एक oscillating दबाव छिड़काव डिवाइस में चूहे यकृत की Decellularization के लिए प्रक्रिया

Bioengineering

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Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

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Abstract

Introduction

Decellularization और recellularization इन विट्रो 1 में कार्यात्मक, transplantable अंगों की पीढ़ी सक्षम हो सकता है। हटाने की कोशिकाओं और प्रतिजनी सामग्री द्वारा (जैसे।, डीएनए, अल्फा-लड़की epitopes) एक अंग से, गैर या कम-immunogenic बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्राप्त किया जा सकता है। इस मैट्रिक्स एक अंग के तीन आयामी microanatomy का संरक्षण और एक अलग, संभवतः xenogeneic मूल 2 की कोशिकाओं के साथ repopulation के लिए आदर्श biomatrix के रूप में सेवा कर सकते हैं। इस प्रकार, एक decellularized चूहा जिगर मैट्रिक्स मानव यकृत कोशिकाओं के साथ repopulated किया जा सकता है। इस humanized सूक्ष्म यकृत रोग (जैसे।, जन्मजात चयापचय रोगों, वायरल रोगों या कैंसर) पर या पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण 3 के लिए अनुसंधान के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में सेवा कर सके।

चूहा जिगर छिड़काव decellularization लिए कई अलग अलग प्रोटोकॉल पहले से ही 4-13 प्रकाशित किया गया है। सभी प्रोटोकॉल में, decellularization cannulated पोर्टल शिरा के माध्यम से क्षारीय आयनिक या गैर ईओण डिटर्जेंट के छिड़काव द्वारा प्राप्त किया गया था। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हम पोर्टल शिरा और / या चूहा यकृत धमनी 14 के माध्यम से चयनात्मक छिड़काव द्वारा चूहा जिगर decellularization रिपोर्ट करने के लिए पहले समूह के थे। जिगर में विभिन्न संवहनी सिस्टम के चुनिंदा छिड़काव को सक्षम करने सेलुलर repopulation में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, इसके अलावा, बेहतर decellularization परिणामों में सक्षम है और हो सकता है।

यहाँ विस्तृत अध्ययन में यकृत दोलन दबाव शर्तों के तहत छिड़काव, सक्रिय करने के लिए एक कस्टम बनाया मालिकाना छिड़काव उपकरण में perfused थे। ये दबाव की स्थिति जिगर की शारीरिक श्वसन पर निर्भर छिड़काव की नकल: सीटू, जिगर, जिनके आंदोलन श्वसन के दौरान जिगर छिड़काव पर सीधा प्रभाव पड़ता है डायाफ्राम, की योजक के तहत लटका हुआ है। प्रेरणा विशेष रूप से अनुकूलन, डायाफ्राम के घटाने और जिगर की फैलाएंगे की ओर जाता हैhepato-शिरापरक बहिर्वाह, जबकि समाप्ति की जिगर की ऊंचाई और पोर्टल-शिरापरक इनफ्लो 15 अनुकूलन करने के लिए intraabdominal दबाव को कम करने के लिए जाता है।

हमारा उद्देश्य oscillating दबाव की स्थिति intraabdominal शर्तों पूर्व vivo नकल उतार द्वारा चूहा जिगर छिड़काव decellularization की एकरूपता पर प्रभाव पड़ता है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। decellularization प्रक्रिया की एकरूपता छिड़काव decellularization में एक कम करके आंका कारक हो सकता है। सभी ज्ञात एजेंटों ईसीएम जिगर decellularization कारण परिवर्तन के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्य क्षेत्रों में पहले से ही पूरी तरह से decellularized कर रहे हैं, जबकि खराब perfused क्षेत्रों में सेल, ईसीएम भीतर रहते हैं। शेष कोशिकाओं को भंग करने के लिए, छिड़काव अवधि या दबाव से अच्छी तरह से perfused क्षेत्रों के लिए अधिक परिवर्तन के कारण, ऊपर उठाया जाना चाहिए। इस प्रकार, decellularization के लिए डिटर्जेंट अंग के भीतर homogenously वितरित किया जाना चाहिए।

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Protocol

पशु प्रायोगिक चिकित्सा (एफईएम, Charité, बर्लिन, जर्मनी) के लिए सुविधा पर रखा गया था, और सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और राज्य स्वास्थ्य और स्थानीय मामलों के कार्यालय (LAGeSo, बर्लिन, जर्मनी द्वारा अनुमोदित किया गया;। रेग नं हे 0365 / 1 1)।

1. लिवर कटाई

  1. पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी
    1. निर्धारण के लिए एक काग प्लेट का उपयोग करें। थाली पर एक चिकित्सा टांगना रखो। चार सुई का प्रयोग, intraoperative साँस लेना narcosis के लिए काग प्लेट पर एक साँस लेना मुखौटा तय कर लो।
  2. पोर्टल शिरापरक प्रवेशनी के Prearrangement
    1. एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी के लिए एक परिधीय शिरापरक कैथेटर (जी -20) से कनेक्ट करें। शिरापरक कैथेटर लगभग की लंबाई के साथ, फेर से कटौती की जानी चाहिए। 1.5 सेमी।
    2. डी-हवा घंटी समाधान के साथ भरा एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर प्रणाली। यह बात ध्यान से de-हवा गैस दिल का आवेश को नकारात्मक रूप से छिड़काव decellularization को प्रभावित कर सकता है क्योंकि बहुत महत्वपूर्ण है।
  3. Prearrangementधमनी प्रवेशनी की
    1. एक तितली प्रवेशनी का प्रयोग करें और 5 मिमी की लंबाई के लिए सुई काटा। 5 मिमी सुई करने के लिए और superglue के साथ इसे ठीक है, एक 5 सेमी ट्यूब (ओवर ड्राफ्ट 0.96 मिमी आईडी 0.58 मिमी) फिट। बड़ा ट्यूब में और superglue के साथ इसे ठीक है, एक 2 सेमी लंबी ट्यूब (ओवर ड्राफ्ट 0.61 मिमी आईडी 0.28 मिमी) डालें।
    2. एक सीमा के रूप में इस निर्माण पर एक और ट्यूब स्लिप और superglue के साथ यह तय कर लो। डी-हवा घंटी समाधान के साथ भरा एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ धमनी प्रवेशनी।
  4. संज्ञाहरण और analgesia
    1. 1.5 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर ऑक्सीजन में 3.5% isoflurane के द्वारा संज्ञाहरण शामिल कक्ष में चूहे के narcosis प्रेरित।
    2. आपरेशन के दौरान सुरक्षित एनलजेसिया सुनिश्चित करने के लिए, intraperitoneally metamizol (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर द्रव्यमान) और कम खुराक ketamine / medetomidine (किलो शरीर द्रव्यमान प्रति 10 मिलीग्राम / 0.1 मिलीग्राम) इंजेक्षन।
    3. शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण के बाद के रखरखाव के लिए साँस लेना मुखौटा के माध्यम से 1 एल / मिनट ऑक्सीजन में 1.5 isoflurane% की आपूर्ति।
  5. Preoperative व्यवस्था <राजभाषा>
  6. एक बिजली के बाल काटना मशीन के साथ उदारतापूर्वक पेट दाढ़ी। कीटाणुशोधन के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट पर मुंडा चीरा साइट गीला।
  7. तैयार प्लेट पर लापरवाह स्थिति में पशु रखें साँस लेना मुखौटा में सिर डालने और चिकित्सा टेप और पिन के साथ अंगों को ठीक। एक धुंध सेक के साथ अतिरिक्त इथेनॉल और फर निकालें।
  • संज्ञाहरण आकलन
    1. सांस की दर देख कर संज्ञाहरण गहराई का आकलन करें। संज्ञाहरण (40-60 साँस / मिनट) गहरी पर्याप्त लगता है, एनलजेसिया दोनों पिछले पैर की उंगलियों के बीच त्वचा चुटकी शल्य चिकित्सा संदंश का उपयोग कर पैर के अंगूठे चुटकी पलटा ट्रिगर करने के लिए कोशिश कर रहा द्वारा पर्याप्त है या नहीं।
  • पेट दृष्टिकोण
    1. मूत्राशय से ऊपर दुम पेट की दीवार में एक औसत चीरा बनाओ। एक वी के आकार ढंग से दोनों पार्श्व तटीय मेहराब को इस बात से काटें। डायाफ्राम में कटौती करने के लिए नहीं ख्याल रखना। सीने पर कटौती पेट की दीवार खींच लें। , एक overholt क्लैंप के साथ असिरूप फिक्स cranially यह खींचने के लिए और एक रबर बैंड के साथ यह तय कर लो। आंत खाली करने के लिए गीला कपास swabs का प्रयोग करें। एक गीला धुंध पट्टी में आंत लपेटें। इसके अलावा, गीली पट्टियों के साथ सभी उदर मार्जिन को कवर किया।
  • लिवर तैयारी
    1. दात्राकार बंधन काटना। Cranially डायाफ्राम के गुंबद के नीचे औसत दर्जे का है और छोड़ दिया जिगर पालियों धारण करने के लिए एक गीला धुंध पट्टी का उपयोग करें। Hepatoduodenal बंधन और ऊपरी omental जिगर पालि बेनकाब।
    2. पालि मोबाइल है जब तक ध्यान से ऊपरी omental पालि से जुड़ी बंध काटना दो microforceps और वसंत कैंची का प्रयोग करें। जगह में औसत दर्जे का है और छोड़ दिया पालियों पकड़े, धुंध सेक के तहत गीला कपास swabs का उपयोग कर पालि ले जाएँ।
    3. ऊपरी omental जिगर पालि की लामबंदी के बाद, बाईं ओर पेट चाल है। एक क्लैंप के साथ पेट ठीक करें और microforceps और वसंत कैंची के साथ मामूली omentum काटना।
    4. कम omenta जुटानेएल जिगर पालि यह मोबाइल है और बाद में अपने गुहा में वापस पालि ले जाने के लिए जब तक। ग्रहणी बनाए रखने के लिए एक Backhaus क्लैंप का उपयोग करें। खिंचाव और hepatoduodenal बंधन को बेनकाब करने के लिए छोड़ दिया करने के लिए ग्रहणी ले जाएँ। फैला hepatoduodenal बंधन में आम पित्त नली प्रतिबंध लगाना।
    5. वसा और अग्नाशय के ऊतक से पित्त नली काटना। पित्त नली पित्त नली विभाजन से 1.5 सेमी काटें। आसपास के वसा ऊतकों से पोर्टल नस काटना। Gastroduodenal नस बेनकाब।
    6. रेशम 6-0 के साथ दो बार gastroduodenal नस कटी घमनी को बांधना और 2 संयुक्ताक्षर के बीच नस विभाजित करते हैं। सभी धमनी रामी पता चला रहे हैं जब तक आसपास के ऊतकों से सीलिएक ट्रंक और आम यकृत धमनी काटना।
    7. आसपास के ऊतकों से gastroduodenal धमनी आजाद। एक-दूसरे से दूर संबंधों के साथ, रेशम 6-0 के साथ दो बार gastroduodenal धमनी बाँधो। 2 संयुक्ताक्षर के बीच gastroduodenal धमनी काटना।
    8. प्लीहा धमनी आजादआसपास के ऊतकों से। एक-दूसरे से दूर संबंधों के साथ, रेशम 6-0 के साथ दो बार प्लीहा धमनी बाँधो। 2 संयुक्ताक्षर के बीच प्लीहा धमनी काटना।
    9. आसपास के ऊतकों से छोड़ दिया गैस्ट्रिक धमनी आजाद। एक-दूसरे से दूर संबंधों के साथ, रेशम 6-0 के साथ दो बार छोड़ दिया गैस्ट्रिक धमनी बाँधो। 2 संयुक्ताक्षर के बीच धमनी काटना।
    10. सही गुर्दे और जिगर सही पार्श्व पालि के बीच अवर caval नस प्रतिबंध लगाना। Retroperitoneal अंतरिक्ष से नस काटना। सीलिएक ट्रंक का पालन करके महाधमनी बेनकाब।
    11. Retroperitoneal वसा ऊतकों काटना। अवर रग Cava में 1 मिलीलीटर खारा में 1,000 आईई हेपरिन इंजेक्षन। प्रवेशनी वापस लेना और एक कपास पैड के साथ चीरा बंद करें। हेपरिन के प्रणालीगत प्रभाव के लिए 1-2 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    12. संदंश के साथ महाधमनी प्रतिबंध लगाना। महाधमनी काटना और चूहे रक्तहीन। इसके अलावा, गुर्दे से distally अवर रग Cava काटना।
  • पोर्टल शिरापरक केन्युलेशन (प्रयोग धारा 1.2 में तैयार प्रवेशनी)
    1. बाहर का पोर्टल शिरा में एक मछली-मुंह चीरा बनाओ। संदंश के साथ चीरा खोलें और पोर्टल नस cannulate। जिगर decolorizes तक 20 मिलीलीटर घंटी समाधान के साथ जिगर फ्लश और संयुक्ताक्षर (रेशम 6-0) के साथ प्रवेशनी तय कर लो।
  • धमनी cannulation (प्रयोग खंड 1.3 में तैयार प्रवेशनी)
    1. सीलिएक ट्रंक के ऊपर महाधमनी काटना। Retroperitoneal अंतरिक्ष से महाधमनी खंड आजाद। एक महाधमनी पैच उत्पन्न करने के लिए अनुलंबीय महाधमनी खंड कट। एक स्थिर धारक में स्व-निर्मित प्रवेशनी डालें।
    2. प्रवेशनी से अधिक महाधमनी पैच पर्ची के लिए 2 संदंश का प्रयोग करें। प्रवेशनी से अधिक रेशम 6-0 से यकृत धमनी कटी घमनी को बांधना और सीमा पर पैच तय कर लो।
  • लिवर Explantation
    1. डायाफ्राम ओपन के एक परिपत्र चीरा और आसपास के ढांचे से जिगर के टुकड़े करना।
  • भंडारण
    1. एसटूउपयोग करें जब तक 350 मिलीलीटर घंटी समाधान के साथ भरा एक बाँझ 500 मिलीलीटर की टंकी में जिगर रहे हैं।
  • 2. डिटर्जेंट समाधान

    1. 10% ट्राइटन X-100 शेयर समाधान
      1. 900 मिलीलीटर एक्वा गंतव्य के साथ एक 1000 मिलीलीटर की बोतल भरें। और 100 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 (99,9%) जोड़ें। ट्राइटन X-100 भंग करने के लिए एक उत्तेजक का उपयोग करें। एक्वा गंतव्य के साथ बोतल भरें। 1,000 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुँच जाता है।
    2. 1% ट्राइटन X-100
      1. एक 1000 मिलीलीटर की बोतल के लिए शेयर समाधान की 100 मिलीलीटर (10%) जोड़ें। 900 मिलीलीटर एक्वा गंतव्य जोड़ें। और दो बार की बोतल हिला। एक बाँझ फिल्टर के माध्यम से 1% ट्राइटन X-100 समाधान फ़िल्टर।
    3. 10% एसडीएस स्टॉक समाधान
      1. 900 मिलीलीटर एक्वा गंतव्य के साथ एक 1000 मिलीलीटर की बोतल भरें। और 66.99 छ एसडीएस (99.9%, घनत्व 0.67) जोड़ें। एसडीएस भंग करने के लिए एक उत्तेजक का उपयोग करें। एक्वा गंतव्य के साथ बोतल भरें। 1,000 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुँच जाता है।
    4. 1% एसडीएस
      1. एक 1000 मिलीलीटर बॉट को शेयर समाधान की 100 मिलीलीटर (10%) जोड़ेंTLE। 900 मिलीलीटर एक्वा गंतव्य जोड़ें। और दो बार की बोतल हिला। एक बाँझ फिल्टर के माध्यम से 1% एसडीएस समाधान फ़िल्टर।

    3. Decellularization

    1. छिड़काव डिवाइस के सेट-अप चित्र 1

    चित्रा 1:। के दबाव की स्थिति के तहत चयनित धमनी और चार चूहा यकृत के पोर्टल शिरापरक छिड़काव के लिए छिड़काव डिवाइस की योजना (। Struecker एट अल से संशोधित 14)

    1. एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी और भरने के स्तर को विनियमित करने और 500 मिलीलीटर 0,9% NaCl के साथ रिएक्टर को भरने के लिए एक Heidelberger विस्तार करने के लिए नाली लिंक करें।
      चित्र 2

    चित्रा 2:। (4) पोर्टल शिरापरक उपयोग के माध्यम से बुलबुला जाल (5) (2) या धमनी एसी के माध्यम से बाहर का अंत करने के लिए छिड़काव सेट-अप की योजना छिड़काव चैम्बर लिंक (1400 सेमी 3) (1)उपकर (3)। बुलबुला जाल (5) बाहर अंत में एक डाटना (4) और एक छिद्र (6) के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए। एक Heidelberger विस्तार (7) के लिए बुलबुला जाल (5) से कनेक्ट करें। पंप खंड (8) को Heidelberger विस्तार से लिंक करें। इसके अलावा, एक और Heidelberger विस्तार (9) के लिए पंप खंड (8) को जोड़ने। डिटर्जेंट समाधान (10) की बोतल में पिछले Heidelberger विस्तार (9) डालें। (या एकाधिक perfusions के मामले में दबाव वितरक के लिए) छिड़काव चैम्बर के लिए श्वासयंत्र (11) कनेक्ट करें। रिएक्टर तरल पदार्थ नाली करने के लिए, बेकार की बोतल (12) को बहिर्वाह कनेक्ट।

    1. पंप में पंप खंड डालें। पीबीएस के साथ चक्र को भरने के लिए पंप शुरू, बुलबुला जाल से बाहर का अंत को बंद करने और वेंट खुला। बुलबुले के नीचे सुरक्षित रूप से पीबीएस (2-3 सेमी) के साथ कवर किया जाता है, वेंट बंद करें और बुलबुला जाल से बाहर का अंत खुला।
    2. लिवर स्थापना
      1. संबंधित रिएक्टर का उपयोग करने के लिए पोर्टल शिरा प्रवेशनी की तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी से लिंक करें। सीधमनी का उपयोग करने के लिए धमनी प्रवेशनी onnect। कोई हवा सिस्टम में प्रवेश करती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें।
    3. Oscillating दबाव की स्थिति के अनुप्रयोग
      1. 15 धड़कन प्रति मिनट की एक आवृत्ति और 26 एम्बार (मि। 4 एम्बार, मैक्स। 30 मिलीबार) के एक आयाम के साथ एक श्वास का प्रयोग करें। दबाव वितरण कक्ष के लिए श्वासयंत्र कनेक्ट और रिएक्टर के लिए चैम्बर कनेक्ट। दबाव आवेदन शुरू करो।
    4. Decellularization प्रोटोकॉल
      1. / मिनट 5 मिलीलीटर के प्रवाह की दर के साथ छिड़काव चरणों का प्रदर्शन। 90 मिनट के लिए 1% ट्राइटन X-100 के साथ जिगर के छिड़काव के साथ decellularization प्रारंभ करें। छिड़काव कक्ष निरंतर अंदर और perfused जिगर से ऊपर द्रव स्तर पर रखने के लिए छिड़काव डिवाइस का बहिर्वाह के माध्यम से बेकार बहना की अनुमति दें। 90 मिनट के बाद, 1% एसडीएस के लिए डिटर्जेंट बदल जाते हैं।
        चित्र तीन
        तालिका एक
    <पी> चित्रा 3: सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए छिड़काव प्रोटोकॉल।

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    Representative Results

    एकरूपता और इस प्रकार विभिन्न decellularization प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता स्थूल अवलोकन, ऊतकीय विश्लेषण, और decellularized जिगर matrices के भीतर शेष डीएनए सामग्री के विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन किया गया। इसके अलावा, जंग कास्टिंग decellularization के बाद यकृत की अक्षुण्ण microanatomy कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया था।

    Macroscopy

    Decellularization के दौरान, यकृत सेलुलर सामग्री हटाने का संकेत है, प्रकाशमान हो जाते हैं। पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused यकृत के दौरान और decellularization (सफेद तीर) के बाद macroscopically दिखाई दे शेष कोशिकाओं के साथ, inhomogeneous व्याख्या (और इस प्रकार decellularization) दिखाया। यकृत धमनी के माध्यम से perfused यकृत एक अधिक समरूप decellularization पाठ्यक्रम और कोई दिखाई शेष कोशिकाओं दिखाया। यकृत दोलन दबाव की स्थिति के आवेदन के साथ perfused थे, तो कोई शेष कोशिकाओं पर ध्यान दिए बिना छिड़काव मार्ग की, दिखाई दे रहे थे।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: दबाव की स्थिति oscillating बिना चूहा जिगर Decellularization के macroscopic परिणाम। वाम: यकृत धमनी के माध्यम से decellularized चूहा जिगर। जिगर macroscopically दिखाई दे शेष कोशिकाओं के बिना, प्रकाशमान दिखाई देता है। अधिकार: पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused जिगर। जिगर inhomogeneously macroscopically दिखाई दे कोशिकाओं के साथ, decellularized प्रकट होता है

    चित्रा 5
    चित्रा 5: दोलन दबाव शर्तों के तहत चूहे जिगर decellularization के macroscopic का परिणाम है। वाम: यकृत धमनी के माध्यम से decellularized चूहा जिगर। अधिकार: पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused जिगर। दोनों यकृत दिखाई दे शेष कोशिकाओं के बिना, प्रकाशमान दिखाई देते हैं।

    Histological मूल्यांकन

    Decellularized जिगर matrices के समर्थन के histological मूल्यांकनएड स्थूल निष्कर्षों। यकृत धमनी के माध्यम से perfused यकृत चाहे वे दोलन दबाव शर्तों के तहत perfused थे कि क्या, कोई शेष कोशिकाओं दिखाया। पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused यकृत वे दोलन दबाव की स्थिति के आवेदन के साथ perfused थे, भले ही शेष कोशिकाओं के क्षेत्रों से पता चला है। हालांकि, दोलन दबाव की स्थिति के आवेदन पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused यकृत में शेष सेल जन कम कर दिया। यकृत की ईसीएम सभी एप्लाइड प्रोटोकॉल भर में दिखाई दे रहे मतभेदों के बिना, संरक्षित किया गया था।

    चित्रा 6

    चित्रा 6: एच / decellularized लिवर matrices के ई धुंधला। एपी: दबाव की स्थिति oscillating बिना यकृत धमनी के माध्यम से perfused decellularized जिगर मैट्रिक्स। अ + पी: दोलन दबाव शर्तों के तहत यकृत धमनी के माध्यम से perfused decellularized जिगर मैट्रिक्स। पीए-पी: decellularized जिगर matrनौवीं दबाव की स्थिति oscillating बिना पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused। पीए + पी: दोलन दबाव शर्तों के तहत पोर्टल शिरा के माध्यम से perfused decellularized जिगर मैट्रिक्स। तीर: सेल समूहों शेष।

    डीएनए सामग्री

    अंतर केवल सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण दोलन दबाव की स्थिति (ए + पी पी वी + पी) के तहत perfused समूहों में थे, हालांकि जिगर मैट्रिक्स की सूखी वजन के प्रति डीएनए सामग्री, देशी यकृत में उस के साथ तुलना में सभी प्रयोगात्मक समूहों में गिरावट आई है। सूखी वजन प्रति डीएनए की न्यूनतम राशि oscillating दबाव शर्तों के तहत यकृत धमनी के माध्यम से perfused यकृत में पाया गया था।

    चित्रा 7

    चित्रा 7: (। Struecker एट अल 14 से संशोधित) जिगर मैट्रिक्स के डीएनए सामग्री प्रति सूखी वजन। यकृत धमनी शो के माध्यम से decellularized यकृत कम उन छिड़कना की तुलना में डीएनए शेषपोर्टल के माध्यम से डी नस। दोलन दबाव शर्तों के तहत perfused यकृत कर इन शर्तों के बिना decellularized उन लोगों की तुलना में कम शेष डीएनए दिखा। इस प्रकार, दोलन दबाव शर्तों के तहत यकृत धमनी के माध्यम से perfused यकृत कम से कम शेष डीएनए सामग्री दिखाने के लिए।

    जंग कास्टिंग

    Decellularized जिगर मेट्रिसेस की जंग कास्टिंग (पोर्टल शिरापरक प्रणाली के प्रोटीन के ढांचे, धमनी प्रणाली और पित्त प्रणाली सहित) यकृत की microanatomy decellularization के दौरान संरक्षित है कि पुष्टि की।

    आंकड़ा 8
    चित्रा 8: (। Struecker एट अल 14 से संशोधित) एक decellularized चूहा जिगर मैट्रिक्स की एक जंग कास्टिंग की तस्वीर। सभी कोशिकाओं को हटाने के बावजूद, पोर्टल शिरापरक (नीला) और धमनी (लाल) प्रणालियों सहित अंग की microanatomy, संरक्षित कर रहे हैं। remaपित्त प्रणाली की ining मुख्य शाखाओं में पीले रंग में casted कर रहे हैं।

    तालिका एक
    तालिका 1: Oscillating दबाव की स्थिति का प्रभाव और चूहा जिगर Decellularization पर छिड़काव ट्रेन का आकलन के लिए प्रयोगात्मक समूहों।

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    Discussion

    चूहा जिगर कटाई और decellularization के लिए प्रस्तुत तकनीक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, पर विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं:

    यह रक्त जमावट को सक्रिय करेंगे और जिगर के भीतर खून का थक्का गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं क्योंकि जिगर कटाई के लिए तैयार करने के दौरान, यह गंभीर खून बह रहा से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारी राय में, यह पोर्टल शिरा के माध्यम से छिड़काव के दौरान यकृत धमनी के माध्यम से रक्त आमद से बचने के लिए पोर्टल शिरा के केन्युलेशन से पहले सीधे उदर महाधमनी काटकर अलग कर देना करने के लिए लाभदायक है। जिगर cannulated और स्पष्ट रूप से perfused है एक बार, खून का थक्का बनने कोई मुद्दा नहीं रह गया है।

    छिड़काव सर्कल में गैस के बुलबुले की प्रविष्टि गैस दिल का आवेश को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए क्योंकि छिड़काव उपकरण के लिए जिगर कटाई और परिवहन के बाद, छिड़काव उपकरण के लिए यकृत के कनेक्शन एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम है। यह तीन तरह वाल्व prefill के लिए उपयोगी है जो मैंपीबीएस छिड़काव प्रणाली के लिए वाल्व को जोड़ने से पहले सीधे एक सिरिंज और एक पतली प्रवेशनी उपयोग करने के साथ, जिगर प्रवेशनी से जुड़ा है।

    छिड़काव की स्थापना की है, के बाद सभी ट्यूब कनेक्टर्स, चाहे वाल्व और ट्यूबों पूरी तरह से जुड़े हुए हैं तीन तरह से फिर से जाँच की जानी चाहिए। यकृत अब durations के लिए perfused कर रहे हैं (उदाहरण के लिए।, ओ / एन), के संबंध में भी एक छोटी सी गलती इस प्रकार घातक छिड़काव परिणामों के लिए अग्रणी छिड़काव प्रणाली में वसूलना हवा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

    प्रस्तुत आंकड़ों सबसे अच्छा decellularization परिणामों के लिए oscillating के दबाव में परिवर्तन का इष्टतम दबाव और आवृत्ति अस्पष्ट रहते हैं कि इस तथ्य से सीमित हैं। इसके अलावा, दबाव नियंत्रित छिड़काव प्रवाह नियंत्रित छिड़काव करता है की तुलना में बेहतर और अधिक स्थिर परिणामों को जन्म दे सकता है। प्रेशर नियंत्रित छिड़काव, एक ही परिणाम के साथ अलग अलग आकार और वजन के यकृत को एक छिड़काव प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए सक्षम बनाता है बहेगा स्वचालित रूप से बी क्योंकिई रूपांतरित किया।

    यकृत धमनी और पोर्टल शिरा आकार और शारीरिक प्रवाह दरों के मामले में काफी अलग हैं। इस प्रकार, एक निरंतर छिड़काव दर (5 मिलीग्राम / मिनट) निश्चित रूप से दो संवहनी प्रणाली के भीतर विभिन्न छिड़काव के दबाव में परिणाम होगा। इसी तरह, एक निरंतर छिड़काव दबाव अलग छिड़काव दरों में परिणाम होगा। दो छिड़काव मार्गों के माध्यम decellularization प्रभावकारिता तुलना करने के लिए एक विधि दोनों मार्गों के माध्यम से शारीरिक छिड़काव दबाव या छिड़काव दरों पर छिड़काव करने के लिए प्रदर्शन किया जाएगा। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में परिणाम तुलनीय बनाने के लिए, हम दोनों मार्गों के लिए एक निरंतर छिड़काव दर चुना है। दुर्भाग्य से, हमारे उपकरण का उपयोग कर, हम perfused यकृत के भीतर छिड़काव दबाव मापने के लिए सक्षम नहीं थे।

    हमारी अगली पीढ़ी के छिड़काव उपकरणों आवश्यक छिड़काव मीडिया की मात्रा को कम करने के लिए छोटा हो जाएगा। इसके अलावा, पंप उपकरणों दबाव नियंत्रित छिड़काव सक्षम हो जाएगा।

    गुई प्रस्तुत तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, समरूप चूहा जिगर decellularization के लिए बहुत उपयोगी प्रतीत होता है। प्रस्तुत तकनीक इन विट्रो में recellularization और अंग परिपक्वता के लिए उपयुक्त है और आगे भी संबोधित किया जाना है। Oscillating दबाव की स्थिति repopulated कोशिकाओं पर प्रभाव पड़ता है चाहे आगे के प्रयोगों के अधीन किया जाएगा।

    प्रस्तुत तकनीक अन्य चूहा जिगर छिड़काव उपकरणों की तुलना में अधिक जटिल है और कई स्पष्ट लाभ से पता चलता है: oscillating दबाव की स्थिति लागू कर रहे हैं, जब 1) समरूप decellularization अच्छे परिणाम के साथ, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। 2) छिड़काव युक्ति सील और मैट्रिक्स repopulation और लंबी अवधि के छिड़काव के लिए एक शर्त है जो बाँझ decellularization, सक्षम बनाता है। 3) प्रस्तुत प्रोटोकॉल अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में कम है, लेकिन अभी भी बहुत प्रभावी है। पोर्टल शिरा और यकृत धमनी की 4) चयनात्मक छिड़काव विभिन्न प्रणालियों के माध्यम से चयनात्मक सेल repopulation संभव renders,जो एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है।

    छिड़काव डिवाइस को निखारने और चूहा जिगर decellularization अनुकूलन करने के लिए आगे decellularization प्रयोगों में लागू किया जाएगा। दबाव नियंत्रित छिड़काव का असर प्रयोगात्मक मूल्यांकन और प्रवाह नियंत्रित छिड़काव के साथ तुलना की जाएगी। आगे तत्वों के अलावा (जैसे।, एक "डायलिसिस यूनिट," एक हीट एक्सचेंजर, एक oxygenator) repopulation, संस्कृति और परिपक्वता के प्रयोगों के लिए आगे प्रस्तुत डिवाइस विकसित करने के लिए संभव है और उचित प्रतीत होता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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