Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Calderón-Colón, X., Raimondi, G., Benkoski, J. J., Patrone, J. B. Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications. J. Vis. Exp. (105), e53102, doi:10.3791/53102 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Nanopartikelbaserade leveransfordon har visat mycket lovande för intracellulära inriktnings applikationer, vilket ger en mekanism för att specifikt förändra cellulär signalering och genuttryck. Dessa fordon kan laddas med läkemedel, proteiner och nukleinsyror som är avsedda att påverka cellulära svar och uppnå en önskad effekt i målvävnaderna. Många typer av nanocarriers har utforskats för terapeutisk och diagnostisk fördel inklusive lipider, polymerer, kisel och magnetiska material. Dessa system är attraktiva på grund av deras potential för lokal administrering läkemedel, ökad terapeutisk koncentration i målvävnader, och minskning av systemisk toxicitet.

Fasta lipida nanopartiklar (SLNs) är ett väl studerat exempel på en nanopartikel leveranssystem som har uppstått som en lovande läkemedelsleveransfordon under senare år. SLNs kan lätt formuleras för flera tillämpningar, inklusive bio kännande 1, kosmetika 2 och therapeutic leverans 3-7. Deras användbarhet härrör från det faktum att de är helt består av resorberbara, ogiftiga lipider, vilket resulterar i förbättrad biokompatibilitet. Under syntes kan lipofila läkemedel införlivas i SLN fordon och därigenom öka läkemedlets löslighet och lämplighet för parenteral administration. SLN fordon bidrar också till att stabilisera inkapslade läkemedel, vilket minskar deras nedbrytning och clearance, och maximera terapeutisk verkan. Dessa fordon är särskilt väl lämpade för långtidsverkande, beredningar för kontrollerad frisättning på grund av deras stabilitet vid kroppstemperatur 3,4,8,9. Viktigt, inkapsling av läkemedel i lipid nanopartiklar förändrar de inneboende farmakokinetiska profilerna för läkemedelsmolekyler. Detta tillhandahåller en potentiell fördel genom att tillåta kontrollerad frisättning av läkemedel med ett smalt terapeutiskt index. Frisättningshastigheten för SLN-inkorporerade terapeutika kan avstämmas baserat på hastigheten lipiden nedbrytning eller läkemedlets diffusionshastighet ilipidmatrisen.

SLNs ofta konstruerade för att ackumuleras i vissa målvävnader. Exempelvis deras storlek (typiskt större än 10 nm) potentierar retention i omlopp, där läckande vaskulaturen av tumörvävnad underlättar avlagring. Dessutom har vägen partikel administrering visats påverka biodistributionen med potential att rikta specifika fysiologiska strukturer såsom lymfkörtlar 10,11. Vid avsättning i målvävnader, att uppnå lämpliga cellulära interaktioner och eventuell internalisering av nanopartiklar är en utmaning på grund av förmågan hos cellmembran för att selektivt styra flödet av joner och molekyler in i och ut ur cellen 12. För att underlätta cellulär upptagning, är det möjligt att modifiera nanocarriers med specifika ligander innefattande peptider, små molekyler, och monoklonala antikroppar 13,14. Flera mekanismer, inklusive både passiva penetration och aktiv transport av nanopartiklaröver cellmembranet har tidigare beskrivits 3,12,15. I allmänhet har det visats att cellnanopartiklar interaktioner påverkas av de fysiokemiska egenskaperna hos de nanopartiklar, inklusive storlek, form, ytladdning och ytkemi, förutom cellspecifika parametrar såsom celltypen eller cellcykelfasen 12.

En tidigare undersökning visade syntesen av sub-10 nm SLNs för aktuella 16 och biomarkörer upptäckt applikationer 1 med hjälp av fasinversion temperaturen (PIT) metoden 17. Detta är en mild syntesmetod där två kompositionen förblir konstant under det att temperaturen gradvis ändras. Kontinuerlig omröring av den uppvärmda lösningen, när den svalnar till RT resulterar i en nanoemulsion. Denna process resulterar i syntesen av SLNs med mindre partikelstorlek 1 än vad som tidigare rapporterats med olika metoder för syntes av lipid nanoparticles 17-22. Den resulterande storlekstabellen, mindre än 20 nm, ger en fördel för intracellulära inriktningstillämpningar på grund av ökad yta och potentialen för förbättrade cellulära interaktioner.

