Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Decellularization ve Recellularization vitro 1'de işlevsel ve çoklu organ üretilmesini sağlayabilir. Kaldırma hücreleri ile antijenik madde ile (ör., DNA, a-Gal epitopları), bir organdan, olmayan ya da daha az immünojenik hücre dışı matris (ECM) elde edilebilir. Bu matris, bir organ, üç boyutlu mikroanatomisinin korur ve farklı, muhtemelen ksenogeneik kökenli 2 hücreleri ile yeniden popüle için ideal bir biyolojik matris olarak görev yapabilir. Bu durumda, bir hücresizleştirilmiş sıçan karaciğer matrisi insan karaciğer hücreleri ile yeniden doldurulur edilebilir. Bu insanlaştırılmış mikro-karaciğer hastalıkları (örn., Doğumsal metabolik hastalıklar, viral hastalıklar veya maligniteler) veya preklinik ilaç testi 3 araştırma için bir ex vivo modeli olarak hizmet verebilir.

Sıçan karaciğer perfüzyon decellularization için çeşitli protokoller zaten 4-13 yayınlanmıştır. Tüm protokollerde, decellularleştirilmesi kanüllü portal ven aracılığıyla alkali iyonik veya non-iyonik deterjanlar perfüzyon ile elde edilmiştir. Bizim bilgimize göre, biz portal ven ve / veya sıçan hepatik arter 14 üzerinden seçici perfüzyon ile sıçan karaciğer decellularization bildiren ilk gruptu. Karaciğer farklı vasküler sistemlerinin seçici perfüzyon etkinleştirilmesi hücre yeniden popüle önemli bir rol oynayabilir, bundan başka, daha decellularization sonuçlar etkinleştirmek olabilir.

Burada ayrıntılı çalışmada, karaciğer titreşen basınç koşullarında perfüzyon sağlayan bir ısmarlama tescilli perfüzyon cihazında perfüze edildi. Bu basınç koşulları karaciğer fizyolojik solunum bağımlı perfüzyon taklit: in situ, karaciğer hareketi solunum sırasında karaciğer perfüzyon üzerinde doğrudan etkisi vardır diyaframın copula altında asılı. İlham, özellikle optimize diyaframın düşürülmesi ve karaciğerde sıkma yol açarhepato-venöz çıkış, oysa son karaciğer yükselmesi ve portal venöz girişi 15 optimize karın içi basıncının düşürülmesi yol açar.

Amacımız salınan basınç koşulları karın içi koşullar ex vivo taklit ederek sıçan karaciğer perfüzyon decellularization homojenliği üzerinde bir etkisi olup olmadığını araştırmaktır. decellularization sürecinin homojenliği perfüzyon decellularization bir hafife bir faktör olabilir. Bilinen tüm maddeler ECM karaciğer decellularization neden değişiklikler için kullanılır. Diğer alanlarda zaten tamamen decellularized oysa kötü perfüze alanlarda hücreler, ECM içinde kalır. Geri kalan hücrelerin çözmek için, perfüzyon süresi ya da basınç iyi perfüze alanlara daha fazla değişiklik neden yükselmiş olması gerekir. Bu nedenle, decellularization deterjanlar organ içindeki homojen dağıtılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlar Deneysel Tıp (FEM, Charité, Berlin, Almanya) için Tesisi'nde tutuldu ve tüm deneysel protokoller gözden geçirilecek ve Devlet Sağlık ve Yerel İşleri Ofisi (LAGeSo, Berlin, Almanya tarafından kabul edildi;. Reg No O 0365 / 11).

1. Karaciğer Hasat

  1. Ön Cerrahi hazırlık
    1. Sabitleme için bir mantar plaka kullanın. Plaka üzerinde tıbbi örtü koyun. Dört iğneler kullanılarak, intraoperatif inhalasyon narkoz için mantar plaka üzerinde bir inhalasyon maskesi düzeltmek.
  2. Portal Venöz Kanül prearrangement
    1. Üç-yollu bir periferal venöz kateter (G 20) bağlanır. kateter yaklaşık bir uzunluğa sahip, eğik olarak kesilmelidir. 1,5 cm.
    2. De hava Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir 10 ml şırınga kullanarak sistem. Dikkatle de hava gaz embolisi olumsuz perfüzyon decellularization etkileyebilir çünkü çok önemlidir.
  3. PrearrangementArter Kanül
    1. Kelebek kanül kullanıldığı ve 5 mm bir uzunluğa iğne kesti. 5 mm iğne ve superglue ile sabitleyin, 5 cm tüp (OD 0.96 mm ID 0.58 mm) takınız. Büyük tüp içine ve superglue ile sabitleyin, 2 cm uzunluğunda bir tüp (OD 0.61 mm ID 0.28 mm) yerleştirin.
    2. Bir dayanak olarak bu yapı üzerinde başka tüp kayma ve superglue ile sabitleyin. De hava Ringer çözeltisi ile dolu bir 5 ml şırıngaya arteryel kanül.
  4. Anestezi ve Analjezi
    1. 1.5 L / dakikalık bir akış oranında% 3.5 oksijen izofluran anestezi indüksiyon odasında sıçan narkozu neden.
    2. Çalışma sırasında analjezi sağlamak için, karın içinden metamizol (100 mg / kg vücut kütlesi) ve düşük doz ketamin / medetomidini (kg vücut ağırlığı başına 10 mg / 0.1 mg) enjekte edilir.
    3. Cerrahi anestezi sonraki bakım için inhalasyon maskesi üzerinden 1 L / dk oksijen% 1.5 izofluran sağlayın.
  5. Ameliyat öncesi Düzenlemeler <ol>
  6. Elektrikli kesme makinesi ile liberal karın Tıraş. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın traş kesi sitesini nemlendirin.
  7. Hazırlanan plaka üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin inhalasyon maskesi içine kafasını takın ve tıbbi bant ve iğneler ile bacaklarda düzeltmek. Bir gazlı bez kompres ile aşırı etanol ve kürk çıkarın.
  • Anestezi Değerlendirmesi
    1. Solunum hızı izleyerek anestezi derinliği değerlendirin. Anestezi (40-60 solunum / dk) yeterince derin görünüyor zaman analjezi her iki arka bacaklarda ayak parmakları arasında cilt çimdik cerrahi forseps kullanarak ayak tutam refleks tetiklemek için deneyerek yeterli olup olmadığını kontrol edin.
  • Karın Yaklaşım
    1. Mesane üstünde kaudal karın duvarı içine medyan kesi yapmak. V-şekilli bir biçimde her iki lateral kot kemerler için, bu noktadan itibaren kesilir. Diyaframın içine kesmek için özen gösterin. Göğüs üzerine kesilmiş karın duvarı çekin. Bir Overholt kelepçe ile kılıç şeklinde Fix cranially çekin ve bir lastik bant ile sabitleyin. Bağırsak tahliye ıslak pamuk bezlerden kullanın. Islak gazlı bez içinde bağırsak sarın. Ayrıca, ıslak bandaj ile tüm karın marjlarını kapsamaktadır.
  • Karaciğer Hazırlık
    1. Falciform ligament parçalara ayır. Cranially diyaframın kubbe altında medial ve sol karaciğer loblar tutmak için ıslak bir gazlı bez bandaj kullanın. Triadın ve üst omentum karaciğer lobu Açığa.
    2. Lob mobil kadar dikkatlice üst omentum lob bağlı ligament incelemek için iki microforceps ve yaylı makas kullanın. Yerinde medial ve sol lobu tutan, gazlı bez kompres altında ıslak pamuklu çubuklarla kullanarak lob hareket ettirin.
    3. Üst omentum karaciğer lobunun seferber sonra sola mide hareket ettirin. Bir kelepçe ile mide Fix ve microforceps ve yaylı makas ile küçük omentum teşrih.
    4. Alt omenta Seferberl karaciğer lobu mobil ve daha sonra onun boşluğuna geri lobun taşımak kadar. Duodenum korumak için bir Backhaus kelepçe kullanın. Streç ve triadın maruz sola duodenum taşıyın. Gergin hepatoduodenal ligaman koledok circumscribe.
    5. Adipoz ve pankreas dokusundan safra kanalını parçalara ayır. Safra kanalını safra kanalı bifurkasyondan 1,5 cm kesin. Çevreleyen yağ dokusundan portal ven parçalara ayır. Gastroduodenal ven Açığa.
    6. Ipek 6-0 ile iki kez gastroduodenal ven bağlanır ve 2 bitişik harfler arasındaki damar bölün. Tüm arteriyel rami ortaya kadar çevreleyen dokudan çölyak gövde ve ortak hepatik arter parçalara ayır.
    7. Çevreleyen dokudan gastroduodenal arter Özgürleştirin. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez gastroduodenal arter kravat. 2 bitişik harfler arasındaki gastroduodenal arter parçalara ayır.
    8. Dalak arteri kurtarmakçevreleyen dokudan. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez dalak arteri bağla. 2 bitişik harfler arasındaki dalak arteri parçalara ayır.
    9. Çevreleyen doku sol gastrik arter Özgürleştirin. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez sol gastrik arter kravat. 2 bitişik harfler arasındaki arter parçalara ayır.
    10. Sağ böbrekte ve sağ yanal karaciğer lobu arasındaki alt kaval ven circumscribe. Retroperitoneal uzaydan damar parçalara ayır. Çölyak gövde izleyerek aorta Açığa.
    11. Retroperitoneal adipoz doku teşrih. Inferior vena kava içine 1 ml serum fizyolojik içinde 1.000 IE heparin enjekte edilir. Kanül geri çekin ve pamuklu ped ile kesi kapatın. Heparin sistemik etki için 1-2 dakika bekleyin.
    12. Forseps ile aorta circumscribe. Aorta incelemek ve sıçan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. Ayrıca, böbrek distal inferior vena kava teşrih.
  • Portal Venöz Kanülasyon (Kullanım bölüm 1.2 hazırlanan kanül)
    1. Distal portal vende bir balık ağzı kesi olun. Forseps ile kesi açın ve portal ven cannulate. Karaciğer rengini yitiren kadar 20 ml Ringer solüsyonu ile karaciğer yıkayın ve bitişik harfler (ipek 6-0) ile kanül düzeltin.
  • Arteriyel Kanülasyon (Kullanım bölüm 1.3 hazırlanan kanül)
    1. Çölyak gövde üzerinde aorta parçalara ayır. Retroperitoneal uzaydan aort segmenti Özgürleştirin. Aort yama oluşturmak için uzunlamasına aort segmenti kesin. Statik tutucu içine kendini inşa kanül yerleştirin.
    2. Kanül üzerinde aort yama kayma 2 forseps kullanın. Kanül üzerinde ipek 6-0 ile hepatik arter bağlanır ve dayanak olarak yama sabitleyin.
  • Karaciğer eksplantasyonu
    1. , Diyaframı açıp dairesel kesi yapmak ve çevre yapılardan karaciğer teşrih.
  • Depolama
    1. Stokullanılana kadar 350 ml Ringer çözeltisi ile doldurulmuş, steril 500 ml tankında karaciğer yeniden.
  • 2. Deterjan Çözümleri

    1. % 10 Triton X-100 stok solüsyonu
      1. 900 ml su dest ile 1.000 ml'lik şişe doldurun. ve 100 ml Triton X-100 (% 99,9) ekleyin. Triton X-100 eritmek için bir karıştırıcıyı kullanarak. Damıtılmıs şişeyi doldurun. 1000 ml'lik toplam hacme kadar ulaşılır.
    2. % 1 Triton X-100
      1. 1.000 ml şişe stok çözeltisi, 100 ml (% 10) ilave edilir. 900 mi su Hedef ekle. ve iki kez şişeyi çalkalayın. Steril bir filtre içerisinden,% 1 Triton X-100 çözeltisi filtre.
    3. % 10 SDS Stok Çözeltisi
      1. 900 ml su dest ile 1.000 ml'lik şişe doldurun. ve 66.99 g SDS (% 99.9, yoğunluk 0.67) ekleyin. SDS çözmek için bir karıştırıcı kullanın. Damıtılmıs şişeyi doldurun. 1000 ml'lik toplam hacme kadar ulaşılır.
    4. % 1 SDS
      1. 1.000 mi bot stok çözeltisi, 100 ml (% 10) ilave edilirtle. 900 mi su Hedef ekle. ve iki kez şişeyi çalkalayın. Steril bir filtre ile% 1 SDS çözeltisi filtre.

    3. Decellularization

    1. Perfüzyon Cihaz Set-up Figür 1

    Şekil 1:. Oscillating Basınç Koşullarda Seçici Arter ve Dört Rat karaciğerinin Portal Venöz Perfüzyon için Perfüzyon Cihaz Programı (. Struecker ark değiştirilmiş 14)

    1. Üç yollu ve dolum seviyesini düzenleyen ve 500 ml% 0,9 NaCl ile reaktörü doldurmak için Heidelberger uzantısı drenaj bağlayın.
      Şekil 2,

    Şekil 2:. (4) portal venöz yoldan kabarcık kapanı (5) (2) ya da arteriyel ac yoluyla uzak ucuna perfüzyon set-up Plan perfüzyon odasına bağlantı (1.400 cm 3) (1)ri (3). Kabarcık kapanı (5) uzak ucunda bir tıkama (4) ve bir delik (6) ile donatılmış olmalıdır. Bir Heidelberger uzatma (7) kabarcık tuzak (5) bağlayın. Pompa segmenti (8) ile Heidelberger uzantısı bağlayın. Bundan başka, bir başka Heidelberger uzantısı (9), pompa segmenti (8) bağlanır. Deterjan çözeltisinin (10) şişenin içine geçen Heidelberger uzantısı (9) takın. (Ya da birden perfüzyonları durumunda basınç dağıtıcıya) perfüzyon odasına solunum cihazı (11) takın. Reaktör sıvıları boşaltmak için, atık şişe (12) çıkışı bağlayın.

    1. Pompanın içine pompa segmenti yerleştirin. PBS ile döngüsü doldurmak için pompayı çalıştırın, kabarcık kapanı distal ucunu kapatın ve havalandırma açın. Kabarcık alt güvenli PBS (2-3 cm) ile kaplı olduğunda, havalandırma kapatın ve baloncuk kapanı distal ucunu açın.
    2. Karaciğer Kurulum
      1. İlgili reaktör erişmek için portal ven kanül üç yönlü stopcock bağlayın. Carteriyel erişim arteriyel kanül taşıyıcılarına bağlan- ması. Hava sistemlerini girmemesini sağlamak için dikkatli olun.
    3. Titreşimli Basınç Koşullar Uygulaması
      1. 15 bpm bir frekans ve 26 mbar (dak. 4 mbar, maks. 30 mbar), bir genlik solunum cihazı kullanın. Basınç dağılımı odasına solunum bağlayın ve reaktöre odasına bağlayın. Basınç uygulamasını başlatın.
    4. Decellularization Protokolü
      1. / Dakika, 5 ml bir akış oranı ile perfüzyon adımları. 90 dakika boyunca,% 1 Triton X-100 ile birlikte karaciğer perfüzyonu ile decellularization başlatın. Perfüzyon odasının sabiti içinde ve perfüze karaciğer üzerindeki sıvı seviyesini korumak için perfüzyon cihazının çıkışı yoluyla atık effluence izin verin. 90 dakika sonra,% 1 SDS deterjan değiştirin.
        Şekil 3,
        Tablo 1
    <p> Şekil 3: Tüm Deneysel Grupları için Perfüzyon Protokolü.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    homojenliği ve dolayısıyla farklı decellularization protokolleri etkinliği makroskopik gözleminden, histolojik analiz ve hücresizleştirilmiş karaciğer matrisleri içinde kalan DNA içeriğinin analizi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, korozyon döküm decellularization sonra karaciğerinin sağlam mikroanatomisinin görselleştirmek için yapıldı.

    Makroskopi

    Decellularization sırasında, karaciğer hücre içeriğine çıkarılmasını gösteren lucent hale gelir. Portal ven aracılığıyla perfüze karaciğerleri sırasında ve decellularization (beyaz oklar) sonra, makroskopik olarak görülebilen diğer hücreler ile, homojen olmayan iyi açıklanması (ve dolayısıyla decellularization) göstermiştir. Hepatik arter yoluyla perfüze karaciğerleri daha homojen decellularization ders ve hiçbir görünür kalan hücreler gösterdi. Karaciğer salınan basınç koşulları uygulanması ile perfüze edildi durumunda geriye kalan hücreler bağımsız perfüzyon rotanın, görünür.

    Şekil 4,
    Şekil 4: Basınç Koşullar el zımpara olmadan Sıçan Karaciğer decellularization makroskopik Sonuçları. Sol: hepatik arter yoluyla decellularized Rat karaciğer. Karaciğer makroskopik olarak görünür kalan hücreler olmadan, lucent görüntülenir. Sağ: portal ven yoluyla perfüze Karaciğer. Karaciğer homojen bir makroskopik görünür hücreleri ile, decellularized görünür

    Şekil 5,
    Şekil 5: salınan basınç koşullarında sıçan karaciğer decellularization makroskopik sonuçları. Sol: hepatik arter yoluyla decellularized Rat karaciğer. Sağ: portal ven yoluyla perfüze Karaciğer. Her iki karaciğerleri görünür kalan hücreler olmadan, lucent görünür.

    Histolojik Değerlendirme

    Decellularized karaciğer matrisleri destek histolojik değerlendirmeed makroskobik bulgular. Hepatik arter yoluyla perfüze karaciğerleri bakılmaksızın salınan basınç koşullarında perfüze edildi olsun, hiçbir kalan hücrelerin gösterdi. Portal ven aracılığıyla perfüze karaciğerleri ve titreşim basınç koşullarında uygulanması ile perfüze edildi bile, kalan hücreler bölgelerini gösterdi. Bununla birlikte, salınım basınç şartlarının uygulanması portal ven aracılığıyla perfüze karaciğerlerinde kalan hücre kütlesi azalır. Karaciğerinin ECM uygulanan tüm protokoller arasında gözle görülür farklılıklar olmadan, korunmuş oldu.

    Şekil 6,

    Şekil 6: H / decellularized Karaciğer Matris E Boyama. AP: Basınç koşulları salınan olmadan hepatik arter yoluyla perfüze decellularized karaciğer matrisi. A + P: salınan basınç koşullarında hepatik arter yoluyla perfüze decellularized karaciğer matrisi. PA-P: decellularized karaciğer matrix basınç koşullarının salınan olmadan portal ven yoluyla perfüze. PA + P: salınan basınç koşullarında portal ven yoluyla perfüze decellularized karaciğer matrisi. Oklar: hücre kümeleri Kalan.

    DNA içeriği

    Farklar sadece istatistiksel olarak anlamlı salınım basınç koşullarında (A + P PV + P) altında perfüze gruplarda olmasına rağmen karaciğer matris kuru ağırlığı başına DNA içeriği, yerli karaciğerlerinde ile karşılaştırıldığında tüm deney gruplarında gerilemiştir. ağırlığı başına DNA düşük miktarda salınım basınç şartları altında, hepatik arter yoluyla perfüze karaciğerlerinde bulunmuştur.

    Şekil 7,

    Şekil 7: (. Struecker ark 14 değiştirilmiş) Karaciğer Matrix DNA içeriği Başına Kuru Ağırlık. Hepatik arter gösterisi aracılığıyla decellularized Karaciğerler az olanlar perfuse daha DNA kalanportal üzerinden d yapmak ven. Salınan basınç koşullarında perfüze karaciğerleri yapmak için şu koşullar olmadan decellularized daha az kalan DNA göstermektedir. Böylece, salınan basınç koşullarında hepatik arter yoluyla perfüze karaciğerleri az kalan DNA içeriğini göstermek.

    Korozyon Döküm

    Decellularized karaciğer matrisi Korozyon döküm (portal venöz sistemin protein çerçevesinde arteriyel sistemi ve safra sistemi dahil olmak üzere), karaciğerinin mikroanatomisine decellularization sırasında korunmuş olduğunu doğruladı.

    Şekil 8,
    Şekil 8: (. Struecker ark 14 değiştirilmiş) bir decellularized Sıçan Karaciğer Matrix bir Korozyon Döküm Fotoğraf. Bütün hücrelerin çıkarılması rağmen, portal ven (mavi) ve arteriyel (kırmızı) sistemleri de dahil olmak organının mikroanatomisine, muhafaza edilir. remaSafra sistemin ining ana dalları sarı döküm edilmektedir.

    Tablo 1
    Tablo 1: Titreşimli Basınç Şartlar Etkisi ve Sıçan Karaciğer decellularization üzerinde Perfüzyon Güzergah değerlendirilmesi için deneysel gruplar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Sıçan karaciğer hasat ve decellularization sunulan tekniği kolayca tekrarlanabilir olmasına rağmen, dikkate bazı kritik adımlar vardır:

    Kan pıhtılaşmasını aktive edecek ve karaciğer içinde kan pıhtısı oluşumuna neden olabilir, çünkü karaciğer hasat için hazırlık sırasında, şiddetli kanama önlemek için önemlidir. Bizce, bu portal ven yoluyla perfüzyon sırasında hepatik arter yoluyla kan akışını önlemek için portal ven kanülasyonu önce doğrudan abdominal aorta kesilirken avantajlıdır. Karaciğer kanüle ve açıkça perfüze sonra, kan pıhtısı oluşumu, artık bir konudur.

    Perfüzyon çember içine gaz kabarcıklarının giriş gaz embolisi önlemek için kaçınılmalıdır, çünkü perfüzyon cihazına karaciğer hasat ve taşıma sonrasında perfüzyon cihazına karaciğerinin bağlantı özellikle kritik bir adımdır. Bu üç yollu vana önceden doldurmak için yararlı olan IPBS perfüzyon sistemine valf bağlamadan önce, doğrudan bir şırınga ve ince bir kanül kullanılarak, kanül karaciğer bağlı s.

    Perfüzyon kurulduktan sonra, tüm tüp konnektörleri olsun, valfler ve tüpler mükemmel bağlanan üç yollu yeniden kontrol edilmelidir. Karaciğerleri daha uzun süreler için perfüze edilir (örn., O / N), bağlantılı bile küçük bir hata, böylece ölümcül sonuçlara yol açan perfüzyon, perfüzyon sistemine sifon havaya neden olabilir.

    Sunulan veriler iyi decellularization sonuçları için salınım basınç değişiklikleri optimal basınç ve frekans belirsizdir gerçeği ile sınırlıdır. Ayrıca, basınç kontrollü perfüzyon akışı kontrollü perfüzyon göre daha iyi ve daha sabit sonuçlara yol açabilir. Basınç kontrollü perfüzyon, aynı sonuçla farklı boyut ve ağırlıkları, karaciğerinde bir perfüzyon protokolünün uygulanmasını sağlayan akış otomatik olarak b çünküe uyarlanmış.

    hepatik arter ve portal ven büyüklüğü ve fizyolojik akış oranları açısından önemli ölçüde farklıdır. Bu durumda, sabit bir perfüzyon oranı (5 ml / dakika), kesinlikle, iki damar sistemi içinde farklı perfüzyon basıncı ile sonuçlanacaktır. Benzer şekilde, sabit bir perfüzyon basıncı farklı perfüzyon oranları ile sonuçlanacaktır. İki perfüzyon yollardan decellularization etkinliğini karşılaştırmak için bir yöntem, her iki güzergah üzerinden fizyolojik perfüzyon basınçları veya perfüzyon oranlarında perfüzyon gerçekleştirmek olacaktır. Ancak bu çalışmada sonuçlar karşılaştırılabilir hale getirmek için, her iki güzergah için sürekli perfüzyon oranı seçti. Ne yazık ki, bizim aygıtı kullanarak, biz perfüze karaciğerleri içinde perfüzyon basıncını ölçmek mümkün değildi.

    Bizim nesil perfüzyon cihazları gerekli perfüzyon medya miktarını en aza indirmek için daha küçük olacaktır. Ayrıca, pompa cihazları basınç kontrollü perfüzyon sağlayacaktır.

    ThE sunulan tekniği tekrarlanabilir, homojen sıçan karaciğer decellularization için çok yararlı görünüyor. Sunulan teknik, in vitro recellularization ve organ olgunlaşması için uygun olup olmadığı ayrıntılı ele alınması gerekir. Salınan basınç koşullarının yeniden doldurulur hücreleri üzerinde bir etkiye sahip olmadığı ileri deneyler tabi olacaktır.

    sunulan teknik, diğer sıçan karaciğer perfüzyon cihazlara göre daha sofistike ve çok net avantajlar gösterir: salınan basınç koşullarının uygulandığında 1) homojen decellularization iyi sonuçlar, tekrarlanabilir. 2) perfüzyon cihazı mühürlü ve matris kaybolmuş türlerin yeniden ve uzun vadeli perfüzyon için bir ön koşuldur steril decellularization, mümkün kılar. 3) sunulan protokol, diğer yayınlanmış protokoller daha kısadır ama yine de çok etkilidir. Portal ven ve hepatik arter 4) Seçici perfüzyon farklı sistemler üzerinden seçici hücre repopulation mümkün kılar,hangi önemli bir araç olabilir.

    perfüzyon cihazı rafine ve sıçan karaciğer decellularization optimize etmek için ileri decellularization deneylerde uygulanacaktır. Basınç kontrollü perfüzyon etkisi, deney değerlendirilir ve akış kontrollü perfüzyonu ile karşılaştırılacaktır. başka elemanların ilavesi (örn., bir "diyaliz birimi", bir ısı eşanjörü, bir oksitleme) yeniden çoğalması, kültür ve olgunlaşma deneyleri için başka sunulan cihaz geliştirmek mümkündür ve makul görünmektedir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics