振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

Bioengineering

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Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

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Abstract

Introduction

脱細胞化および再細胞化は、in vitro 1 における機能性、移植臓器の生成を可能にすることができます。器官からの細胞および抗原性物質( 例えば 、DNA、α-GALエピトープ)を除去することにより、以下の非免疫原性細胞外マトリックス(ECM)を得ることができます。この行列は、臓器の三次元ミクロ解剖学を節約し、別の、おそらく異種起源2の細胞を用いた再増殖のための理想的なバイオマトリックスとして機能することができます。このように、脱細胞化ラット肝臓マトリックスは、ヒト肝細胞で再増殖することができます。このヒト化マイクロ肝臓疾患の研究のために( 例えば 、先天性代謝性疾患、ウイルス性疾患または悪性腫瘍)または前臨床医薬品試験3のためのex vivoでのモデルとして役立つことができます。

ラット肝灌流脱細胞化するためのいくつかの異なるプロトコルは、すでに4-13を公開されています。すべてのプロトコルでは、decellular化は、カニューレを挿入し、門脈を介してアルカリイオン性または非イオン性界面活性剤の灌流によって達成されました。我々の知る限り、我々は門脈および/ ​​またはラットの肝動脈14を介して選択的灌流によりラット肝脱細胞化を報告する最初のグループでした。肝臓内の異なる血管系の選択的灌流を有効にすると、よりよい脱細胞化した結果を可能にして、さらに、細胞再生に重要な役割を果たしている可能性があります。

ここで詳細な研究では、肝臓は、振動圧力条件下で灌流を可能にする、カスタムメイドの独自の灌流装置で灌流しました。これらの圧力条件は、肝臓の生理的な呼吸器依存灌流を模倣する: その場で 、肝臓は動き、呼吸時の肝灌流に直接影響を与え、振動板のコピュラの下でハングアップします。インスピレーションは、具体的に最適化し、肝臓の振動板と絞りの低下につながります肝静脈流出が、一方、有効期限は、肝臓の上昇とポータル静脈流入15を最適化するために、腹腔内圧の低下につながります。

私たちの目的は、振動圧力条件は、ex vivoでの腹腔内条件を模倣することによって、ラット肝灌流脱細胞化の均一性に影響を与えるかどうかを評価することでした。脱細胞化プロセスの均一性は灌流脱細胞化で過小評価要因になることがあります。 ECMに肝臓の脱細胞化の原因の変更のために使用されるすべての知られている薬剤。他の領域がすでに完全に脱細胞化されているのに対し、乏しい灌流領域の細胞は、ECM内に残ります。残りの細胞を溶解するために、灌流期間または圧力が十分に灌流領域に複数の変化を引き起こし、上昇する必要があります。このように、脱細胞化のための界面活性剤は、臓器内に均一に分布されるべきです。

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Protocol

/ 0365レッグ号のO;動物は、実験医学(FEM、シャリテ、ベルリン、ドイツ)のための施設で維持し、全ての実験プロトコルが見直され、健康と地方事務のステートオフィス(LAGeSo、ベルリン、ドイツによって承認されました。 11)。

1.肝臓の収穫

  1. 手術前の準備
    1. 固定のためにコルク板を使用してください。プレートに医療ドレープを入れてください。 4針を使用して、術中の吸入麻酔のためのコルク板に吸入マスクを固定します。
  2. ポータル静脈カニューレの前準備
    1. 三方活栓に末梢静脈カテーテル(G 20)を接続します。静脈カテーテルは、約の長さで、斜めにカットされるべきです。 1.5センチメートル。
    2. デ空気リンゲル液を充填した10mLのシリンジを使用してシステム。ガス塞栓症が否定灌流脱細胞化に影響を与える可能性があるので、慎重に脱空気に非常に重要です。
  3. 談合動脈カニューレの
    1. 蝶のカニューレを使用し、5mmの長さに針をカット。 5ミリメートルの針にし、瞬間接着剤で固定し、5cmの管(外径0.96ミリメートルID 0.58ミリメートル)を取り付け。大きなチューブにし、瞬間接着剤で固定し2センチ長い管(OD 0.61ミリメートルID 0.28ミリメートル)を挿入します。
    2. アバットメントとしてこの構造の上に別のチューブをスリップし、瞬間接着剤で固定します。デ空気リンゲル液を充填した5mLのシリンジを用い動脈カニューレ。
  4. 麻酔や鎮痛
    1. 1.5 L /分の流量で酸素3.5%イソフルランによる麻酔誘導チャンバー内のラットの麻酔を誘導します。
    2. 動作中に安全な鎮痛を確保するために、腹腔内にメタミゾールた(100mg / kgの体重)及び低用量のケタミン/メデトミジン(10mg / kgの体重あたり0.1 mg)を注入します。
    3. 外科麻酔法のその後のメンテナンスのための吸入マスクを介して1リットル/分の酸素中の1.5%イソフルランを供給する。
  5. 術前アレンジメント<オール>
  6. 電気せん断機で自由に腹部を剃ります。消毒用の70%エタノールで腹部に剃毛切開部位を湿ら。
  7. 、準備されたプレート上に仰臥位で動物を置き吸入マスクにヘッドを挿入し、医療テープとピンと手足を固定します。ガーゼ湿布で過剰のエタノールや毛皮を削除します。
  • 麻酔評価
    1. 呼吸数を見て、麻酔の深さを評価します。麻酔は(40〜60呼吸/分)十分な深思わ場合には、鎮痛は、両方の後肢の足の指の間の皮膚を挟ま手術用鉗子を使用して、つま先のピンチ反射をトリガーしようとすることで十分であるかどうかを確認してください。
  • 腹部アプローチ
    1. 膀胱上記尾腹壁に正中切開を行います。 V字状に両側肋骨のアーチには、この点からカット。振動板に切断しないように注意してください。胸の上にカット腹壁を引き出します。 、オーバーホルトクランプで剣状突起を修正頭側に引き、ゴムバンドで固定します。腸を排出するために湿った綿棒を使用してください。濡れたガーゼ包帯で腸を包みます。また、濡れた包帯を持つすべての腹部のマージンをカバーしています。
  • 肝臓の準備
    1. 鎌状靭帯を解剖。頭側振動板のドームの下で内側と左肝葉を保持するために、湿ったガーゼの包帯を使用してください。肝十二指腸間膜および上部大網肝葉を公開します。
    2. ローブが携帯するまで慎重に上部大網葉に付着した靱帯を分析するために、2つのマイクロピンセットと春のはさみを使用してください。代わりに、内側と左葉を保持する、ガーゼ湿布の下ウェット綿棒を使って葉を移動します。
    3. 上部の大網肝葉の動員後、左に胃を移動します。クランプで胃を修正して、マイクロピンセットと春のはさみとマイナー大網を分析。
    4. 下omentumの複数形を動員L肝葉、モバイルであり、その後、その空洞内にバックローブを移動するまで。十二指腸を保持するために、バックハウスクランプを使用してください。ストレッチや肝十二指腸間膜を露出させるために左に十二指腸を移動します。延伸肝十二指腸間膜内の総胆管を取り囲みます。
    5. 脂肪および膵臓組織からの胆管を解剖。胆管分岐部から胆管1.5センチカット。周囲の脂肪組織から門脈を分析。胃十二指腸静脈を露出させます。
    6. シルク6-0で二回、胃十二指腸静脈を結紮し、2合字間の静脈を分割。すべての動脈枝が明らかにされるまで、周囲の組織から腹腔動脈と総肝動脈を解剖。
    7. 周囲の組織から胃十二指腸動脈を解放。互いに離れタイで、絹6-0で二回胃十二指腸動脈を結びます。 2合字の間に胃十二指腸動脈を解剖。
    8. 脾動脈を解放周囲の組織から。互いに離れタイで、絹6-0で二回脾動脈を結びます。 2合字の間に脾動脈を解剖。
    9. 周囲の組織からの左胃動脈を遊離。互いに離れタイで、絹6-0で二回、左胃動脈を結びます。 2合字間動脈を解剖。
    10. 右腎と右横肝葉の間の下大静脈を囲みます。後腹膜腔からの静脈を解剖。腹腔動脈に従うことによって大動脈を露出させます。
    11. 後腹膜脂肪組織を解剖。下大静脈に1ミリリットルの生理食塩水で千IEヘパリンを注入します。カニューレを撤回し、綿パッドで切開を閉じます。ヘパリンの全身的な効果のために1〜2分待ってください。
    12. ピンセットで大動脈を囲みます。大動脈を解剖し、ラットを放血。また、腎臓から遠位下大静脈を解剖。
  • 門脈カニューレ挿入(セクション1.2で調製したカニューレを使用してください)
    1. 遠位門脈魚口切開を行います。鉗子で切開を開き、門脈にカニューレを挿入。肝臓脱色するまで20ミリリットルリンゲル液で肝臓をフラッシュし、合字(絹6-0)でカニューレを固定します。
  • 動脈カニューレ挿入(セクション1.3で調製したカニューレを使用してください)
    1. 腹腔動脈上記の大動脈を解剖。後腹膜腔からの大動脈セグメントを解放します。大動脈パッチを生成するために、縦方向に大動脈セグメントをカットします。静的ホルダーに自作のカニューレを挿入します。
    2. カニューレを介して大動脈パッチをスリップする2ピンセットを使用してください。カニューレ上のシルク6-0と肝動脈を結紮し、突合せ部でパッチを修正。
  • 肝外植
    1. 、絞りを開いた円形の切開を行い、周囲の構造から肝臓を分析。
  • ストレージ
    1. STO使用するまで350ミリリットルリンゲル液で満たされた500mlの滅菌槽内の肝臓再。
  • 2.洗剤溶液

    1. 10%トリトンX-100の原液
      1. 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。 、100mlのトリトンX-100(99.9%)を追加します。トリトンX-100を溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。
    2. 1%トリトンX-100
      1. 千ミリリットルボトルにストック溶液100ml(10%)を加えます。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1%トリトンX-100液をフィルタリングします。
    3. 10%SDS原液
      1. 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。および66.99グラムのSDS(99.9%、密度0.67)を追加します。 SDSを溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。
    4. 1%SDS
      1. 千ミリリットルボットにストック溶液100ml(10%)を追加TLE。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1%SDS溶液をフィルタリングします。

    3.脱細胞化

    1. 潅流装置のセットアップ図1

    図1:発振の圧力条件の下で選択的動脈、フォーラット肝臓の門脈灌流のための灌流装置のスキーム (Struecker 14から変更されました。)。

    1. 三方活栓および充填レベルを調節し、500ミリリットル0.9%NaClで反応器に充填するハイデルベルグの拡張子にドレインをリンクします。
      図2

    図2:(4)門静脈アクセスを介して気泡トラップ(5)(2)または動脈を介して交流先端に灌流セットアップスキーム灌流チャンバーのリンク(1400センチメートル3)(1)セス(3)。気泡トラップは、(5)先端の閉塞(4)とベント(6)を装備する必要があります。ハイデル拡張(7)に気泡トラップ(5)を接続します。ポンプセグメント(8)にハイデルベルグの拡張子をリンクします。また、別のハイデルベルグ拡張(9)にポンプセグメント(8)を接続してください。界面活性剤溶液(10)のボトルに最後のハイデル拡張(9)を挿入します。 (または複数の灌流の場合には圧力分配器)灌流チャンバーに人工呼吸器(11)を接続します。原子炉流体を排出するために、廃棄ボトル(12)への流出を接続します。

    1. ポンプ内にポンプセグメントを挿入します。 PBSでサイクルを埋めるためにポンプを起動し、気泡トラップの先端を閉じて、通気口を開きます。泡の底部がしっかりとPBS(2-3センチ)で覆われている場合には、通気孔を閉じて、気泡トラップの遠位端を開きます。
    2. 肝臓のインストール
      1. 関連リアクターアクセスに門脈カニューレの三方活栓をリンクします。 C言語動脈アクセスに動脈カニューレONNECT。全く空気がシステムに入らないことを保証するために注意してください。
    3. 振動の圧力条件の適用
      1. 15 BPMの周波数と26ミリバール(分4ミリバール、最大30ミリバール)の振幅と呼吸器を使用してください。圧力分布室に呼吸器を接続し、反応器に、チャンバを接続します。圧力アプリケーションを起動します。
    4. 脱細胞化プロトコル
      1. /分5ミリリットルの流量で灌流手順を実行します。 90分間、1%トリトンX-100と肝臓の灌流に脱細胞化を開始します。灌流チャンバーを一定の内側と灌流肝臓上記流体レベルを維持するために潅流装置の流出を介して廃棄物の流出を可能​​にします。 90分後、1%SDSに界面活性剤を変更します。
        図3
        表1
    <P> 図3:すべての実験グループの灌流プロトコル。

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    Representative Results

    均一性、したがって異なる脱細胞化プロトコルの有効性を肉眼観察し、組織学的分析、及び脱細胞化肝臓行列内の残りのDNA含量の分析によって評価しました。また、腐食鋳造は脱細胞化後の肝臓の無傷のミクロ解剖学を視覚化するために実施しました。

    肉眼検査

    脱細胞化の間に、肝臓は、携帯コンテンツの削除を示す、ルーセントとなります。門脈を介して灌流肝臓を脱細胞化中および後に肉眼で見える残っている細胞(白矢印)で、不均一な解明(従って、脱細胞化)を示しました。肝動脈を介して灌流肝臓は、より均質な脱細胞化の過程と目に見える残りの細胞を示しました。肝臓を振動圧力条件を適用して灌流した場合、残りの細胞は関係なく、灌流経路の、見えませんでした。

    図4
    図4:圧力条件を振動することなく、ラット肝脱細胞化の肉眼結果 。左:肝動脈を介して脱細胞化ラット肝臓。肝臓は肉眼で見える残りの細胞なし、ルーセントが表示されます。右:肝臓は門脈を介して灌流しました。肝臓は肉眼で見える細胞を、不均一脱細胞化表示されます

    図5
    図5:振動圧力条件下でのラット肝臓脱細胞化の肉眼結果 。左:肝動脈を介して脱細胞化ラット肝臓。右:肝臓は門脈を介して灌流しました。どちらの肝臓は目に見える残りの細胞なし、ルーセント表示されます。

    組織学的評価

    脱細胞肝行列のサポートの組織学的評価edは肉眼的所見。肝動脈を経由して肝臓灌流にかかわらず、それらが振動圧力条件下で灌流したかどうか、残存する細胞を示さありませんでした。門脈を介して灌流肝臓は、それらが振動圧力条件を適用して灌流した場合でも、残りのセルのゾーンを示しました。しかし、振動圧力条件の適用は、門脈を介して灌流した肝臓中に残っている細胞塊を減少させました。肝臓のECMは、すべての適用プロトコルにわたって目に見える違いなしに、保存されていました。

    図6

    図6:H /脱細胞化肝臓行列のE染色 。 AP:圧力条件を振動させることなく、肝動脈を介して灌流脱細胞肝行列。 + P:振動圧力条件下での肝動脈を介して灌流脱細胞肝行列。 PA-P:脱細胞化肝臓MATRIX圧力条件を振動させずに、門脈を介して灌流しました。 PA + P:振動圧力条件下で、門脈を介して灌流脱細胞肝行列。矢印:残りの細胞クラスター。

    DNA含量

    違いは振動圧力条件(; A + P PV + P)の下で灌流群においてのみ統計的に有意であったが、肝マトリックスの乾燥重量あたりのDNA含量は、ネイティブの肝臓に比べ、すべての実験群で減少しました。乾燥重量あたりのDNAの最低量は、振動圧力条件下で肝動脈を介して灌流した肝臓で見られました。

    図7

    図7:肝マトリックス (。Strueckerら 14から変更) の乾燥重量あたりのDNA量 。それら散らすより肝動脈ショー少ない残りのDNAを介して脱細胞化肝臓門脈を経由してdを行います。振動圧力条件下で灌流肝臓はこれらの条件を行うことなく、脱細胞化されるものよりも少ない残りのDNAを示しています。このように、振動圧力条件下で肝動脈を介して灌流肝臓は少なくとも残りのDNA含量を示します。

    腐食キャスティング

    脱細胞肝行列の腐食キャスティングは、(ポータル静脈系、動脈系と胆管系のタンパク質フレームワークを含む)肝臓のミクロ解剖学を脱細胞化中に保存されていることを確認しました。

    図8
    図8:脱細胞化ラット肝マトリックス (。Strueckerら 14から変更) の腐食キャスティングの写真 。すべての細胞の除去にもかかわらず、門脈静脈(青)および動脈(赤)システムを含む臓器のミクロ解剖学は、保存されています。 REMA胆管系のining主枝は黄色で鋳造されています。

    表1
    表1:ラット肝脱細胞に振動圧力条件の影響と灌流経路を評価するための実験群。

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    Discussion

    ラット肝収穫と脱細胞化のための提示の技術を容易に再現可能であるが、考慮すべき特定の重要なステップがあります:

    それは血液凝固を活性化し、肝臓内の血栓形成につながる可能性があるため、肝臓収穫の準備中に、重度の出血を回避することが重要です。私どもの意見では、門脈を介して灌流の間、肝動脈を介して血液流入を回避するために、門脈のカニューレ挿入直前に腹部大動脈を切開することが有利です。肝臓は、カニューレを挿入し、明確に灌流された後、血餅形成は、もはや問題ではありません。

    灌流円に気泡のエントリは、ガス塞栓症を防止するために避けなければならないので、潅流装置の肝臓収穫および輸送の後、潅流装置と肝臓の接続は、特に重要なステップです。これは、三方弁を事前入力することが有用である私PBSを灌流システムにバルブを接続する前に、直接注射器と細いカニューレを用いて、肝臓カニューレに接続されているのです。

    灌流後に再チェックする必要がありますが、すべてのチューブコネクタ、三方弁とチューブが完全に接続されているか、確立されています。肝臓はより長い時間( 例えば 、O / N)のために灌流している場合は、接続中であっても、小さな誤差は、このように致命的な灌流の結果につながる、灌流システムに吸い上げた空気につながることができます。

    提示されたデータは、最高の脱細胞化の成果のために圧力変化を発振の最適な圧力及び頻度は不明であるという事実によって制限されます。また、圧力制御灌流は、フロー制御の灌流はよりもより良く、より安定した結果につながる可能性があります。流れが自動的にBするので圧力制御灌流は、同じ結果で、異なるサイズおよび重量の肝臓への1つの灌流プロトコルの適用を可能にeが適応します。

    肝動脈と門脈は、大きさや生理的流量の点で大きく異なります。したがって、一定の灌流速度(5ml /分)を確実に2血管系内の異なる灌流圧をもたらします。同様に、一定の灌流圧は異なる灌流速度になります。 2灌流経路を介して脱細胞化の有効性を比較する一つの方法は、両方の経路を介して生理的な灌流圧、または灌流速度で灌流を行うことです。しかし、今回の研究の結果は比較可能にするために、我々は両方のルートの一定の灌流速度を選択しました。残念ながら、私たちのデバイスを使用して、我々は灌流肝臓内の灌流圧を測定することができませんでした。

    次世代灌流装置は、必要な灌流媒体の量を最小限にするために小さくなります。また、ポンプ装置は、圧力制御灌流を可能にします。

    目E提示技術は再現性、均質なラット肝臓脱細胞化のために非常に有用で表示されます。提示された技術は、in vitroで再細胞化および器官の成熟のために適切であるかどうかは、さらに対処する必要があります。振動圧力条件が再増殖細胞に影響を与えるかどうかは、さらなる実験の対象となります。

    提示された技術は、他のラット肝灌流装置よりも高度であり、いくつかの明らかな利点を示しています振動圧力条件が適用される場合1)均質な脱細胞化は、良好な結果が得られ、再現性があります。 2)灌流装置を密封し、マトリックスの再増殖および長期灌流のための前提条件である無菌の脱細胞化を可能にします。 3)提示されたプロトコルは、他の公開プロトコルよりも短くなっているが、まだ非常に効果的です。 4)門脈と肝動脈の選択的灌流が可能な別のシステムを介して、選択的な細胞再増殖をレンダリングし、これは重要なツールであってもよいです。

    灌流装置は洗練およびラット肝脱細胞化を最適化するためにさらに脱細胞化実験において適用されます。圧力制御灌流の影響を実験的に評価され、フロー制御灌流と比較されます。再増殖、文化、成熟の実験のための他の要素( 例えば 、「透析ユニット」は、熱交換器、酸素供給)の添加は、提示デバイスを開発することが可能と合理的に表示されます。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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