Ett schema över SLNs, utformad för att leverera ett fluorescerande färgämne eller terapeutisk, visas i Figur 1. De SLNs består av en lipid inre (t.ex. linjär alkan) som möjliggör införlivandet av lipofila föreningar (t.ex. färgämnen eller terapeutika) och ett ytaktivt exteriör (t.ex. linjär nonjonisk tensid) omgiven av vatten. I denna studie var SLNs laddade med ett fluorescerande färgämne och användas som en modell för att undersöka partikelcellinteraktioner. Primära humana hudfibroblaster och mus dendritiska celler utsattes för färg laddad SLN över tiden för att karakterisera interaktioner med avseende på toxicitet och partikelupptagning. En 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) analysen var Utilized för att fastställa lämpliga doseringsnivåer. Fluorescensmikroskopi och flödescytometri var två metoder som används för att undersöka partikelupptag in vitro.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av SLN visar huvudbeståndsdelarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Behandling av SLNs

  1. Syntes av SLNs
    Obs! Använd PIT metoden 1,17,20 att förbereda under 20 nm SLNs 1.
    1. Använd aseptisk teknik, bioreagens eller cellodlingskvalitet reagens och sterila material (dvs, pipetter, spatlar, flaskor, etc.).
    2. Använd en biosäkerhet skåp för syntesen av SLNs (figur 2).
    3. Kombinera 0,6 mg fluorescerande färgämne (Nilrött (NIR), är NiR koncentration cirka 0,3 mg / ml) och 0,10 g heneikosan (lipid, 5 vikt / vikt-% lipidkoncentration) i en flaska (15 ml), sam-smälta vid 90 ° C och rör om.
    4. Lägg 0,11 g polyoxietylen (10) oleyleter (Ytaktivt, 5,5 vikt / vikt-% koncentration ytaktivt medel). Co-smälta den resulterande blandningen vid 90 ° C och rör om.
    5. Lägg 1,79 g sterilt vatten till blandningen, upphetta till 90 ° C och rör om tills en transparent nanoemulsion bildas.
      Obs: Under fortsatt omrörning och kontrollerad kylning, SLNs skapas. Dessa förhållanden orsakar en inversion av vatten-i-olja-emulsionen till en olja-i-vattenemulsion. Lipofila molekyler såsom NiR partition till lipiddropparna.
    6. Förbered en nanoemulsion parallellt utan tillsats av fluorescerande färg, i syfte att tjäna som ett kontrollprov. Kombinera 0,10 g heneikosan och 0,11 g polyoxietylen- (10) -oleyleter i en flaska (15 ml) sam-smälta vid 90 ° C och rör om.
      1. Lägg 1,79 g sterilt vatten till blandningen, upphetta till 90 ° C och rör om tills en transparent nanoemulsion bildas.
    7. Ytterligare sterilisera varje nanoemulsion med en steril 0,2 pm filter.
    Figur 2
    Figur 2. Schematisk av syntes av SLNs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
  2. Partikelstorlek och Polydispersity
    1. Använd dynamisk ljusspridning (DLS) för att mäta partikelstorlek och polydispersitet av SLNs 1 med hjälp av en glaskuvett och ett instrument för mätning partikelstorlek.
    2. Före mätningarna av proven, mäta partikelstorlekar av två kända standarder att följa tillverkarens protokoll för standarder framställning och mätning.
    3. Fyll glaskuvett med 1,5 ml av en ställd och mäta standardlösningen med användning av samma mätförhållanden som proverna.
      Obs: Föregående steg upprepades för varje standard.
    4. Mät proverna som framställts. För varje, använd följande försöksparametrar: en körtid av 100 sekund, brytningsindex för vatten (1,33), en viskositet av vatten vid 20 ° C (1,002 mPa-s).
      Notera: Denna teknik använder frekvensskiftade ljuset för att mäta storleken av nanopartiklarna.
    5. Rapportera medelpartikeldiametern och polydispersitet av partikel storleksfördelning.
  3. Smältpunkt och latent smält
    1. Använd en differentiell avsökningskalorimeter (DSC) utrustad med en automatisk provtagare och flytande kväve kylkälla för att undersöka den termiska beteendet hos SLNs 1.
    2. Pipett de som förberedda SLNs i en 40 pl aluminiumskål med en massa av ca 25 mg och hermetiskt tillsluta pannan med hjälp av en universell pressverktygs tryck för att minimera fuktförlust under DSC-svepning.
    3. Mät varje nanoemulsion från fem till 80 ° C.
    4. Rapporterar smältpunkten och det latenta smältvärmet från DSC tomt, där dalen representerar smältpunkten och integralen av arean under kurvan i DSC tomt dividerat med mängden material representerar den latenta smältvärmet.

2. SLNs Interaktion med fibroblaster och dendritiska celler

  1. Kultur av primära humana fibroblaster
    1. Kultur primära humana fibroblasts enligt tillverkarens instruktioner i flytande medium för odling av humana dermala fibroblaster (medium 106), kompletterat med den låga tillväxten serumsupplement (LSG) kit. Behåll cellerna i en fuktad atmosfär vid 37 ° C, 5% CO2 och subkultur vid uppnående 80% konfluens.
    2. För både MTT och bildanalys, utsädes celler i en 96-brunnar, vid en densitet av 2 x 10 4 celler per brunn, och låt ekvilibrera vid 37 ° CO / N före SLN exponering.
    3. Vid tiden noll, späd SLNs i fullständigt medium såsom indikeras (Figur 4), med avseende på lipidkoncentration, och tillsätt 10 | il per brunn till varje replikat bra i 96-brunnar.
    4. Bibehåll celler vid 37 ° C, 5% CO2, under inkubationsperioden.
  2. MTT-toxicitet-analys
    1. Efter 24 h av inkubation med SLNs, fastställa cellulär viabilitet med användning av MTT-analysen, enligt tillverkarens protokoll. </ li>
    2. Tvätta cellerna en gång och tillsätt färskt medium till varje brunn (100 | il / brunn). Döda kontrollbrunnar genom inkubation i en 70% metanollösning i 10 minuter innan du byter med färskt medium.
    3. Lägg MTT-reagens (10 pl per brunn) till varje brunn i mikroplattan och inkubera O / N vid 37 ° C.
    4. Efter O / N inkubation, lösa intracellulära formazin kristaller med den medföljande rengöringslösning (100 pl per brunn) enligt tillverkarens protokoll.
    5. Efter 3 h inkubation vid RT, få absorptionsvärden vid en mätvåglängd av 570 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
      Obs: MTT-reagens som används bör vara mindre än 1% (vikt / volym) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid.
  3. Fluorescensmikroskopi
    1. Vid specifika tidpunkter efter doseringen av fibroblaster med SLN, tvätta fibroblastema två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fastställa till 10 min med kall 70% metanol.
    2. Efter 10 minuterByt ut metanol med PBS och ta bilder med ett inverterat mikroskop, med hjälp av en bandpass (BP) 690/50 nm filter set.
  4. Odling av musbenmärg dendritiska celler
    1. Inducerar mus benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC) såsom tidigare beskrivits 23,24. I korthet tallrik enda cellsuspensioner av C57BL / 10 benmärg i 100 mm petriskålar vid 2 x 10 6 / platta med rekombinant murint granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF, 300 U / ml) och rekombinant murint IL-4 (B-cellstimulerande faktor, 200 E / ml). Ändra media var 3 dagar.
    2. På dag 7, till NiR-laddade SLNs till disken vid en slutlig koncentration av 0,5 och 5,0 | ig / ml lipid och bibehålla cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under den önskade längden på exponeringen.
    3. Samla cellerna från skålarna genom att aspirera alla medier i plattan, samla det i en 50 ml rör, följt av noggrann tvättning av plattan (för att lösgöra löst annonsHerent celler) med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 4 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Samla den erhållna cellsuspensionen i samma 50 ml rör.
  5. Bedömning av SLNs Incorporation via flödescytometri
    1. Bestäm koncentrationen av cellsuspensionen som erhölls i punkt 2.4.3 och distribuera 3x10 5 celler i en 12 mm x 75 mm rundbottnad FACS-rör.
    2. Tvätta cellerna genom tillsats av 1 ml PBS och därefter centrifugera rören i 5 minuter vid 400 xg, vid en temperatur av 4 ° C.
    3. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten med 100 pl av PBS / 2 mM EDTA / 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (färgningsbuffert) innehållande anti CD11c-FITC monoklonal antikropp (0,25 ^ g / ml slutlig). Inkubera i 30 minuter på is i mörker.
    4. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och sedan centrifugera rören under 5 min vid 400 xg, vid en temperatur av 4 ° C.
    5. Kassera supernatanten och återsuspendera varjepellets med 400 il färgningsbuffert. Cellerna är nu redo för förvärv av proverna med en flödescytometer (eventuellt utrustad med blå och röda laser).
    6. Använda flödescytometrianalys programvara, bedöma graden av införlivande av SLNs från DC genom grind på populationen av CD11c + celler (FITC positiv) och jämföra intensiteten hos SLNs-associerade fluorescens (mätt i PerCP-Cy5.5 eller APC-kanaler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PIT metod användes för att syntetisera de SLNs och fasinversion Temperaturen bestämdes med användning av ett vattenbad. Proverna var långsamt uppvärmd och försiktigt upprörd tills lösningen verkade klar. Fasinversion temperatur för de SLNs framställda med användning heneikosan lipiden är 45 ° C. Tabell 1 sammanfattar den partikelstorlek, polydispersitet, smältpunkt och latent värme för smältande för SLNs. De SLNs syntetiserade med användning av de processbetingelser som beskrivits ovan resulterade i kontroll SLNs och NiR-laddade SLNs med en medelpartikeldiameter av 18,59 och 16,87 nm och med en polydispersitet av 5,83 och 4,47, respektive (figur 3). Stabiliteten hos SLNs dispersionen övervakades genom mätning av partikelstorleken under 6 dagar vid två olika lagringstemperaturer (4 och 23 ° C). Partikelstorleken förändrades inte över 6 dagar (data ej visade).

Den termiska beteende SLNs var Investigated användning av differentialscanningkalorimetri. De syntetiserade SLNs ha en smältpunkt av 38,0 (± 0,4) och 36,8 (± 0,2) ° C i kontroll SLNs och NiR-laddade SLNs, respektive. Däremot är smältpunkten för bulk lipiden 40,0 ° C, vilket indikerar dämpning av smältpunkten för den SLNs förhållande till bulk lipiden. Som väntat, inneslutningen till små dimensioner och hög ytarea-till-volymförhållande trycka ned nanopartikelsmältpunkten 1. Dessutom är den latenta smältvärmet för styr SLNs och NiR-laddade SLNs 5,1 (± 0,2), och 4,0 (± 0,1) J / g, respektive. Dessa resultat indikerar att graden av kristallinitet hos SLNs påverkas av nyttolasten, där NIR-laddade SLNs visade en lägre kristallinitet i jämförelse med kontroll SLNs.

Figur 3
Figur 3. Fördelning av partikelstorlekar avtypiska nanoemulsioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov Partikelstorlek (nm) Polydispersitet Smältpunkt (° C) Latent smältvärmet (J / g)
SLNs (Control) 18,59 5,83 38,0 ± 0,4 5,1 ± 0,2
NIR-SLNs 16,87 4,47 36,8 ± 0,2 4,0 ± 0,1

Tabell 1. Sammanfattning av de fysikaliska egenskaperna och termiska beteendet hos kontroll SLNs och NiR-laddade SLNs inklusive partikelstorlek, polydispersitet, smältpunkt och latent smältande.

För att undersöka samspelet mellan partiklar och cellmodeller, doserings begränsningar av SLN tillämpas direkt till primära celler i odling, fastställdes första gången. Med användning av en MTT-analys, var dosresponseffekten på cellulär metabolism mätas, där ökande partikelkoncentration resulterade i en minskning i cellulär viabilitet (med avseende på de obehandlade kontrollceller). Det fanns ingen skillnad noteras i toxicitet mellan celler exponerade för SLN ensam kontra NiR belastad SLN vid dessa förutbestämda doser. Parallellt cellerna undersöktes visuellt för anslutning till vävnadskulturpolystyren och bilder togs för att demonstrera både representativ cellulär morfologi och upptaget av fluorescerande partiklar över tiden (Figur 5). Med användning av en dos som är lika med 5 ^ g / ml lipid (ca 80% cellulär viabilitet) partikelupptag observerades 2 h efter exponering.

ys "> Figur 4
Figur 4. Livsduglighet av primära humana dermala fibroblaster efter 24 timmars inkubation med nanopartiklar. Viabilitet mättes med användning av en MTT-analys, och data representerar procent viabla celler i förhållande till obehandlade kontroller. Koncentrationer representerar vikt / volym lipid. Data återspeglar åtminstone tre oberoende experiment, som utförs i triplikat. Felstaplar indikerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Primära humana dermala fibroblaster efter (A) 2 och (B) 24 timmars inkubation med NiR-laddade nanopartiklar. Nanopartiklar koncentration är lika med 5 mikrogram / ​​ml lipid.Bilder är representativa för åtminstone tre oberoende experiment som utförs i två exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Baserat på resultaten av dos begränsande studierna, var sambandet mellan dosen av SLNs och nivån på införlivande i murin BMDC undersökts. Dessa celler är allmänt anses vara det bästa i modellen av flera DC delmängder befintliga in vivo vitro och möjliggöra grundläggande undersökningar forskning nivå av både cellulära och molekylära effekterna av avsedda manipulationer. BMDC lämnades obehandlade eller exponerad O / N till antingen 0,5 eller 5,0 ^ g / ml lipid i NIR-laddade SLNs (på liknande sätt som human fibroblast, användning av 50 | ig / ml lipid gav mindre än 10% livskraftiga celler) och nivån på nanopartiklar inkorporering bestämdes genom att mäta intensiteten av NiR fluorescens i BMDCs via flödescytometri. En direkt correning mellan koncentrationen av SLNs använts och mängden fluorescens bedömdes i BMDCs observerades (Figur 6A). En analys av den kinetiska av NiR belastade SLNs inkorporering avslöjade en mycket snabb upptagning av BMDC. Den SLN fluorescerande signalen var redan tydlig efter 1 timme av exponering, medan plateauing på runt 5 timmar av exponering (figur 6B).

Figur 6
Figur 6. SLN införlivande genom dendritiska celler korrelerar med koncentrationen av exponering. (A) Murin benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC) exponerades O / N till NIR-SLNs, vid koncentrationen av lipid anges, och nivån av inkorporering bedömas via flödescytometri. Histogram över alla gated på CD11c + befolkningen. (B) Kinetic av SLN införlivande genom BMDC. Celler exponerades för NiR-SLNs (5pg / ml) under den angivna tiden och nivån av fluorescens (på gated CD11c + celler) bedömdes med flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie syntes av SLNs och deras användbarhet för intracellulära inriktnings applikationer utforskas. Dessa biokompatibla nanopartiklar har visat lovande resultat som avgivningsvehiklar för flera tillämpningar, inklusive drug delivery, tysta gener, och vaccinteknik 25-30. Ultrasmå SLNs syntetiserades med hjälp av en enkel process, och deras interaktioner med primära hudceller och primära immunceller undersöktes. SLNs var utformade för att inkludera inkapsling av ett fluorescerande färgämne (NIR), som tjänat som modell terapeutisk last.

PIT-metoden användes för att syntetisera SLN och de resulterande partikelegenskaper (partikelstorlek, polydispersitet, smältpunkt och latenta smältvärmet) utvärderades med hjälp av dynamisk ljusspridning och differentiell svepkalorimetri. Partikelstorlek och polydispersitet analys visade syntesen av ultrasmå SLNs med smal polydispersitet, perfekt för intracellulär måling applikationer. Som tidigare rapporterats, kan partikelstorleken spela en viktig roll på cellulära interaktioner 12. Storleken på nanopartiklar har visat sig ha en dramatisk effekt, påverkar upptag effektivitet, internavägen val, intracellulär lokalisering och cytotoxicitet 12. Några av de övergripande trenderna med avseende på cellnanopartiklar interaktioner dokumenterade i litteraturen är: kritisk storlek kan variera med celltyp och ytegenskaper hos nanopartiklar, och små nanopartiklar har högre sannolikhet att internaliseras genom passiv dig ta än stora 12 . Termisk analys av partiklarna i denna studie visade en annan nivå av kristallinitet (dvs latent värme för smältning) mellan kontroll SLNs och de laddade med NiR färgämne. Kristalliniteten hos de SLNs minskade på grund av tillsatsen av det fluorescerande färgämnet, vilket fungerar som en förorening. Kristalliniteten av den terapeutiska avgivningssystem har visats till be en viktig faktor som påverkar leverans och dos 31. En minskning av kristallinitet av SLN fordonet kan påverka parametrar såsom terapeutisk lastkapacitet och drog frigöringskinetik 31. PIT-metoden är en mer skonsam syntesteknik i jämförelse med andra metoder, med den begränsningen att endast lipofila läkemedel kan inkorporeras in i partiklarna. Trots denna begränsning, SLNs syntetiserade med denna metod är mycket biokompatibla, vilket sedan lämplig leveransplattform för många tillämpningar inom biomedicinsk forskning.

