إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Decellularization وrecellularization قد تمكن من توليد وظيفية، وأجهزة للزرع في المختبر 1. عن طريق إزالة الخلايا والمواد المستضدات (على سبيل المثال، DNA، الحواتم ألفا غال) من الجهاز، المصفوفة خارج الخلية غير أو أقل مناعة (ECM) ويمكن الحصول على. هذه المصفوفة تحافظ عليه التشريح المجهري ثلاثي الأبعاد للجهاز ويمكن أن تكون بمثابة بايوماتريكس مثالية لإعادة تعمير مع خلايا مختلفة، والأصل ربما xenogeneic 2. وبالتالي، يمكن إسكانها على decellularized الفئران مصفوفة الكبد بخلايا الكبد الإنسان. هذا أنسنة الكبد الجزئي يمكن أن تكون بمثابة نموذج فيفو السابقين للبحث في الأمراض (على سبيل المثال، الأمراض الاستقلابية الخلقية والأمراض الفيروسية أو الأورام الخبيثة) أو لاختبار الأدوية قبل السريرية 3.

وقد تم بالفعل نشر عدة بروتوكولات مختلفة للكبد الفئران نضح decellularization 13/04. في جميع البروتوكولات، decellularوقد تحقق سعودة التي نضح من المنظفات الأيونية أو غير الأيونية القلوية عن طريق الوريد البابي مقنى. إلى حد علمنا، كنا المجموعة الأولى أن يقدم الفئران decellularization الكبد عن طريق نضح انتقائية عبر الوريد البابي و / أو الفئران الشريان الكبدي 14. تمكين نضح الانتقائي للأنظمة الأوعية الدموية المختلفة في الكبد قد تمكن النتائج decellularization أفضل وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دورا هاما في إعادة تعمير الخلوية.

في دراسة مفصلة هنا، تم perfused لكبد في جهاز نضح الملكية حسب الطلب، مما نضح تحت ظروف الضغط تتأرجح. هذه الشروط ضغط تحاكي نضح الجهاز التنفسي التي تعتمد فيزيولوجي الكبد: في الوضع الطبيعي، توقف الكبد تحت حباك من الحجاب الحاجز، الذي تنقل خلال التنفس لديها تأثير مباشر على نضح الكبد. إلهام يؤدي خصيصا لتخفيض الضغط على الحجاب الحاجز والكبد، وتحسينأمراض الكبد وريدي تدفق، في حين انقضاء يؤدي إلى ارتفاع في الكبد وخفض الضغط داخل البطن لتحسين تدفق بوابة الوريدي 15.

كان هدفنا لتقييم ما إذا كانت تتأرجح ظروف الضغط يكون لها تأثير على تجانس كبد الفئران نضح decellularization عن طريق محاكاة الظروف داخل البطن خارج الحي. تجانس عملية decellularization قد يكون عاملا في التقليل من نضح decellularization. جميع مواد معروفة تستخدم لdecellularization الكبد سبب تعديلات على ECM. تبقى الخلايا في المناطق ضعيفة perfused لداخل ECM، في حين أن مناطق أخرى هي بالفعل decellularized تماما. لإذابة الخلايا المتبقية، يجب أن تكون مرتفعة مدة نضح أو ضغط، مما تسبب في مزيد من التعديلات على المناطق perfused لجيدا. وبالتالي، منظفات للdecellularization ينبغي توزيع متجانس داخل الجهاز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بقيت الحيوانات في مرفق للطب التجريبي (FEM، شاريتيه في برلين، ألمانيا)، وأعيد النظر في جميع البروتوكولات التجريبية والتي وافق عليها مكتب الدولة لشؤون الصحة والمحلية (LAGeSo، برلين، ألمانيا؛ ريج رقم O 0365 / 11).

حصاد 1. الكبد

  1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية
    1. استخدام لوحة الفلين لتثبيت. وضع الستارة الطبية على لوحة. باستخدام أربعة الإبر، وإصلاح قناع استنشاق على لوحة الفلين لاستنشاق أثناء العملية الخدر.
  2. بترتيب مسبق من بوابة ريدي قنية
    1. توصيل القسطرة الوريدية الطرفية (G 20) إلى محبس ثلاثي. يجب أن تقطع القسطرة الوريدية بشكل غير مباشر، ويبلغ طوله تقريبا. 1.5 سم.
    2. دي الهواء النظام باستخدام حقنة 10 مل مليئة حل قارع الأجراس. من المهم جدا أن بعناية إزالة الهواء بسبب الانسداد الغاز قد يؤثر سلبا على decellularization الارواء.
  3. بترتيب مسبقلالشرياني قنية
    1. استخدام قنية فراشة وقطع إبرة يصل طولها إلى 5 ملم. تناسب 5 سم أنبوب (ID 0.58 مم؛ OD 0.96 مم) إلى 5 ملم إبرة واصلاحها مع superglue. ادخال انبوب 2 سم طويلة (ID 0.28 مم؛ OD 0.61 مم) في أنبوب أكبر واصلاحها مع superglue.
    2. تنزلق أنبوب آخر عبر هذا البناء باعتبارها الدعامة واصلاحها مع superglue. دي الهواء قنية الشرايين مع حقنة 5 مل مملوءة بمحلول قارع الأجراس.
  4. التخدير وتسكين
    1. حمل الخدر من الفئران في غرفة تحريض التخدير بنسبة 3.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة.
    2. لضمان تسكين آمنة خلال العملية، وضخ metamizol (100 ملغ / كغ كتلة الجسم) وجرعة منخفضة من الكيتامين / medetomidine (10 ملغ / 0.1 ملغ لكل كيلوغرام كتلة الجسم) البريتونى.
    3. توريد 1.5٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة الأكسجين عبر قناع استنشاق للصيانة لاحقة من التخدير الجراحي.
  5. ترتيبات ما قبل التنفيذ <رأ>
  6. حلق البطن تحرري مع آلة القص الكهربائية. بلل موقع شق حلق على البطن مع الايثانول 70٪ لتعقيم.
  7. وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة مستعدة، أدخل رأسه في قناع استنشاق وتحديد أطرافه بشريط طبي والدبابيس. إزالة الايثانول الزائدة والفراء مع ضغط الشاش.
  • تقييم التخدير
    1. تقييم عمق التخدير من خلال مشاهدة معدل التنفس. عندما يبدو أن التخدير العميق بما فيه الكفاية (40-60 الأنفاس / دقيقة)، وتحقق ما إذا كان تسكين كافية من خلال محاولة لتحريك منعكس قرصة أخمص قدميه باستخدام ملقط جراحي لقرصة الجلد بين أصابع كل من أطرافه الخلفية.
  • نهج البطن
    1. جعل شق متوسط ​​في جدار البطن الذيلية فوق المثانة. قطع من هذه النقطة إلى كل من الأقواس الجانبية الساحلية بطريقة شكل حرف V. الحرص على عدم قطع في الحجاب الحاجز. سحب جدار البطن قطع على صدره. إصلاح الخنجري مع المشبك overholt، تسحبه cranially واصلاحها مع الشريط المطاطي. استخدام قطعة قطن مبللة لإخلاء الأمعاء. التفاف الأمعاء في ضمادة الشاش المبللة. وعلاوة على ذلك، تغطي جميع هامش البطن مع ضمادات مبللة.
  • إعداد الكبد
    1. تشريح الرباط المنجلي. استخدام ضمادة الشاش المبللة لعقد فصوص الكبد وسطي وترك cranially تحت قبة الحجاب الحاجز. فضح الرباط الكبدي الإثناعشري والفص العلوي الكبد ثربية.
    2. استخدام اثنين من microforceps ومقص الربيع لتشريح بعناية في الرباط التي تعلق على الفص العلوي ثربية حتى الفص هو المحمول. تحريك الفص باستخدام قطعة قطن مبللة تحت ضغط الشاش، وعقد الفصوص وسطي وتترك في مكان.
    3. بعد تعبئة العلوي الفص الكبد ثربية، تحريك المعدة إلى اليسار. إصلاح المعدة مع المشبك وتشريح الثرب طفيفة مع microforceps ومقص الربيع.
    4. تعبئة أقل ثروبل الفص الكبد حتى يتم المحمول، وبعد ذلك نقل الفص الخلفي في تجويف لها. استخدام المشبك باكهاوس الإبقاء على الاثني عشر. نقل الاثني عشر إلى اليسار لتمتد وفضح الرباط الكبدي الإثناعشري. تطويق القناة الصفراوية المشتركة في الرباط الكبدي الإثناعشري تمدد.
    5. تشريح القناة الصفراوية من الدهنية والأنسجة البنكرياس. قطع القناة الصفراوية 1.5 سم من التشعب القناة الصفراوية. تشريح الوريد البابي من الأنسجة الدهنية المحيطة بها. فضح الوريد معدي.
    6. Ligate الوريد معدي مرتين مع الحرير 6-0 وتقسيم الوريد بين الحروف المركبة 2. تشريح الجذع الاضطرابات الهضمية والشريان الكبدي شيوعا من الأنسجة المحيطة بها حتى يتم الكشف عن رامي الشرايين.
    7. تحرير الشريان معدي من الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان معدي مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان معدي بين الحروف المركبة 2.
    8. تحرير الشريان الطحالمن الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان الطحال مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان الطحال بين الحروف المركبة 2.
    9. تحرير الشريان المعدي الأيسر من الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان المعدي الأيسر مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان بين الحروف المركبة 2.
    10. تطويق الوريد الأجوف السفلي بين الكلية اليمنى واليسرى الفص الجانبي الكبد. تشريح الوريد من الفضاء خلف الصفاق. فضح الشريان الأورطي عن طريق اتباع الجذع الاضطرابات الهضمية.
    11. تشريح الأنسجة الدهنية خلف الصفاق. حقن الهيبارين 1000 IE في 1 مل المالحة في الوريد الأجوف السفلي. سحب قنية وإغلاق شق مع وسادة من القطن. الانتظار 1-2 دقائق للتأثير النظامية الهيبارين.
    12. تطويق الشريان الأورطي بالملقط. تشريح الشريان الأورطي ويستنزف الفئران. وعلاوة على ذلك، تشريح الوريد الأجوف السفلي بشكل أقصى من الكلى.
  • بوابة ريدي كيفية تركيب الكانيولا (استخدام قنية أعدت في القسم 1.2)
    1. جعل شق الأسماك الفم في الوريد البابي البعيدة. فتح شق مع ملقط ويقني؛ يدخل القنية الوريد البابي. مسح الكبد مع 20 مل قارع الأجراس حل حتى decolorizes الكبد وإصلاح قنية مع الحروف المركبة (الحرير 6-0).
  • الشرياني كيفية تركيب الكانيولا (استخدام قنية أعدت في القسم 1.3)
    1. تشريح الشريان الأبهر فوق الجذع الاضطرابات الهضمية. تحرير قطاع الشريان الأورطي من الفضاء خلف الصفاق. قطع الجزء الشريان الأورطي طوليا لتوليد التصحيح الأبهر. إدراج قنية يتم بناؤه ذاتيا إلى حامل ثابت.
    2. استخدام 2 ملقط لتنزلق التصحيح الأبهر خلال قنية. Ligate الشريان الكبدي مع الحرير 6-0 على قنية وإصلاح التصحيح في دعمة.
  • Explantation الكبد
    1. فتح الحجاب الحاجز، وجعل شق دائري وتشريح الكبد من الهياكل المحيطة بها.
  • تخزين
    1. ستوإعادة الكبد في العقيمة دبابة 500 مل مليئة 350 مل قارع الأجراس حل حتى الاستخدام.
  • 2. حلول منظفات

    1. 10٪ محلول تريتون X-100 الأوراق المالية
      1. ملء زجاجة 1000 مل مع 900 مل ماء مقطر. وإضافة 100 مل تريتون X-100 (99،9٪). استخدام النمام بحل تريتون X-100. ملء زجاجة مع ماء مقطر. حتى بلغ حجم التداول الإجمالي ل1000 مل يتم التوصل إليه.
    2. 1٪ تريتون X-100
      1. إضافة 100 مل من محلول المخزون (10٪) لزجاجة 1000 مل. إضافة 900 مل ماء مقطر. ويهز زجاجة مرتين. تصفية 1٪ تريتون X-100 حل من خلال تصفية العقيمة.
    3. 10٪ SDS محلول المخزون
      1. ملء زجاجة 1000 مل مع 900 مل ماء مقطر. وإضافة 66.99 ز SDS (99.9٪، والكثافة 0،67). استخدام النمام إلى حل SDS. ملء زجاجة مع ماء مقطر. حتى بلغ حجم التداول الإجمالي ل1000 مل يتم التوصل إليه.
    4. 1٪ SDS
      1. إضافة 100 مل من محلول المخزون (10٪) لبوت 1000 ملTLE. إضافة 900 مل ماء مقطر. ويهز زجاجة مرتين. تصفية 1٪ SDS الحل من خلال تصفية العقيمة.

    3. Decellularization

    1. انشاء التروية الأجهزة الشكل 1

    الشكل 1: مخطط الجهاز الإرواء عن الانتقائية الشرياني والوريدي بوابة الإرواء من أربعة الأكباد الجرذ تحت ظروف الضغط تتأرجح (. معدلة من Struecker وآخرون 14)

    1. ربط هجرة إلى محبس ثلاثي وتمديد هايدلبيرغر لتنظيم مستوى التعبئة والتعبئة المفاعل مع 500 مل 0،9٪ كلوريد الصوديوم.
      الرقم 2

    الشكل 2: مخطط نضح انشاء ربط غرفة التروية (1400 سم 3) (1) إلى نهاية البعيدة (4) من فخ فقاعة (5) عن طريق وصول الوريدي البابي (2) أو عن طريق تيار الدمسيس (3). يجب أن تكون مجهزة فخ فقاعة (5) مع سد (4) في نهاية القاصي وتنفيس (6). ربط فخ فقاعة (5) على تمديد هايدلبيرغر (7). ربط تمديد هايدلبيرغر إلى الجزء مضخة (8). وعلاوة على ذلك، ربط الجزء مضخة (8) لتمديد هايدلبيرغر آخر (9). إدراج تمديد هايدلبيرغر الماضي (9) في زجاجة محلول منظف (10). توصيل جهاز التنفس الصناعي (11) إلى غرفة نضح (أو إلى الموزع الضغط في حالة perfusions متعددة). لاستنزاف السوائل المفاعل، وربط التدفقات إلى زجاجة النفايات (12).

    1. إدراج شريحة مضخة إلى المضخة. بدء تشغيل المضخة لملء دورة مع PBS، إغلاق نهاية البعيدة للفخ فقاعة وفتح تنفيس. عندما يتم تغطية الجزء السفلي من فقاعة آمن مع PBS (2-3 سم)، وإغلاق تنفيس وفتح النهاية البعيدة من فخ فقاعة.
    2. تركيب الكبد
      1. ربط ثلاثي محبس للقنية الوريد البابي إلى الوصول مفاعل ذات الصلة. Connect قنية الشرياني إلى الوصول الشرايين. كن حذرا لضمان عدم وجود الهواء يدخل الأنظمة.
    3. تطبيق الشروط ضغط تتأرجح
      1. استخدام جهاز التنفس الصناعي مع تردد من 15 نبضة في الدقيقة وسعة 26 ملي بار (دقيقة. 4 م بار، كحد أقصى. 30 مليبار). توصيل جهاز التنفس الصناعي لغرفة توزيع الضغط وربط غرفة للمفاعل. بدء تطبيق الضغط.
    4. بروتوكول Decellularization
      1. تنفيذ الخطوات نضح بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة. بدء decellularization مع نضح من الكبد مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 90 دقيقة. السماح دفق النفايات عبر تدفق الجهاز نضح للحفاظ على مستوى السوائل داخل ثابتة غرفة نضح وفوق الكبد perfused ل. بعد 90 دقيقة، وتغيير المنظفات ل1٪ SDS.
        الشكل (3)
        الجدول 1
    <P> الشكل (3): بروتوكول الإرواء لجميع المجموعات التجريبية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    تم تقييم تجانس وبالتالي فعالية بروتوكولات decellularization مختلفة عن طريق الملاحظة العيانية، التحليل النسيجي، وتحليل محتوى الحمض النووي المتبقية ضمن مصفوفات الكبد decellularized. وعلاوة على ذلك، تم إجراء التآكل الصب لتصور التشريح المجهري سليمة من كبد بعد decellularization.

    الفحص العياني

    خلال decellularization، كبد تصبح لوسنت، مما يدل على إزالة المحتوى الخلوي. وأظهرت الكبد perfused لعن طريق الوريد البابي توضيح غير متجانس (وبالتالي decellularization)، مع الخلايا المرئية ظاهريا المتبقية أثناء وبعد decellularization (السهام البيضاء). وأظهرت الكبد perfused لعن طريق الشريان الكبدي دورة decellularization أكثر تجانسا وليس الخلايا المرئية المتبقية. إذا كانت perfused لكبد مع تطبيق شروط الضغط تتأرجح، لم تكن هناك الخلايا المتبقية مرئية، بغض النظر عن الطريق الارواء.

    الرقم 4
    الرقم 4: النتائج العيانية الجرذ الكبد Decellularization دون تتأرجح ظروف الضغط. اليسار: كبد الفئران decellularized عن طريق الشريان الكبدي. يظهر الكبد لوسنت، دون الخلايا المرئية ظاهريا المتبقية. اليمين: الكبد perfused لعن طريق الوريد البابي. يبدو الكبد decellularized inhomogeneously، مع الخلايا المرئية ظاهريا

    الرقم 5
    الشكل 5: نتائج العيانية الفئران decellularization الكبد تحت ظروف الضغط تتأرجح. اليسار: كبد الفئران decellularized عن طريق الشريان الكبدي. اليمين: الكبد perfused لعن طريق الوريد البابي. لكل من الأكباد تظهر لوسنت، دون الخلايا المرئية المتبقية.

    التقييم النسيجي

    التقييم النسيجي للdecellularized دعم المصفوفات الكبدإد النتائج العيانية. وأظهرت الكبد perfused لعن طريق الشريان الكبدي أي الخلايا المتبقية، بغض النظر عما إذا كانوا perfused لتحت ظروف الضغط تتأرجح. وأظهرت الكبد perfused لعن طريق الوريد البابي مناطق الخلايا المتبقية، حتى لو كانوا مع perfused تطبيق شروط الضغط تتأرجح. ومع ذلك، خفضت تطبيق شروط الضغط تتأرجح كتلة الخلايا المتبقية في الكبد perfused لعن طريق الوريد البابي. تم الحفاظ على ECM للكبد، دون فروق واضحة في جميع البروتوكولات المطبقة.

    الشكل (6)

    الشكل 6: H / E تلطيخ من Decellularized الكبد المصفوفات. AP: مصفوفة الكبد Decellularized perfused لعن طريق الشريان الكبدي دون تتأرجح ظروف الضغط. A + P: مصفوفة الكبد Decellularized perfused لعن طريق الشريان الكبدي تحت ظروف الضغط تتأرجح. PA-P: Decellularized MATR الكبدتاسعا perfused لعن طريق الوريد البابي دون تتأرجح ظروف الضغط. PA + P: مصفوفة الكبد Decellularized perfused لعن طريق الوريد البابي تحت ظروف الضغط تتأرجح. سهام: المتبقي مجموعات الخلايا.

    محتوى الحمض النووي

    محتوى DNA في الوزن الجاف للمصفوفة الكبد انخفض في كل المجموعات التجريبية مقارنة مع أنه في كبد الأم، على الرغم من أن الاختلافات كانت فقط ذات دلالة إحصائية في المجموعات perfused لفي ظل ظروف تتأرجح الضغط (PV + P؛ A + P). تم العثور على أدنى كمية DNA في الوزن الجاف في كبد perfused لعن طريق الشريان الكبدي تحت تتأرجح ظروف الضغط.

    الرقم 7

    الرقم 7: DNA المحتوى لكل الوزن الجاف للمصفوفة الكبد (معدلة من Struecker وآخرون 14). كبد decellularized عن طريق الشريان الكبدي عرض أقل DNA المتبقي من تلك التي يرويد عن طريق الوريد البابي القيام به. الكبد perfused لتحت ظروف الضغط تتأرجح تظهر DNA أقل المتبقية من تلك decellularized دون هذه الظروف القيام به. وبالتالي، الكبد perfused لعن طريق الشريان الكبدي تحت ظروف الضغط تتأرجح تظهر أقل محتوى الحمض النووي المتبقية.

    التآكل الصب

    وأكد التآكل الصب من المصفوفات الكبد decellularized أن التشريح المجهري للكبد (بما في ذلك الإطار البروتين في الجهاز الوريدي البابي، ونظام الشرايين والقنوات الصفراوية) وحفظها خلال decellularization.

    الرقم 8
    الشكل 8: صورة لصب التآكل من Decellularized الجرذ الكبد مصفوفة (معدلة من Struecker وآخرون 14). على الرغم من إزالة جميع الخلايا، والتشريح المجهري للجهاز، بما في ذلك الأوردة البوابة (الأزرق)، ونظم الشرايين (الحمراء)، وحفظها. وريماومحمل فروع ining الرئيسية للنظام الصفراوي باللون الأصفر.

    الجدول 1
    الجدول 1: المجموعات التجريبية لتقييم تأثير ظروف الضغط تتأرجح والطريق الإرواء على الجرذ الكبد Decellularization.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    على الرغم من أن هذه التقنية المقدمة للحصاد كبد الفئران وdecellularization هي استنساخه بسهولة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة للنظر:

    أثناء التحضير للحصاد الكبد، فمن المهم تجنب نزيف حاد لأنه سيتم تنشيط تجلط الدم ويمكن أن يؤدي إلى تشكل جلطة دموية داخل الكبد. في رأينا، فإنه من المفيد أن شق الشريان الأورطي البطني مباشرة قبل إقناء؛ إدخال القنية من الوريد البابي لتجنب تدفق الدم عبر الشريان الكبدي خلال نضح عبر الوريد البابي. بمجرد مقنى الكبد وperfused لبوضوح، تشكل جلطة دموية لم يعد قضية.

    بعد الحصاد الكبد والنقل إلى جهاز نضح، اتصال من كبد إلى جهاز نضح هو خطوة حاسمة خاصة بسبب دخول فقاعات الغاز في دائرة نضح يجب تجنبها لمنع الانسداد الغاز. ومن المفيد أن ملء مسبق للثلاثي صمام، وأناليالي متصلة قنية الكبد، مع PBS باستخدام حقنة وقنية رقيقة مباشرة قبل توصيل صمام لنظام الارواء.

    بعد إنشاء نضح، ما إذا كانت جميع وصلات الأنابيب، ثلاثي ترتبط الصمامات والأنابيب تماما يجب إعادة فحص. إذا و perfused كبد لفترات أطول (على سبيل المثال، O / N)، حتى خطأ صغير في اتصال يمكن أن يؤدي إلى الهواء يضخ في النظام نضح، مما يؤدي إلى نتائج نضح قاتلة.

    والبيانات المقدمة محدودة بسبب حقيقة أن الضغط الأمثل وتيرة تغيرات الضغط تتأرجح للحصول على أفضل النتائج decellularization تزال غير واضحة. وعلاوة على ذلك، الضغط التي تسيطر عليها نضح قد يؤدي إلى نتائج أفضل وأكثر استقرارا مما كان يسيطر تدفق نضح لا. نضح التي تسيطر عليها ضغط يمكن تطبيق بروتوكول نضح واحد لكبد من مختلف الأحجام والأوزان، وبنفس النتيجة، لأنه سوف تدفق تلقائيا بالبريد تكييفها.

    الشريان الكبدي والوريد البابي تختلف اختلافا كبيرا من حيث الحجم ومعدلات تدفق الفسيولوجية. وبالتالي، فإن معدل نضح ثابت (5 مل / دقيقة) يؤدي بالتأكيد في الضغوط نضح مختلفة داخل النظامين الأوعية الدموية. وبالمثل، فإن ضغط التروية المستمر يؤدي إلى معدلات التروية مختلفة. وثمة طريقة واحدة لمقارنة فعالية decellularization عبر الطرق نضح اثنين يكون لأداء نضح في نضح الضغوط الفسيولوجية أو معدلات التروية عن طريق كلا الطريقين. ومع ذلك، لجعل نتائج قابلة للمقارنة في الدراسة الحالية، اخترنا معدل نضح المستمر لكلا الطريقين. لسوء الحظ، وذلك باستخدام جهاز لدينا، ونحن لم نكن قادرين على قياس ضغط التروية داخل الكبد perfused ل.

    لدينا أجهزة نضح الجيل القادم سوف يكون أصغر لتقليل كمية من وسائل الاعلام نضح اللازم. وعلاوة على ذلك، سيمكن الأجهزة مضخة الضغط التي تسيطر عليها نضح.

    عشريبدو ه قدمت تقنية مفيدة جدا لاستنساخه، متجانسة decellularization كبد الفئران. إذا كانت التقنية المقدمة مناسبة لrecellularization ونضوج الجهاز في المختبر لابد من مزيد من المعالجة. سواء تتأرجح ظروف الضغط يكون لها تأثير على خلايا إسكانها سيكون موضوعا للمزيد من التجارب.

    تقنية عرض أكثر تطورا من غيرها من الأجهزة نضح كبد الفئران ويظهر عدة مزايا واضحة: 1) decellularization متجانس هو تكرار لل، مع نتائج جيدة عندما يتم تطبيق تتأرجح ظروف الضغط. 2) وختم جهاز نضح وتمكن decellularization العقيمة، الذي هو شرط أساسي لإعادة تعمير مصفوفة ونضح على المدى الطويل. 3) بروتوكول المعروضة أقصر من البروتوكولات الأخرى المنشورة ولكن لا تزال فعالة للغاية. 4) نضح الانتقائي للالوريد البابي والشريان الكبدي يجعل إعادة تعمير الخلايا انتقائية عبر الأنظمة المختلفة ممكن،والذي قد يكون أداة هامة.

    سيتم تطبيق جهاز نضح في مزيد من التجارب decellularization لصقل وتحسين الفئران decellularization الكبد. تأثير الضغوط التي تسيطر عليها نضح سيتم تقييم التجربة ومقارنة مع التي تسيطر عليها تدفق نضح. إضافة عناصر أخرى (على سبيل المثال، "وحدة غسيل الكلى"، مبادل حراري، وهو مكساج) لإعادة تعمير والثقافة ونضوج التجارب تظهر الممكنة والمعقولة لمواصلة تطوير جهاز عرض.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics