Inferiorly प्रजनन अंगों ले जाएँ और infrarenal महाधमनी और आईवीसी का पता लगाने। नमकीन घोल के साथ समय-समय पर उजागर ऊतकों गीला।
    7. विभाजन करने के लिए छोड़ दिया वृक्क धमनी के स्तर से, आईवीसी से महाधमनी अलग करें। यदि आवश्यक हो, महाधमनी के पास छोटी शाखाओं ligate को 10-0 पॉलियामाइड monofilament टांके का उपयोग करें।
    8. क्रॉस दबाना (समीपस्थ और ब्याज के क्षेत्र के लिए बाहर का) महाधमनी, दो 4 मिमी माइक्रोवैस्कुलर clamps के साथ के अलावा लगभग 5 मिमी।
    9. Vannas-Tubingen microscissors के प्रयोग, एक एकल क्षैतिज aortotomy बनाने के लिए और दाता महाधमनी भ्रष्टाचार को समायोजित करने के लिए उदर महाधमनी के एक छोटे से क्षेत्र (कोई अधिक से अधिक 0.5 मिमी) विभाजित।
    10. Heparinized (100 यू / एमएल) खारा समाधान के साथ excised महाधमनी फ्लश। दाता महाधमनी भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ता का transected महाधमनी समाप्त होता है कनेक्ट करने के लिए उचित लंबाई के लिए किया जाना चाहिए।
    11. Orthotopic स्थिति में दाता महाधमनी भ्रष्टाचार प्लेस और प्राप्तकर्ता के साथ कि संबंधित भ्रष्टाचार संरचनात्मक अभिविन्यास मिलान, प्राप्तकर्ता का अंत करने के लिए दाता भ्रष्टाचार अंत anastomose।
    12. धीरे पोत के Tunica एक्सटर्ना समझ और थोड़ा चिकित्सा संख्या 5 संदंश का उपयोग कर इसे एवर्ट। संदंश का प्रयोग, प्राप्तकर्ता का resected पोत के लिए दाता महाधमनी भ्रष्टाचार को सुरक्षित करने के क्रम में पोत दीवार की पूरी मोटाई के माध्यम से 10-0 पॉलियामाइड monofilament सीवन से जुड़ी सुई ड्राइव। पोत उद्घाटन बंद की वजह से टी बंद नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखनाजहाज के पीछे की दीवार की ओ अनजाने सिलाई।
    13. सतत टांके के लिए, भ्रष्टाचार के ऊपरी और निचले दोनों सिरों में 9 बजे प्रवास टांके जगह है। 03:00 से भ्रष्टाचार के ऊपरी छोर पर शुरू, 2 चल sutures के साथ समाप्त होता है resected anastomose और रहने सिवनी सिवनी सुरक्षित।
      1. अधिक भ्रष्टाचार पलटें और मूल प्रवास सिवनी बैठक, पोत का हिस्सा पृष्ठीय करने की दौड़ सिवनी जारी है। पोत पर ज्यादा दबाव लागू करने के बिना सुरक्षित। कम सम्मिलन के लिए suturing दोहराएँ।
        नोट: बाधित टांके पोत प्रवास के टांके के बीच तीन अलग कर टांके के साथ anastomosed है कि अपवाद के साथ निरंतर सीवन के रूप में एक ही तरह से शुरू करते हैं। सम्मिलन समय आमतौर पर 20 मिनट है।
    14. सम्मिलन पूरा हो जाए, पतित रक्त प्रवाह और anastomosed साइटों के रिसाव के लिए जाँच करने के लिए अनुमति देने के लिए बाहर का माइक्रोवैस्कुलर दबाना जारी। एक रिसाव, immediatel अगर वहाँY दोषपूर्ण साइट को बंद करने के लिए एक सिलाई जगह है। स्थलों पर कोई खून बह रहा है, तो समीपस्थ दबाना जारी।
    15. प्रत्यारोपण की जांच करने और भ्रष्टाचार में कोई रक्त रुकावट, और समीपस्थ और प्राप्तकर्ता के पोत के बाहर का भाग है कि वहाँ की जाँच करें। दाता और प्राप्तकर्ता के दोनों पोत में जोरदार पल्स पैटर्न रक्त आज़ादी से बह रहा है कि एक प्राथमिक संकेत है। संदंश की जोड़ी का प्रयोग, धीरे प्रवास के टांके के एक छोर समझ और थोड़ा जहाज के पीछे की दीवार का निरीक्षण करने के लिए पोत एवर्ट।
      नोट: anastomosed साइटों के दोनों सिरों पर पोत दीवार का कोई puckering होना चाहिए। Clamps के हटाने के बाद गरीब रक्त प्रवाह घनास्त्रता का एक संकेत है।
    16. कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग करना, उदर गुहा में आंतों वापसी।
    17. Castroviejo सुई धारक और Graefe संदंश के साथ, निरंतर सिलाई का उपयोग करते हुए 5-0 polypropylene के टांके के साथ पेट की दीवार को बंद करें। उसी के साथ त्वचा की परत को बंद करेंsubcuticular बंद करने का उपयोग कर टांके।
    18. प्रत्यारोपण के पूरा होने पर तुरंत Torbugesic (1 मिलीग्राम / किग्रा) आईएम प्रशासन।
    19. आदेश में, तुरंत, Atipamezole (1 मिलीग्राम / किग्रा), ketoprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा) के दो और Lactated घंटी समाधान subcutaneously गरम।
    20. तुरंत सर्जरी के बाद, एक पानी कंबल रातोंरात (12 घंटा) के तहत एक गर्म पिंजरे में चूहों जगह है। संवेदनाहारी-वसूली की अवधि के दौरान, एक साफ, सूखे अबाधित क्षेत्र में अकेले जानवरों जगह है। लाइन साफ ​​कागज तौलिये के साथ (autoclaved) पिंजरे और लगभग 20 डिग्री सेल्सियस से 22 करने के लिए पानी कंबल के तापमान को समायोजित। पिंजरे फर्श पर सूखे और गीले kibbles यथेच्छ प्रदान करें।
      नोट: शल्य चिकित्सा के बाद देखभाल का एक महत्वपूर्ण घटक संज्ञाहरण और सर्जरी से वसूली के दौरान, के रूप में आवश्यक है, जानवर और उचित हस्तक्षेप के अवलोकन है। निगरानी के लिए आवश्यक तीव्रता जानवर के साथ अलग अलग होंगे और सह के रूप में तत्काल संवेदनाहारी वसूली की अवधि के दौरान अधिक से अधिक हो सकता हैबाद में पश्चात की वसूली में करने के लिए mpared।
    21. लगातार वे पूरी तरह ठीक होने तक नजर रखी आया संज्ञाहरण होने जानवरों की निगरानी। पशु बेबस sternal अवलंबन बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए और इसे पहुंच से बाहर छोड़ा जा सकता है इससे पहले कि यह शांत और दर्द से मुक्त प्रकट करना चाहिए।
    22. दोनों subcutaneously, तीन दिन की अवधि के लिए Buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किलो बोली) और ketoprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा सिड) दीजिए।
    23. तीन दिनों की एक न्यूनतम के लिए संज्ञाहरण से वसूली के दौरान हृदय और श्वसन समारोह, शरीर का तापमान, और पश्चात दर्द या बेचैनी की निगरानी करें। अतिरिक्त देखभाल ऐसे निर्जलीकरण और इलेक्ट्रोलाइट नुकसान को कम करने के लिए दर्दनाशक दवाओं और अन्य दवाओं, और Parenteral तरल पदार्थ के प्रशासन के रूप में आवश्यक हो सकता है।
    24. हिंद अंग की मोटर समारोह को देख कर प्रत्यारोपण सर्जरी की सफलता का आकलन करें। प्रत्यारोपण की पूर्ण सफलता anim के वसूली पर तत्काल किया जाना चाहिए जो पिछले अंग और पूंछ, के लिए अबाधित रक्त प्रवाह शामिलअल, और दूसरे दिन हिंद अंग का कोई पक्षाघात के साथ पूरा वसूली

3. ऊतक संग्रह

नोट: पूर्व निर्धारित अंत अंक वांछित विश्लेषण के प्रकार और प्रतिजन बेमेल की प्रकृति के आधार पर 3-60 दिनों से लेकर। आम तौर पर, intimal उमड़ना पूरा MHC बेमेल माउस उपभेदों भर में प्रत्यारोपण के बाद दिन में 30 पर मजबूत है।

  1. Ketamine की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize (100 मिलीग्राम / किग्रा, 10 मिलीग्राम / एमएल) और xylazine (10 मिलीग्राम / किलो, 1 मिलीग्राम / एमएल)। पशु पैर पैड के फैटी हिस्सा बन्द रखो द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें। पशु वापसी पलटा प्रदर्शन नहीं करता है जब सर्जरी के साथ आगे बढ़ें।
  2. पानी और 70% शराब के साथ समाप्त होने के साथ शल्य साइट को साफ करें।
  3. शोषक पैड के साथ लाइन में खड़ा एक ट्रे पर लापरवाह स्थिति में पशु रखें।
  4. एक बड़े midline के अनुदैर्ध्य चीरा के साथ उदर गुहा खोलें। गुहा को बेनकाब करने के लिए एक आत्म बनाए रखना प्रतिकर्षक, जगह आईवीसी एकउदर महाधमनी होगी।
  5. धीरे चिकित्सा नंबर 5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग पड़ोसी आईवीसी से प्रत्यारोपित दाता महाधमनी खंड अलग। प्रतिरोपित पोत के बाह्यकंचुक पट्टी करने के लिए नहीं विशेष रूप से सावधान रहें।
  6. सभी तरह से वक्ष इनलेट को वक्ष रीढ़ की हड्डी के दोनों पक्षों के साथ पसलियों के माध्यम से काटने के द्वारा वक्ष गुहा बेनकाब। पेरीकार्डियम बेनकाब और hemostat की एक जोड़ी के साथ ribcage सुरक्षित करने के लिए ऊंचा पूर्वकाल छाती दीवार दर्शाते हैं।
  7. दिल उजागर होने के बाद, एक 25 जी 5/8 बाएं वेंट्रिकल में (एक सिरिंज से जुड़ी) सुई और heparinized की 0.1 मिलीग्राम (100 यू / एमएल) खारा समाधान के साथ फ्लश डालें।
  8. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, रक्त, heparinized खारा है, और लगानेवाला छिड़काव के दौरान शरीर छोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए सही अलिंद को हटा दें। 4% paraformaldehyde के 5 एमएल के साथ या तरल पदार्थ रन स्पष्ट जब तक पशु छिड़कना। इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए दिल निकालें।
  9. आबकारी पोत खंड प्रत्यारोपित और 4% पैरा में विसर्जितएक घंटे से अधिक नहीं के लिए formaldehyde के। प्रतिरोपित अक्टूबर में पोत (इष्टतम काटने तापमान) मैट्रिक्स और फ्लैश फ्रीज सेट करें। धारा 8 उम मोटाई पर सेट एक cryostat के तहत पोत। Haematoxylin और eosin और / या Verhoeff-वैन Gieson (वैन Gieson) लोचदार दाग के साथ दाग वर्गों।

Grafts के 4. morphological विश्लेषण

नोट: प्रादेशिक सेना intimal उमड़ना 13 की विशेषता है। इस मॉडल में, intimal मोटा होना और लुमेन के आकार में एक परिणामी कमी प्रतिरक्षा की मध्यस्थता संवहनी चोट की गंभीरता को प्रतिबिंबित करता है। Syngraft नियंत्रण अल्लोजीनिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अभाव में जहाजों की आधारभूत विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन नियंत्रणों भी शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में होता है कि धमनी क्षति के मूल्यांकन की अनुमति है। Syngrafts में कोई intimal मोटा होना नहीं होना चाहिए।

  1. Endothelial सेल के भीतर क्षेत्र को मापने, intimal मोटा होना और luminal रोड़ा जांच करने के लिएपरत, आंतरिक लोचदार लामिना (IEL) और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ लोचदार वैन Gieson दाग धमनी खंडों पर बाहरी लोचदार पटल (मछली)। नीचे दिए गए मापदंडों प्रादेशिक सेना को प्रतिबिंबित करता धमनी परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. पूर्ण intimal क्षेत्र उपाय: आंतरिक लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र - endothelial सेल परत के भीतर क्षेत्र। इस प्रादेशिक सेना की पहचान है जो intimal विस्तार, का एक निरपेक्ष माप प्रदान करता है।
    2. आंतरिक लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र - क्षेत्र बाहरी लोचदार पटल के भीतर: निरपेक्ष औसत दर्जे का क्षेत्र उपाय। यह कभी-कभी पोत दीवार के इस क्षेत्र के लिए प्रतिरक्षा की मध्यस्थता परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में हो सकता है, जो औसत दर्जे का क्षरण या विकास का एक निरपेक्ष माप, प्रदान करता है।
    3. बाहरी लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र के रूप में कुल पोत क्षेत्र उपाय। इस प्रतिरक्षात्मक नुकसान का एक परिणाम के रूप में विस्तार या धमनी के कसना शामिल है जो पोत remodeling के एक माप प्रदान करता है।
    4. उपाय(आंतरिक लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र - endothelial सेल परत के भीतर क्षेत्र) / (बाहरी लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र - आंतरिक लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र): intima / मीडिया। इस intimal विस्तार के एक रिश्तेदार उपाय प्रदान करता है और पोत के आकार में अंतर के लिए normalizes।
    5. % Luminal संकुचन उपाय: [(आंतरिक लोचदार पटल के भीतर क्षेत्र - endothelial सेल परत के भीतर क्षेत्र) आंतरिक लोचदार पटल साथ / क्षेत्र)] * 100। इस intimal विस्तार और पोत दीवार के पुनर्गठन (आवक या जावक) के मेल से जो परिणाम luminal रोड़ा की हद, का एक उपाय प्रदान करता है।

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Representative Results

इस मॉडल में, एक / Balb cYJ माउस से उदर महाधमनी एक C57BL / 6 प्राप्तकर्ता के infrarenal महाधमनी में interposed है। इस allograft धमनियों कि लक्ष्य alloimmune प्रतिक्रियाओं की एक व्यापक मूल्यांकन परमिट। इस मॉडल में प्रतिरक्षा की मध्यस्थता संवहनी चोट intimal मोटा होना, luminal संकुचन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती में culminate कि नाड़ी विरोहक प्रतिक्रियाएं शुरू की (आंकड़े 1 और 2)। इन मानदंडों तो alloimmune प्रतिक्रियाओं की गंभीरता, नाड़ी अस्वीकृति, और प्रादेशिक सेना के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में सेवा करते हैं। प्रक्रिया की सफलता allograft धमनी क्षेत्रों की मजबूत intimal उमड़ना के विकास और syngraft नियंत्रण में intimal उमड़ना की अनुपस्थिति से मूल्यांकन किया जा सकता है। नैदानिक ​​प्रासंगिक प्रतिरक्षादमन अधिक बारीकी से नैदानिक ​​प्रत्यारोपण सदृश करने के लिए इस मॉडल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। यह मॉडल भी alloimmune प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट प्रोटीन / रास्ते के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैहम 14 किया है।

Allograft महाधमनी खंडों intimal उमड़ना विकसित

प्रतिरक्षा की मध्यस्थता allograft संवहनी क्षति की राशि दिन 30 के बाद प्रत्यारोपण पर grafted महाधमनी क्षेत्रों में intimal मोटा होना और luminal संकुचन बढ़ाता द्वारा जांच की गई थी। Allograft धमनी खंडों महत्वपूर्ण intimal मोटा होना और luminal रोड़ा विकसित करने और कोई बदलाव नहीं syngraft नियंत्रण धमनी खंडों (चित्रा 1) में मनाया जाता है।

Allograft महाधमनी क्षेत्रों में leukocytes के संचय।

allograft धमनियों में leukocytes के संचय सीडी 4 टी कोशिकाओं, CD8 टी कोशिकाओं, और मैक्रोफेज (मैक-3) immunohistochemistry द्वारा 15 की संख्या बढ़ाता द्वारा जांच की गई थी। मैक-3 ऐसे F4 / 80 के रूप में अन्य मार्करों, भी 16 इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इस अध्ययन में मैक्रोफेज के लिए दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था। सीडी 4 टी कोशिकाओं, CD8 टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज में पाया गया allograft धमनियों की intima (चित्रा 2)

चित्र 1
चित्रा 1: grafted धमनियों के histological विश्लेषण (ए) syngeneic और अल्लोजीनिक चूहों से उदर महाधमनी खंडों C57BL / 6 चूहों की resected पेट aortas में interposed गया।। grafted धमनियों दिन 30 के बाद प्रत्यारोपण पर काटा गया। लोचदार वैन Giesen दाग धमनियों के प्रतिनिधि photomicrographs दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 0.1 मिमी = 100 पोत के विभिन्न परतों, एल मापा जाता है कैसे चित्रण माइक्रोन (बी) आरेख: लुमेन, ई: एन्दोथेलिअल परत, मैं: intima, एम: मीडिया, एक:।। के बाह्यकंचुक (सी) मात्रा intima / मीडिया अनुपात और 30 दिन syngeneic से संकुचन% luminal (एन = 3) और अल्लोजीनिक (एन = 6) प्रत्यारोपण, * पी <0.05।= "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: allograft धमनियों में इम्यून सेल संचय। Allograft महाधमनी क्षेत्रों के प्रतिनिधि photomicrographs immunohistochemically (ए) सीडी 4 (बी) सीडी 8, और (सी) मैक-3 के लिए दाग और दिखाए जाते हैं hematoxylin साथ counterstained। स्केल बार = 0.1 मिमी = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम प्रतिरक्षा की मध्यस्थता संवहनी अस्वीकृति और प्रादेशिक सेना के अध्ययन के लिए उपयोगी होता है कि चूहों में कलम बांधने का काम महाधमनी दखल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस मॉडल को प्रादेशिक सेना के कारणों के साथ ही उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति के विकास की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रादेशिक सेना 14,17-21 में अनुकूली प्रतिरक्षा, साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया, साइटोकाइन की मध्यस्थता सीडी 4 टी सेल प्रेरक प्रतिक्रियाओं, और एंटीबॉडी की मध्यस्थता भ्रष्टाचार के नुकसान की एक आवश्यक भूमिका स्थापित करने के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है। चूहों में धमनी प्रत्यारोपण की वजह से जानवर के स्पष्ट छोटे आकार के लिए मुश्किल है; हालांकि, अभ्यास और परिश्रम के कारण के साथ, सफल सर्जरी से पूरा किया जा सकता है। सफलता पोत की प्रत्यक्षता पर निर्भर करता है। इस भ्रष्टाचार को अनुचित तरीके से, पोत लुमेन के संदंश के साथ पोत, कसना से निपटने जहाज के पीछे की दीवार, और एक ही साइट का दोहराव suturing suturing से क्षतिग्रस्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करना शामिल है। पोत का रिसाव भी समस्याग्रस्त है और ई के लिए देखभाल की आवश्यकता हैटांके की संख्या और स्थिति पोत दीवार के चारों ओर समान रूप से बांटा जाता है कि nsure। यह भ्रष्टाचार ischemia के कम से कम 30 मिनट के लिए कम से कम है कि यह भी आवश्यक है। इस के साथ, अधिक से अधिक से अधिक 95% की सफलता दर हासिल की जा सकती है।

महाधमनी माउस में सबसे बड़ी धमनी तो यह प्रक्रिया इस मॉडल जानवर में संवहनी अस्वीकृति की जांच के लिए सबसे सरल microsurgical दृष्टिकोण है। इसके अलावा, महाधमनी खंड एक physiologically प्रासंगिक स्थान में grafted है, सामान्य रक्त के प्रवाह का अनुभव करता है, और intimal उमड़ना तेजी से विकसित करता है। संवहनी अस्वीकृति और प्रादेशिक सेना के आकलन के लिए इस्तेमाल अन्य मुख्य मॉडल कोरोनरी धमनियों में और प्रादेशिक सेना के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक नैदानिक ​​परिदृश्य है कि हृदय प्रत्यारोपण के संदर्भ में प्रादेशिक सेना के विकास की जांच का लाभ दिया है, जो heterotopic हृदय प्रत्यारोपण है। हालांकि, heterotopic हृदय प्रत्यारोपण के शरीर के भीतर एक गैर शारीरिक स्थान में रखा जाता है (आमतौर पर वेना कावा के लिए anastamosed औरपेट में महाधमनी) और दिल की वजह से प्रत्यारोपित दिल में रक्त की आपूर्ति की प्रतिगामी प्रकृति के निलय के माध्यम से खून पंप नहीं है। जैसे, कोरोनरी पेड़ के माध्यम से रक्त के प्रवाह की प्रकृति सामान्य रूप से कोरोनरी वाहिका 22,23 द्वारा अनुभवी है से अलग हो सकता है। इसके अलावा, रणनीतियों दिल की तीव्र अस्वीकृति धमनी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के क्रम में शामिल किया जाना चाहिए काबू पाने के लिए। दोनों मॉडलों में, यह ध्यान से उचित रूप से संवहनी अस्वीकृति और प्रादेशिक सेना से संबंधित विशिष्ट सवालों का पता करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में उपयोग प्रतिजन बेमेल के प्रकार का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

सारांश में, महाधमनी दखल ग्राफ्टिंग प्रतिरक्षा की मध्यस्थता धमनियों को नुकसान और प्रादेशिक सेना की जांच के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह नियमित शोधकर्ता की ओर से अभ्यास और परिश्रम के साथ में महारत हासिल किया जा सकता है। एक बार में महारत हासिल है, इस प्रक्रिया में इस तरह के मन्या धमनी, वें के रूप में अन्य धमनी खंडों के दखल ग्राफ्टिंग के लिए संशोधित किया जा सकता हैपर अतिरिक्त वैज्ञानिक सवालों की परीक्षा के लिए सक्षम हो सकता है। इसके अलावा, इस मॉडल के उपयोग के प्रत्यारोपण के अध्ययन से आगे बढ़ाया जा सकता है। संशोधित से धमनियों की दखल ग्राफ्टिंग धमनी खंडों को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए ट्रांसजेनिक या लिपिड फेड) गैर संशोधित समकक्षों में चूहों, या इसके विपरीत, गैर धमनियों की दीवार कोशिकाओं 24 बनाम धमनी दीवार कोशिकाओं को अणुओं का जैविक प्रभाव को अलग करने के लिए 25।

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Acknowledgements

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान और दिल और ईसा पूर्व और युकोन के स्ट्रोक फाउंडेशन (जेसीसी) की कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

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References

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