细胞标记和超顺磁性氧化铁纳米粒子靶向

Bioengineering

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Tefft, B. J., Uthamaraj, S., Harburn, J. J., Klabusay, M., Dragomir-Daescu, D., Sandhu, G. S. Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (104), e53099, doi:10.3791/53099 (2015).

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Abstract

细胞和治疗剂的靶向递送将通过浓缩的治疗效果在目标部位,同时最小化有害的影响,以脱靶部位受益广泛的生物医学应用。磁性细胞靶向是一种高效,安全,简单的交付技术。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)是生物可降解的,生物相容的,并且可以被内吞进入细胞,使它们响应于磁场。合成过程涉及创建磁铁矿 (Fe 3 O 4)纳米颗粒随后高速乳化以形成聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的涂层。所述PLGA-磁铁矿SPIONs是大约120纳米的直径,包括约10nm直径磁铁矿核心。时,放置在培养基中,SPIONs自然被细胞内吞和细胞质内内涵体小簇存储。这些颗粒赋予足够的磁质细胞以允许磁场内定位。许多细胞分选和靶向应用是由呈现各种细胞类型响应于磁场启用。 SPIONs具有多种其它生物医学应用,以及包括用作医学成像造影剂,靶向药物或基因递送,诊断测定,并生成局部热疗的肿瘤治疗或组织焊接。

Protocol

1.合成磁铁矿凝胶

  1. 通过用浓盐酸,随后通过离子交换水接着乙醇清洗所有玻璃器皿。晾干O / N,优选在干燥炉中。
    注意!盐酸是有害的 - 佩戴个人防护装备和工作在通风橱;酒精是有害的 - 佩戴个人防护装备。
  2. 使用Dreschel瓶中脱气500ml的去离子H 2 O的通过轻轻鼓泡N 2气30分钟。
  3. 建立的化学通风橱内的磁铁矿合成装置。
    1. 放置的500毫升三颈圆底烧瓶中的电热套加热器内并使用夹子固定中心颈和站立。
    2. 安装橡胶隔片进入圆底烧瓶的侧颈之一和回流冷凝器用橡胶隔片进入的剩余侧颈部。不断通过回流冷凝器运行冷水。
    3. 穿刺个Ë圆底烧瓶的橡胶隔片与连接到N 2气体管线针和穿刺回流冷凝器的橡胶隔片与连接到运行到鼓泡的气体线的针烧瓶与水)以可视化气体流出。
    4. 经由桨适配器安装刀片桨到圆底烧瓶的中心颈。附加叶片桨的轴,顶部搅拌器安装到一个支架上。
  4. 吹扫的圆底烧瓶用N 2气和离开N 2气流入以低,但检测率。
  5. 从圆底烧瓶中去除回流冷凝器和添加1.000克铁(III),氯化0.6125克铁(Ⅱ)四水合氯化和50脱气H 2 O的溶液
    注意!氯化铁和氯化亚铁四是有害的 - 穿戴个人防护装备。
  6. 替换回流冷凝器和搅拌以1,000rpm,同时加热到50C。在这些条件下搅拌产生10纳米直径磁铁矿纳米颗粒。
  7. 一旦在50℃下,通过在橡胶隔膜的圆底烧瓶注入,同时仍然搅拌加入10毫升28%的氢氧化铵溶液。
    注意!氢氧化铵是有害的 - 佩戴个人防护装备。
    注:氢氧化铵溶液用于以沉淀磁铁矿和溶液应变黑。
  8. 取下橡胶隔膜 N 2气体管线从圆底烧瓶中,并加热到90℃,蒸出掉氨气,同时仍然搅拌。
    注意:这是可选的通过刺穿回流冷凝器的橡胶隔片保持N 2流入圆底烧瓶中,然而,磁铁矿到磁赤铁矿的氧化作用是在此步骤中可忽略不计。
  9. 一旦达到90℃,加入1 ml的油酸向圆底烧瓶,同时仍然搅拌。油酸是用于涂覆磁铁矿呐noparticles形成磁铁矿凝胶。
    注意!油酸是有害的 - 佩戴个人防护装备。
  10. 更换橡胶隔膜 N 2气体管线到圆底烧瓶中并取出回流冷凝器。
  11. 熄火和搅拌在500rpm下2小时。
  12. 从电热套加热器除去圆底烧瓶中,并在使用保持抵靠烧瓶保留磁铁矿凝胶底部强磁铁倒出任何剩余的液体。
    注意!处理强力磁铁格外小心,以免损坏或人身伤害。
  13. 允许磁铁矿凝胶风干O / N(可选)。

2.净化磁铁矿凝胶

  1. 加入40毫升己烷进圆底烧瓶以溶解磁铁矿凝胶
    注意!正己烷是有害的 - 佩戴个人防护装备和工作在通风橱。
  2. 使用分液漏斗用40ml脱气H 2 O的,以去除残留的H 2 O的往复米磁铁矿的解决方案。
    1. 慢慢倒入分液漏斗内的磁铁矿溶液到 H 2 O和轻轻摇动两相液5分钟。
    2. 排出并丢弃下部水分数。
    3. 慢慢加入40毫升去脱气 H 2 O至分液漏斗中使得其沉降的磁铁矿溶液下方并轻轻地旋转并如前排水。
    4. 重复洗第三次。
  3. 转移磁铁矿溶液至锥形瓶中,加几铲值得无水硫酸钠,并乱舞从磁铁矿溶液中除去任何剩余的残留H 2 O的。
  4. 过滤通过1微米的滤纸的磁铁矿溶液在过滤漏斗以除去硫酸钠和残余H 2 O
    注:建议使用真空辅助。
  5. 磁铁矿溶液转移至50毫升烧瓶中蒸发,并使用旋转蒸发器以蒸发己烷为在以下条件下2小时:中等旋转速度,施加真空,在50℃的水浴蒸发烧瓶中,并通过冷凝器24℃的循环水。
    注:可选,存储涂覆PLGA之前磁铁矿凝胶。

3.涂层的磁性纳米颗粒与PLGA壳牌

  1. 溶解3.60克的PLGA(75/25共混物)于240ml乙酸乙酯中以创建一个1.5%(M / V)溶液。注意:醋酸乙酯是有害的 - 佩戴个人防护装备和工作在通风橱。
  2. 用磁力搅拌器以创建一个5.0%(M / V)溶液溶解25.00克尼克F-127的在500毫升脱气H 2 O的。
    注:尼克F-127是充当一个生物相容的表面活性剂的非离子两亲嵌段共聚物。它有助于稳定在步骤3.3.2油包水乳液。
  3. 使用microspatula,收集磁铁矿凝胶成加权玻璃瓶中在六0.040克等分。 PERFORM下面的涂层和洗涤过程中的每个等份。
    注:等份是必要的,以确保有效的处理和磁倾析,这将最大化纯度和收率,同时最小化在步骤4中降解前,冷冻干燥。
    1. 添加磁铁矿凝胶的0.040克等分试样和40毫升的PLGA溶液至塑料烧杯中,并声处理的在超声波清洗10分钟。
    2. 添加80毫升的Pluronic溶液到塑料烧杯中,并立即用实验室混合器乳化在最高设定为7分钟,以在磁铁矿纳米颗粒为油包水乳液中的PLGA涂层。
    3. 立即稀释SPION溶液在1升去离子H 2 O和超声的1小时在化学通风橱中以蒸发乙酸乙酯。
    4. 一个强有力的磁铁旁SPION解决方案,并轻轻搅拌,收集棕SPIONs的磁铁。
      注意:这可能是必要的,以间歇性地搅拌几个小时该溶液s之前变成发白,表明大多数SPIONs的已收集。
    5. 滗水溶液,同时保留SPIONs与磁铁的烧杯中。
    6. 如下洗SPIONs三次。
      1. 暂停SPIONs于1L去离子H 2 O的
      2. 超声清洗20分钟的SPION解决方案。
      3. 一个强有力的磁铁旁SPION解决方案,并轻轻搅拌,收集棕SPIONs的磁铁。它可能需要间歇地搅拌几小时前的溶液变清,表明大多数SPIONs的已收集。
      4. 滗水溶液,同时保留SPIONs与磁铁的烧杯中。
  4. 收集来自六个磁铁矿凝胶等分的合成为一个单一的加权玻璃小瓶作为含水悬浮液的SPIONs。根据需要可选择倒出多余的水磁。

4.冻结SPIONs的-drying

  1. 冻结SPION解决方案。
  2. 冷冻干燥SPION解决方案O / N在冻干机。
  3. 称重冻干SPIONs。冻干SPIONs可以储存在-20℃,直到用于细胞标记。
    注:储存在-20℃下显着降低降解动力学,增加的货架寿命。

5.标记细胞SPIONs的

  1. 暂停在磷酸盐缓冲盐水(PBS)SPIONs的等分试样以40mg / ml的浓度,并超声处理30分钟。
  2. 添加SPION溶液到细胞的几乎汇合烧瓶中的细胞培养基的5微升/毫升的浓度。确保均匀分布轻摇烧瓶中。
  3. 孵育细胞16小时,在37℃。
  4. 轻轻吸培养基并用PBS洗涤细胞两次。
  5. 收集磁标记的细胞和用于实验。
  6. 未使用的SPION溶液可以储存在4℃,并应我们在短短几个月内编。超声清洗每次使用前30分钟。

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Representative Results

磁铁矿纳米颗粒是大约10的直径为在50℃下,以1,000rpm(图1)搅拌铁(III),氯化铁(Ⅱ)四水合氯化的水溶液的结果纳米。这些结果表明成功合成磁铁矿纳米粒子。它来验证从批次的一个小样本试图合成首次时采取磁铁矿纳米粒子的大小和形状是重要的。透射电子显微镜(TEM)是用于可视化这些粒子的首选方法。将批料应该被丢弃,合成应再次尝试,如果磁铁矿纳米颗粒不约10nm的直径和球形如图1。

使用高速乳化剂结果在PLGA-磁铁矿SPIONs,直径为120纳米(图2)涂覆的磁性纳米颗粒与PLGA。这些结果表明成功合成PLGA-磁铁矿SPIONs。它来验证从所述批量的小样本试图合成首次时采取的PLGA-磁铁矿SPIONs的大小和形状是重要的。扫描电子显微镜(SEM)是用于可视化这些粒子的首选方法。将批料应该被丢弃,合成应再次尝试,如果PLGA-磁铁矿SPIONs的直径不大约120纳米和球形如图2,虽然更大或更小的颗粒可能需要对某些应用中,组合物将是未知因此细胞标记,磁化率,和细胞毒性将不可预料。

血生长的内皮细胞培养用SPIONs 16小时的结果,在纳米颗粒的内吞作用(图3)。这些结果证明细胞SPIONs的成功标记。它来验证从所采取的细胞内SPIONs的存在是很重要的试图在第一次标记时批的一小部分。透射电子显微镜是用于可视化这些SPION标记的细胞的首选方法。细胞应丢弃和标记应该再次尝试,如果如图3中的 PLGA-mangetite SPIONs不显示为圆形细胞质核内体内聚集在一起黑色颗粒。此外,低级SPIONs的浓度可能会失败,使磁性细胞靶向和较高浓度SPIONs可以是细胞毒性的。如果需要的话,用于标记细胞SPIONs的浓度可以相应地调节。

铁装入细胞的量足以实现活细胞磁性捕获到铁磁植入医疗装置(图4)。这些结果证明成功SPION介导的磁性细胞定位。如果更强的细胞靶向效应是期望的,优选的策略是increa瑟所产生或施加磁场8,30的强度或梯度。增加用于标记细胞SPIONs的浓度只应尝试作为最后的手段,由于细胞毒性的担忧。如果提高细胞生存力是需要的,用于标记细胞SPIONs的浓度应降低。

图1
磁铁矿纳米颗粒的图1 TEM图像。磁铁矿纳米颗粒的直径约为10纳米观察用透射电子显微镜(TEM)。颗粒是球形并且尺寸均匀。比例尺= 100纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2 /> 图2的PLGA-磁铁矿SPIONs SEM图像。PLGA包覆磁铁矿SPIONs是大约120纳米的直径所看到的扫描电子显微镜(SEM)。颗粒是球形并且尺寸均匀。比例尺= 500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
一个磁标记的内皮细胞的图3. TEM图像。用透射电子显微镜(TEM)可视化的磁性标记的血液生长的内皮细胞。该SPIONs是由细胞内吞,自然,并存储在胞质内含体中的小群。左比例尺= 2微米,右比例尺= 0.5微米。经许可从24重新打印。/files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
的磁性细胞捕获图4.荧光显微图像。磁标记的内皮细胞以显著比率高于一非磁性支架(左)吸引到一个铁磁血管支架(右)。比例尺= 100微米。重新打印许可从24。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

正如任何纳米颗粒合成的协议中,反应物的化学物质的纯度是实现高质量SPIONs,将具有最小的细胞毒性作用是至关重要的。它购买很纯试剂,包括油酸(≥99%),铁(II),氯化四水合物(≥99.99%),铁(III),氯化(≥99.99%),乙酸乙酯因此重要(HPLC级,≥99.9% ),己烷(HPLC级,≥97.0%),氢氧化铵(≥99.99%)和硫酸钠(≥99.0%)。它是特别重要的,购买很纯和高品质的PLGA,其可以是相对昂贵的。此外,所有玻璃器皿必须彻底与盐酸,去离子水和乙醇洗涤,并允许在使用前干燥。

同样地,在协议中的纯化和洗涤步骤是关键的,以确保最终SPIONs将是高质量和具有最小的细胞毒性作用。磁铁矿胶必须是免费的尽可能多的氢氧化铵,水和己烷尽可能与PLGA涂布之前。因此,许多协议都用于确保磁铁矿凝胶的纯度。随后,PLGA-磁铁矿SPIONs必须无乙酸乙酯,普朗尼克,和过量的PLGA。最终SPION洗涤步骤是最耗时的协议的一部分,但必须完成,以确保高的纯度。具体而言,磁收集期间每次洗涤步骤的颗粒可以是非常耗时的。搅拌该溶液能大大提高颗粒收集的速度,但磁性搅拌棒,不能使用。以低速运转顶置式搅拌器是用于快速颗粒收集的最有效手段。确保SPIONs大褐色收集出现在磁铁和溶液呈现白色或透明的倾析之前。这通常需要几个小时的搅拌,但会导致更高的最终收率。磁倾析步骤,也有助于确保只有MAGN客位颗粒被保留,而所有非磁材料被丢弃。

过量的铁的水平可以是细胞毒性的,所以磁质,可以使用这种技术来赋予到细胞的量是有限的。铁的浓度可能需要被减少为特别敏感的细胞类型或增加的对特别弱的磁场,但在这里所描述的协议提供经过验证的起点,以平衡安全性和有效性。由这个协议中合成的SPIONs从与一个比1:15到的PLGA溶液通过磁铁矿的质量作出和SPIONs被引入细胞以细胞培养基的200微克/毫升的浓度。其中一个参数可以调整,以改变铁由每个细胞内吞的必要的量。

SPIONs是安全的人体移植和生物降解将随着时间的推移(半衰期约为40-50天)31。无论是磁铁矿和PLGA形成无害degrad通货膨胀的产品和从身体通过自然途径32清零。该SPIONs的可生物降解的性质是指任何细胞毒性作用将随时间减少,也限制了潜在的应用到那些不需要的细胞以保持数月以上的磁性能。 SPIONs也具有细胞标记和赋予而不需要表面蛋白的磁效应也不靶向配体易受曝光时形成的蛋白质电晕到生物环境33,34的优点。

赋予磁特性的细胞是对于需要靶向细胞递送或分拣29生物医学应用一系列广泛有用的。多种细胞类型已经证明安全地内吞SPIONs包括间质干细胞35,内皮祖细胞36,β胰岛细胞37,和神经干细胞38的能力。磁CEL升靶向可能优于其他细胞靶向技术当高程度的控制递送条件是必要的。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis Sigma-Aldrich 338818-100ML  Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml Ace Glass 5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%  Sigma-Aldrich 650528-1L Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint Sigma-Aldrich Z515558 For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1 Fisher 09-805P For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L Fisher FB-101-1000 For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL Fisher K954100-0344 
Glass vial caps Fisher 03-391-46 For use with glass vials
Glass vials, 2 ml Fisher 03-391-44 For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) Sigma-Aldrich 34859-1L  Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758 Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis  Sigma-Aldrich 380024-5G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis Sigma-Aldrich 451649-1G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL Voight Global EM0500/CEX1
Laboratory mixer Silverson L5M-A
Lyophilizer Labconco 7670520
Microspatulas Fisher 21-401-25A For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in Amazing Magnets C1000H-M Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC) Sigma-Aldrich O1008-5G  Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer IKA 2572201
Overhead stirrer clamp IKA 2664000 For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand IKA 1412000 For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010-023
Plastic beakers, 250 ml Fisher 02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) Purac PDLG 7502 PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture Sigma-Aldrich P2443-250G 
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia SciQuip SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle Monmouth Scientific PTFE Vessel Adaptor A480 For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller Clarkson 696613 For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm Ace Glass 5997-133
Rotoevaporator Clarkson 216949
Rubber septa, fits 24/40 Ace Glass 9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml Fisher 10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular Sigma-Aldrich 239313-500G 
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml Ace Glass 6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan Fisher 15-335-20A For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L Fisher 15-335-20
Vacuum controller Clarkson 216639 For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump Clarkson 219959 For use with rotoevaporator

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References

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