Effekterna av SLN interaktion på människors dermal fibroblast lönsamhet analyserades med hjälp av en MTT-analys. En dosberoende sänkning av lönsamheten observerades med ökande koncentrationer av SLN. Under SLN syntes lipidpartiklarna stabiliserade med ett lager tensid. Eftersom partikelstorleken minskar, ökar yta, liksom potentialen för interaktioner på cellytan och cellulär exponering to det ytaktiva skiktet, vilket kan skada cellmembran. Dessa experiment tillät bestämningen av doserings koncentration vid vilken cellulärt upptag av partiklar kunde observeras samtidigt undvika en signifikant minskning av cellviabilitet på grund av membransöndring. MTT-analys är en kvantitativ teknik som kan användas brett för att förstå cellulär hälsa. Parallellt ades celler undersöktes med användning av fluorescensmikroskopi för att visualisera fluorescensen hos last fluorescerande färgämnet, NIR. Med denna teknik, var partikelupptag observerades efter bara två timmar av inkubation med humana fibroblaster. Fluorescensmikroskopi ger kvalitativ information om cellulär morfologi och egenskaper. Man måste vara försiktig för att undvika överdriven bakgrundsfärgning och avbildning av artefakter. Dessutom, som musmodeller är i allmänhet det första valet för ingående cellulära och molekylära undersökningar, analyserade vi samspelet mellan SLNs och murina celler. I synnerhet har en storintresse ligger i användningen av nanopartiklar för selektiv och kontrollerad frisättning av läkemedel som skulle modifiera beteendet hos immunsystemet. Följaktligen flödescytometri användes för att mäta upptag av partiklar med musen dendritiska celler. Dessa data bekräftar att fagocytiska celler som dendritiska celler kan tolerera ett liknande utbud av SLNs koncentration (med reducerad livskraft observerades vid 50 mikrogram / ml lipid som med humana hudfibroblaster) och graden av inkorporering direkt korrelerar med koncentrationen av SLN exponering. Dessutom visade DC en mycket snabb inkorporering av SLNs, vilket tyder på att denna population kan utgöra ett värdefullt mål via SLN-medierad läkemedelstillförsel.

Denna studie inkluderar beskrivning av ett förfarande för syntes av ultrasmå populationer av biokompatibla nanopartiklar, såväl som flera vitro metoder genom att bedöma deras cellulära interaktioner i. I framtida studier, ytterligare analyserkan användas för att ytterligare karakterisera partikelcellinteraktioner och slutligen leda en framgångsrik utveckling av terapeutiska nanocarriers. Dessa skulle kunna omfatta studier av läkemedelsfrisättningskinetik, analys av cellulär tropism, mätning av proinflammatoriska cytokinnivåer, och analys av cellulära transcriptomic förändringar över tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nile Red (NiR) Sigma 19123 BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane Aldrich 286052 98%
Brij O10 Sigma P6136 Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water Sigma W3500 Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding Life Sciences PN4612 Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra  Microtrac serial number U1985IS Instrument
Differential Scanning Calorimeter Mettlet-Toledo Instument
Primary human fibroblasts  Life Technologies C-004-5C Neonatal (HDFn)
Medium 106 Life Technologies M-106-500 A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Life Technologies S-003-K All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-025-K Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader Tecan ---- Instrument
Phosphate buffered saline  Sigma P5493 For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF  Peprotech 315-03 >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4  Peprotech 214-14 >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16, (2252), 1-10 (2014).
  2. Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3, (8), 1407-1421 (2014).
  3. Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
  4. Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5, (2), 8-18 (2013).
  5. Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86, (1), 7-22 (2014).
  6. Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2, (1), 433-441 (2014).
  7. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  8. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30, (11), 592-599 (2009).
  9. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  10. Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
  11. Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
  12. Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
  13. Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
  14. Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
  15. Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
  16. Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
  17. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
  18. Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
  19. Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, 132-137 (2011).
  20. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
  21. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17, (7), 2076-2083 (2001).
  22. Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
  23. Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
  24. Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133, (13), 191-197 (2009).
  25. Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5, (159), 1-22 (2014).
  26. Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1, (16), 1388-1412 (2011).
  27. Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63, (4), 27-445 (2013).
  28. Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
  29. Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
  30. Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
  31. Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. 107-140 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics