נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה 1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה ​​הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה ​​זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic 2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה 3.

כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו 4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד 14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי.

במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים 15.

המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי חיים הוחזקו במתקן לרפואה ניסויית (FEM, Charité, ברלין, גרמניה), ואת כל פרוטוקולי הניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי משרד המדינה לענייני בריאות ומקומי (LAGeSo, ברלין, גרמניה;. רג O מס '0365 / 11).

קציר 1. כבד

  1. הכנה טרום ניתוחית
    1. השתמש בצלחת פקק לקיבעון. שים וילון רפואי על הצלחת. באמצעות ארבע מחטים, לתקן מסכת משאיפת על צלחת הפקק להרדמת משאיפת במהלך ניתוח.
  2. סידור מכוון של פורטל ורידי הצינורית
    1. חבר צנתר ורידים היקפי (G-20) לברזלי שלוש-דרך. צנתר הוורידים יש לחתוך באלכסון, באורך של כ. 1.5 סנטימטר.
    2. דה-אוויר למערכת באמצעות מזרק 10 מיליליטר מלא פתרון רינגר. זה מאוד חשוב לזהירות דה-האוויר כי תסחיף גז עלול להשפיע לרעה על decellularization זלוף.
  3. סידור מכווןשל צינורית העורקים
    1. השתמש צינורית פרפר ולחתוך את המחט לאורך של 5 מ"מ. להתאים צינור 5 סנטימטר (ID 0.58 מ"מ; OD 0.96 מ"מ) למחט 5 מ"מ ולתקן את זה עם דבק מגע. הכנס צינור 2 ס"מ ארוך (ID 0.28 מ"מ; 0.61 מ"מ OD) לתוך הצינור הגדול ולתקן את זה עם דבק מגע.
    2. להחליק צינור אחר על בנייה זו כבסיס גשר ולתקן את זה עם דבק מגע. דה-אוויר צינורית העורקים עם מזרק 5 מיליליטר מלא פתרון רינגר.
  4. הרדמה ושיכוך כאבים
    1. לגרום להרדמה של החולדה בחדר האינדוקציה ההרדמה על ידי isoflurane 3.5% בחמצן בקצב זרימה של 1.5 ליטר / דקה.
    2. כדי להבטיח שיכוך כאבים בטוחים במהלך המבצע, להזריק metamizol (100 מ"ג / קילוגרם מסת גוף) וקטמין במינון נמוך / medetomidine (10 מ"ג / 0.1 מ"ג לכל קילוגרם מסת גוף) intraperitoneally.
    3. לספק isoflurane 1.5% בחמצן / דקה 1 ליטר באמצעות מסכת משאיפת לתחזוקה הבאה של הרדמה כירורגית.
  5. הסדרים לפני ניתוח <ol>
  6. לגלח את הבטן בנדיבות עם מכונה גז חשמלית. להרטיב את אתר החתך המגולח בבטן עם אתנול 70% לחיטוי.
  7. מניחים את החיה במצב שכיבה על הצלחת מוכנה, להכניס את הראש לתוך מסכת משאיפת ולתקן את הגפיים עם קלטת רפואית וסיכות. הסר אתנול ופרווה עודפים עם תחבושות.
  • הערכת הרדמה
    1. להעריך את עומק ההרדמה על ידי צפייה בקצב הנשימה. כאשר ההרדמה נראית עמוקה מספיק (40-60 נשימות / דקה), לבדוק אם כאבים די בניסיון לעורר את רפלקס קמצוץ הבוהן באמצעות מלקחיים כירורגיים לצבוט את העור בין האצבעות של שני גפיים האחוריות.
  • גישת בטן
    1. לעשות חתך החציוני בקיר בטן הזנב מעל שלפוחית ​​השתן. לחתוך מנקודה זו לשתי קשתות costal הרוחב באופן בצורת V. יש להיזהר שלא לחתוך לסרעפת. משוך את דופן הבטן לחתוך מעל החזה. תקן את xiphoid עם מהדק אוברהולט, למשוך אותו cranially ולתקן את זה עם גומייה. השתמש צמר גפן רטוב לפנות את המעי. לעטוף את המעי בתחבושת גזה רטובה. יתר על כן, לכסות את כל השוליים הבטן עם תחבושות רטובות.
  • כבד הכנה
    1. לנתח את רצועת falciform. השתמש בתחבושת גזה רטובה כדי להחזיק את האונה של הכבד המדיאלי ועזבה cranially מתחת לכיפה של הסרעפת. לחשוף את רצועת hepatoduodenal ואונת כבד omental העליונה.
    2. השתמש בשני microforceps ומספריים באביב כדי לנתח בזהירות את הרצועה הצמודה לאונה העליונה omental עד האונה היא ניידת. הזז את האונה באמצעות צמר גפן רטוב מתחת לתחבושות, מחזיק אונות המדיאלי והשאירו במקום.
    3. לאחר הגיוס של אונת כבד omental העליונה, להעביר את הבטן בצד השמאל. תקן את הבטן עם מהדק ולנתח את omentum הקטין עם microforceps והמספריים באביב.
    4. לגייס את omenta הנמוךl אונת כבד עד שהוא נייד ולאחר מכן להעביר את האונה אחורית לתוך החלל שלה. השתמש מהדק בקהאוס כדי לשמר את תריסריון. הזז את תריסריון לשמאל כדי למתוח ולחשוף את רצועת hepatoduodenal. להותיר את צינור מרה המשותף ברצועת hepatoduodenal המתוחה.
    5. לנתח את צינור המרה מהשומן ורקמת לבלב. חותך את צינור המרה של 1.5 סנטימטר מהסתעפות צינור מרה. לנתח את וריד השער מרקמת השומן שמסביב. לחשוף את וריד gastroduodenal.
    6. לקשור את וריד gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0 ולחלק את הווריד בין 2 חיבורי האותיות. לנתח את תא מטען צליאק ועורק כבד הנפוץ מן הרקמה הסובבת עד שכל רמי העורקים מתגלים.
    7. לשחרר את עורק gastroduodenal מן הרקמה הסובבת. לקשור את עורק gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק gastroduodenal בין 2 חיבורי האותיות.
    8. לשחרר את עורק הטחולמהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הטחול פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק הטחול בין 2 חיבורי האותיות.
    9. לשחרר את עורק הקיבה שמאל מהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הקיבה שמאל פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את העורק בין 2 חיבורי האותיות.
    10. להותיר את וריד caval הנחות בין הכליה הימנית ואונת כבד לרוחב הנכונה. לנתח את הווריד מהחלל retroperitoneal. לחשוף את אב העורקים על ידי הבא לתא מטען צליאק.
    11. לנתח את רקמת שומן retroperitoneal. הזרק 1,000 הפרין IE מלוחים 1 מיליליטר לווריד הנבוב הנחות. לחזור הצינורית ולסגור את החתך עם צמר גפן. חכה 1-2 דקות להשפעה המערכתית של הפרין.
    12. להותיר את אב העורקים עם מלקחיים. לנתח את אב העורקים ולגרום לדימום מחודש החולדה. יתר על כן, לנתח את נחות הווריד הנבוב distally מהכליות.
  • פורטל הוורידים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.2)
    1. לעשות חתך דגים-פה בוריד שער דיסטלי. פתח את החתך עם מלקחיים וcannulate וריד השער. לשטוף את הכבד עם 20 מיליליטר פתרון רינגר עד decolorizes הכבד ולתקן את הצינורית עם חיבורי אותיות (משי 6-0).
  • העורקים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.3)
    1. לנתח את אב העורקים מעל תא מטען צליאק. לשחרר את קטע אב העורקים מהחלל retroperitoneal. חותך את קטע אב העורקים longitudinally ליצור תיקון אב העורקים. הכנס את הצינורית העצמית בנויות לבעל סטטי.
    2. השתמש 2 מלקחיים כדי להחליק את תיקון אב העורקים על הצינורית. ולקשור את העורק הכבד עם משי 6-0 על הצינורית ולתקן את התיקון בירכה.
  • Explantation כבד
    1. פתח את הסרעפת, לעשות חתך עגול ולנתח את הכבד מהמבנים הסמוכים.
  • אחסון
    1. סטהמחדש את הכבד במכל 500 מיליליטר סטרילי המלא 350 מיליליטר פתרון רינגר עד לשימוש.
  • 2. פתרונות דטרגנט

    1. 10% מניות פתרון Triton X-100
      1. מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף 100 מיליליטר Triton X-100 (99,9%). השתמש בוחש לפזר את טריטון X-100. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע.
    2. 1% Triton X-100
      1. להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבקבוק 1,000 מיליליטר. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% דרך פילטר סטרילי פתרון Triton X-100.
    3. 10% SDS פתרון במלאי
      1. מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף SDS 66.99 גרם (99.9%, צפיפות 0.67). השתמש בוחש לפזר את SDS. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע.
    4. 1% SDS
      1. להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבוט 1,000 מיליליטרייתכנו. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% SDS הפתרון דרך פילטר סטרילי.

    3. Decellularization

    1. הגדרה של התקן זלוף איור 1

    איור 1:. תכנית של התקן זלוף לסלקטיבי עורקים וורידי הפורטל זלוף של כבדי עכברוש ארבעה תחת תנאי לחץ נדנוד (. שונה מן et al Struecker 14)

    1. קישור לטמיון לברזלי שלוש-דרך והארכת Heidelberger להסדיר את רמת מילוי וממלא את הכור עם 500 מיליליטר 0,9% NaCl.
      איור 2

    איור 2:. תכנית של הגדרת זלוף קישור תא זלוף (1,400 סנטימטר 3) (1) לקצה הדיסטלי (4) למלכודת הבועה (5) דרך גישת ורידי הפורטל (2) או באמצעות AC העורקיםסס (3). מלכודת הבועה (5) צריכה להיות מצוידת בחֲסִימָה (4) בקצה הדיסטלי ואוורור (6). חבר את מלכודת הבועה (5) להארכת Heidelberger (7). קישור הארכת Heidelberger למגזר המשאבה (8). יתר על כן, לחבר את קטע המשאבה (8) לעוד ארכה Heidelberger (9). הכנס את ההארכה האחרונה Heidelberger (9) לבקבוק של תמיסת ניקוי (10). חבר את הנשמה (11) לתא זלוף (או למפיץ הלחץ במקרה של זילופים מרובים). כדי לנקז את נוזלי הכור, לחבר את יצוא לבקבוק פסולת (12).

    1. הכנס את קטע המשאבה למשאבה. התחל המשאבה כדי למלא את המחזור עם PBS, לסגור את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה ולפתוח את פתח האוורור. כאשר החלק התחתון של הבועה מכוסה היטב עם PBS (2-3 סנטימטר), לסגור את פתח האוורור ולפתוח את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה.
    2. התקנה כבד
      1. קישור הסתום המשולש של צינורית וריד שער לגישת כור בנושא. גonnect צינורית העורקים לגישת העורקים. להיות זהיר כדי להבטיח שאף אוויר נכנס למערכות.
    3. יישום של תנאי לחץ נדנוד
      1. השתמש הנשמה בתדירות של 15 פעימות לדקה ומשרעת של 26 mbar (דקות. 4 mbar, מקסימום. 30 mbar). חבר את מכשיר ההנשמה לתא לחץ ההפצה ולחבר את התא לכור. התחל יישום לחץ.
    4. פרוטוקול decellularization
      1. בצע את השלבים זלוף עם קצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה. התחל decellularization עם טפטוף של הכבד עם 1% Triton X-100 למשך 90 דקות. לאפשר הזרמת שפכים באמצעות יצוא של מכשיר זלוף ולהשאיר את הנוזל בתוך מתמיד תא זלוף ומעל כבד perfused. לאחר 90 דקות, לשנות את חומר הניקוי ל1% SDS.
        איור 3
        טבלת 1
    <p> איור 3: זלוף פרוטוקול לכל קבוצות הניסוי.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    הומוגניות ובכך את האפקטיביות של פרוטוקולי decellularization שונים הוערכו על ידי התבוננות מקרוסקופית, ניתוח היסטולוגית, וניתוח של תוכן ה- DNA שנותר בתוך מטריצות כבד decellularized. יתר על כן, ליהוק קורוזיה בוצע לדמיין microanatomy שלם של כבדים לאחר decellularization.

    Macroscopy

    במהלך decellularization, הכבדים הפכו לוסנט, המציינים את הסרת התוכן סלולארי. כבדי perfused דרך וריד הפורטל הראה הבהרת הומוגניות (ובכך decellularization), עם תאים הנותרים macroscopically גלויים במהלך ואחרי decellularization (חצים לבנים). כבדי perfused דרך העורק הכבד הראה כמובן decellularization הומוגנית יותר ולא תאים שנותרו גלויים. אם כבד היה perfused עם היישום של תנאי לחץ נדנוד, לא תאים הנותרים היו גלויים, ללא קשר למסלול זלוף.

    איור 4
    איור 4: תוצאות מקרוסקופית של העכברוש הכבד Decellularization בלי נדנוד תנאי לחץ. משמאל: כבד החולדה decellularized באמצעות העורק הכבד. הכבד מופיע לוסנט, ללא תאים הנותרים macroscopically גלויים. מימין: כבד perfused דרך וריד הפורטל. הכבד מופיע inhomogeneously decellularized, עם תאי macroscopically גלויים

    איור 5
    איור 5: תוצאות מקרוסקופית של decellularization כבד חולדה בתנאי לחץ נדנוד. משמאל: כבד החולדה decellularized באמצעות העורק הכבד. מימין: כבד perfused דרך וריד הפורטל. שני הכבדים מופיעים לוסנט, ללא תאים הנותרים גלויים.

    הערכה היסטולוגית

    הערכה היסטולוגית של תמיכת מטריצות כבד decellularizedאד הממצאים מקרוסקופיים. כבדי perfused דרך העורק הכבד לא הראו תאים הנותרים, ללא כל קשר אם הם היו perfused בתנאי לחץ נדנוד. כבדי perfused דרך וריד הפורטל הראו אזורים של תאים הנותרים, גם אם הם היו perfused עם היישום של תנאי לחץ נדנוד. עם זאת, היישום של תנאי לחץ נדנוד הפחית את מסת תאים שנותר בכבד perfused דרך וריד הפורטל. ECM של הכבדים היה נשמרת, ללא הבדלים נראים לעין בכל הפרוטוקולים יושמו.

    איור 6

    איור 6: H / E הכתמה של מטריצות כבד decellularized. AP: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך העורק הכבד בלי נדנוד תנאי לחץ. + P: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד. PA-P: decellularized matr כבדix perfused דרך וריד הפורטל ללא נדנוד תנאי לחץ. הרשות הפלסטינית + P: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך וריד הפורטל בתנאי לחץ נדנוד. חיצים: נותרו צבירי תאים.

    תוכן DNA

    תוכן DNA למשקל יבש של מטריצת כבד ירד בכל קבוצות הניסוי בהשוואה לזה בכבד ילידים, אם כי ההבדלים היו משמעותי מבחינה סטטיסטית רק בקבוצות perfused בתנאי נדנוד לחץ (PV + P; + P). הסכום הנמוך ביותר של ה- DNA למשקל יבש נמצא בכבד perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד.

    איור 7

    איור 7: תוכן DNA למשקל יבש של הכבד מטריקס (שונה מStruecker et al 14.). כבדי decellularized באמצעות תכנית העורק הכבד פחות שנותרו DNA מ Perfuse אלהד באמצעות פורטל וריד לעשות. כבדי perfused בתנאי לחץ נדנוד להראות DNA פחות מאלה שנותר decellularized ללא תנאים אלה לעשות. לפיכך, כבדי perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד להראות את תוכן ה- DNA שנותר לפחות.

    יציקת קורוזיה

    ליהוק קורוזיה של מטריצות כבד decellularized אישר כי microanatomy של כבדים (כולל מסגרת החלבון של מערכת ורידי הפורטל, מערכת העורקים ומערכת המרה) נשמרת במהלך decellularization.

    איור 8
    איור 8: תצלום של יציקת קורוזיה של כבד מטריקס עכברוש decellularized (שונה מStruecker et al 14.). למרות ההסרה של כל התאים, microanatomy של האיבר, כוללים ורידי הפורטל (הכחולה) ועורקי מערכות (אדום), נשמר. הרמ"אענפים עיקריים ining של מערכת המרה הם יציקה בצהוב.

    טבלת 1
    טבלת 1: קבוצות ניסוי להערכת ההשפעה של תנאי לחץ נדנוד וכביש זלוף על העכברוש הכבד Decellularization.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול:

    במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתרון לחתוך אב העורקים בבטן ישירות לפני cannulation של וריד השער, כדי למנוע זרימת דם דרך העורק הכבד במהלך זלוף דרך וריד הפורטל. ברגע שהכבד cannulated וperfused ברור, היווצרות קריש דם היא כבר לא בעיה.

    לאחר קצירת כבד ותחבורה למכשיר זלוף, החיבור של כבדים למכשיר זלוף הוא צעד קריטי במיוחד בגלל הכניסה של בועות גז לתוך מעגל זלוף יש להימנע כדי למנוע תסחיף גז. זה שימושי ללמלא מראש את השסתום המשולש, שבו אניs מחובר לצינורית הכבד, עם PBS באמצעות מזרק וצינורית דקה ישירות לפני חיבור השסתום למערכת זלוף.

    לאחר זלוף הוא הוקם, אם כל המחברים הצינור, שלוש דרך שסתומים וצינורות מחוברים בצורה מושלמת צריכה להיות מחדש נבדק. אם כבדים הם perfused במשך תקופות ארוכות (למשל., O / N), אפילו שגיאה קטנה בחיבור יכול להוביל לאוויר שאיבה למערכת זלוף, ובכך מוביל לתוצאות זלוף קטלניות.

    הנתונים שהוצגו מוגבלים על ידי העובדה שהלחץ והתדירות האופטימלי של שינויים בלחץ נדנוד לתוצאות הטובות ביותר decellularization עדיין אינם ברורים. יתר על כן, זלוף-מבוקר לחץ עלול להוביל לתוצאות טובות יותר ויציבים יותר מזלוף-מבוקר זרימה עושה. זלוף-מבוקר לחץ מאפשר היישום של פרוטוקול זלוף אחד לכבדים של גדלים ומשקלים שונים, עם אותה התוצאה, כי הזרימה באופן אוטומטי בדואר מותאם.

    העורק הכבד ווריד שער שונה באופן משמעותי במונחים של גודל וספיקות פיזיולוגיות. לפיכך, שיעור קבוע זלוף (5 מיליליטר / דקה) בהחלט לגרום ללחצי זלוף שונים בתוך שתי מערכות כלי דם. כמו כן, לחץ זלוף קבוע יגרום לשיעורי זלוף שונים. שיטה אחת כדי להשוות את יעילות decellularization באמצעות שני מסלולי זלוף תהיה לבצע זלוף בלחצים פיסיולוגיים זלוף או שיעורי זלוף באמצעות שני המסלולים. עם זאת, על מנת להפוך את התוצאות דומות במחקר הנוכחי, בחרנו שיעור זלוף קבוע לשני המסלולים. למרבה הצער, שימוש במכשיר שלנו, אנחנו לא היו מסוגלים למדוד את לחץ זלוף בתוך כבד perfused.

    מכשירי זלוף הדור הבא שלנו יהיו קטנים יותר כדי למזער את הכמות של תקשורת זלוף ההכרחית. יתר על כן, מכשירי משאבה יאפשר זלוף-מבוקר לחץ.

    הטכניקת דואר הציג מופיעה מאוד שימושית עבור decellularization לשחזור, הומוגנית כבד חולדה. בין אם הטכניקה המוצגת הינה מתאימה לrecellularization והתבגרות איבר במבחנה יש להתייחס נוסף. בין אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על תאים אוכלסו מחדש תהיה נושא של ניסויים נוספים.

    הטכניקה המוצגת הינה מתוחכמת יותר ממכשירי זלוף כבד חולדה אחרים ומציגה מספר יתרונות ברורים: 1) decellularization הומוגנית הוא לשחזור, עם תוצאות טובות כאשר תנאי לחץ נדנוד מיושמים. 2) מכשיר זלוף אטום ומאפשר decellularization סטרילי, שהוא תנאי הכרחי לאכלוס מטריצה ​​וזלוף לטווח ארוך. 3) הפרוטוקול המוצג הנו קצר יותר מפרוטוקולים שפורסמו אחרים אבל עדיין יעיל מאוד. 4) זלוף סלקטיבי של וריד השער והעורק הכבד הופך אכלוס תא בררני באמצעות מערכות שונות אפשרי,אשר עשוי להיות כלי חשוב.

    מכשיר זלוף ייושם בניסויי decellularization נוספים כדי לחדד ולייעל decellularization כבד חולדה. ההשפעה של זלוף-מבוקר לחץ תוערך באופן ניסיוני ולעומת זלוף-מבוקר זרימה. התוספת של אלמנטים נוספים (למשל., "יחידת דיאליזה", מחליף חום, oxygenator) לניסויי אכלוס, תרבות והתבגרות מופיעה אפשרית וסביר לפתח המכשיר שהוצג עוד.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics