공 촛점 분석을 사용하여

Developmental Biology

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Summary

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

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Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

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Abstract

이 프로토콜은 세포의 필드 분산 리간드를 시각화하는 방법을 설명한다. 함께 초기 배아에서의 세포의 큰 크기, 외래 단백질을 발현의 용이성, 제노 푸스는 GFP - 태그 리간드를 시각화하는 유용한 모델을 laevis의합니다. 합성 mRNA를 효과적으로 초기 Xenopus의 배아 내로 주입 한 후 변환되고, 주사는 단일 세포를 타겟으로 할 수있다. 이러한 막 닿는 RFP 같은 혈통 추적과 함께 사용하면 과잉 발현 된 단백질을 생산하고 주입 된 세포 (및 그 자손이) 쉽게 따라 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산을위한 방법의 형광 주입의 mRNA에서의 Wnt 및 쉬 리간드 태그에 대해 설명합니다. 방법은 마일을 포함외배엽 외식 (동물 모자)와 여러 샘플 리간드 확산의 분석 CRO의 해부. 공 초점 영상을 사용하여, 세포의 필드 위에 리간드 분비 및 확산에 관한 정보를 얻을 수있다. 공 초점 이미지의 통계적인 분석은 리간드 구배의 형상 정량적 데이터를 제공한다. 이들 방법은 morphogen 그라디언트의 형상을 조절할 수있는 요소의 효과를 테스트 할 연구에 유용 할 수있다.

Introduction

초기 배아 발달 동안 세포가 점진적 분화의 특정 계통을 따라 약속 :이 전능성 (또는 다 능성) 하나의 세포 유형을 야기하도록 결정된 선조 세포의 개체수를 구축을 점차 제한 될 셀들의 그룹을 의미한다. 세포 - 세포 신호 배아 개발하는 동안 혈통 사양의 규제의 핵심입니다. 이러한 신호의 조작은 새로운 의학적 치료를 지원하기 위해 특정 운명 향해 줄기 세포를 지향 시키도록 요구 될 것이다.

신호 전달 경로의 상대적으로 적은 수의 TGF 상과 (nodals 및 BMPs에) 1-2 FGFs 3 Wnts 45에 대응 고슴도치 경로를 포함하여 개발하는 동안 반복된다. 이들 분비 단백질함으로써 유전자 발현 및 / 또는 세포의 행동을 변경하는 신호 전달을 활성화하는 세포막에 존재하는 수용체에 결합한다. 세포 기호의 꽉 규제Alling은 세포 혈통 사양과 정상적인 발전을 위해 필수적이다. 이들 경로들 사이의 크로스 토크는 세포의 운명을 결정하는 것도 중요하지만, 하나의 리간드는 그 자체가 다른 농도에서 별개의 응답을 이끌어 낼 수있다. Morphogen 구배는 세포 유형 세포 (6)의 필드에서 파생 할 수있는 방법 다른 설명하는 이론으로 100 년 전에 설명했다. 셀들의 하나의 그룹에 의해 생성 된 분자를 시그널링하는 것은 소스로부터 더 먼 거리와 농도의 감소, 특정 범위를 통해 확산 될 수있다. 신호에 노출 된 세포는 별개의 위치에 세포 신호의 상이한 레벨로 상이하게 응답하여, 전지의 분야에서 자신의 위치에 국소 농도에 반응 할 것이다. morphogens의 존재에 대한 증거는 초기 초파리 배아 78 날개 디스크뿐만 아니라 척추 사지 9 신경관 (10)의 연구로부터 온다.

방법은의에 필요설립 방법 morphogen 그라디언트 vestigate 이러한 구배를 조절에서 중요한 다른 분자를 식별 할 수 있습니다. 다른 유전 적 배경의 맥락에서, 생체 내에서 내인성 단백질을 가시화하기 위해 면역 조직 화학을 사용하여 우아한 실험 morphogen 구배 11-12을 조사하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 좋은 항체 및 특정 돌연변이는 항상 사용할 수 없으며, 그래서 우리는 대안 외래 유전자 산물이 세포의 필드에 걸쳐 리간드의 분포에 영향을 미칠 수있는 방법을 절개하는 간단한 방법을 제공하는데, 제노 푸스에서 형광성 리간드의 과발현을 사용하여 여기 프로토콜을 설명한다. Xenopus의 laevis의은 초기 단계에 액세스 할 수 있도록 자신의 태아가 외부 개발로 실험 이러한 유형의를 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 그들은 (아직도 약 20 상대적으로 큰만큼 그들의 큰 크기 (지름 1-1.5mm)는 미세 주입 및 수술 조작을 단순화하고 포배는 단계적으로 세포 이미지에 쉽게81)에 걸쳐 미터. Xenopus의에서 과발현 연구 할 간단하다 : 초기 배아에 주입 mRNA의 특정 세포를 타겟으로 할 수 있고, 효율적으로 변환됩니다.

찬란 태그 Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP는 구조가 PCS2 Wnt8a-HA (13), PCS2 Wnt11b-HA (14)와 eGFP는을 사용하여 생성되었다. HA 펩타이드는 유전자 산물 모두 작동하도록의 Wnt 및 eGFP는 단백질을 분리하는 스페이서의 역할을하는 것으로 생각되기 때문에 추가적인 분자 태그를 제공 할뿐만 아니라,하지만을 포함하는 것이 중요하다. 쉬의 시각화에 사용 구조체 이전 쉬-eGFP는 융합 단백질 (15)을 발현 트랜스 제닉 마우스를 생성하는 데 사용되었다; 이것은 친절 앤디 맥마흔에 의해 제공되었다. 중요하게는, 모든 구조에 대한 GFP 태그가 처리 후에도 유지되도록 신호 서열에 3 '복제된다. 그것은 최종 단백질 변형에 필요한 서열, 예컨대 additio 포함되어 있는지 확인하는 것도 중요같은 지질의 N은 합성의 mRNA의 prodution에 최적화되어 PCS2 + 발현 벡터에 서브 클로닝 하였다 쉬와의 Wnt ligands.The 된 cDNA의 경우입니다; 그것은 SP6 프로모터 및 폴리아 데 닐화 신호 (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors)를 포함한다.

여기에 설명 된 작업은 분비와 형광의 확산을 비교하기위한 간단한 프로토콜의 Wnt 및 쉬가 리간드 태그 태그 제공합니다. 합성의 mRNA의 정의 양을 주입하여, 프로토콜은 서로 다른 프로모터를 사용하여 다른 벡터로부터 변수 표현과 관련된 모든 문제를 주항. 이러한 방법은 최근에 쉬-eGFP는과 Wnt8a / Xenopus의 16 ~ 17에서 Wnt11b-HA-eGFP는 분비 및 확산에 헤파 란 황산 endosulfatase Sulf1의 효과를 조사하기 위해 적용되었다.

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Protocol

윤리 문 : 동물 실험은 MEP하기 위해 영국 홈 오피스 라이선스에 따라 수행하고 수행 된 실험은 도착 도착을 준수 대학 뉴욕의 윤리위원회에 의해 승인되었다 : 가이드 라인 (동물 연구에서 생체 실험의보고). (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

찬란 태그 리간드를 생성하려면 1. 전략

아래 프레임 융합이 Wnta-HA-eGFP는 구성을 생성하기 위해, PCS2로 Wnt8a-HA 및 eGFP는 서브 클로닝을위한 예시적인 프로토콜은 :

  1. Wnt8a-HA 및 eGFP는 최대로 설정하고 실행 PCR 반응. 표 2 주에 표시 표와 예 PCR 반응 및 예 PCR 조건에 표시되는 프라이머 정보를 사용하여 템플릿 DNA는 구조에 따라이 예에서, Wnt8a-HA는 주형 DNA로 사용, 생산되는 다양합니다.
  2. , 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 반응을 정리 3에 최종 용리를 수행분자 수준의 물 0μl.
  3. 태에서 제조 된 1 % 아가 로스 겔에 PCR 제품의 2 μL를 확인합니다.
  4. 적절한 제한 효소를 사용하여 다이제스트 Wnt8a-HA 및 eGFP는 PCR 제품 및 PCS2 표 2 (실시 예 PCR 생성물 다이제스트)에 기재된 바와 같이 반응을 설정 (표 1 참조).
  5. 37 ° C에서 3 시간 동안 반응을 품어 후 얼음에 Wnt8a-HA 및 GFP PCR 제품을 저장합니다.
  6. PCS2 다이제스트에 송아지 알칼리성 장 포스 파타 아제 (CAIP)의 1μL를 추가하고 37 ℃에서 6 분 동안 품어.
  7. 열은 65 ° C에서 15 분 동안 배양으로 불 활성화 CAIP.
  8. 실행 및 PCS2 PCR은 제조 TAE, 1 % 아가로 초순수 겔에서 소화.
  9. 젤 추출물 겔 추출 키트를 사용하여 PCS2 및 PCR 제품을 청소는 분자 수준의 물 ㎕를에 최종 용출을 수행합니다.
  10. 표 2 (예 T4 결찰)에 설명 된 16 시간 동안 12 ℃에서 배양으로 결찰을 설정합니다.

2. mRNA의 합성 : T를 생성emplate

  1. 막 세룰 리안 (memCerulean), 막 RFP (memRFP), 쉬-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP는 다음 플라스미드의 제한 효소 절단 (발현 벡터 PCS2의 모든)를 사용하여 템플릿을 생성합니다.
    1. (예 템플릿 소화) 표 2에 설명 된대로 설정 제한은 소화.
    2. 부드럽게 섞어 37 ℃에서 2 시간 동안 반응을 품어.
  2. 반응이 완료로 절단되었는지 확인하기 위해 1 % 아가 로스 젤 (TAE)에 소화 플라스미드의 2.5 μl를 실행합니다.
  3. 겔 추출 키트를 사용하여 소화를 정리, 분자 수준의 물 50 μL에 최종 용출을 수행합니다.

3. mRNA의 합성 : 체외의 전사에

  1. SP6 mRNA의 전사 키트를 사용하여 기능의 mRNA를 합성. 1.5 ml의 DNase의 / RNAse가 무료의 microcentrifuge 튜브의 반응을 조립합니다.
  2. 표 2 (예 mRNA의 합성)에 설명 된대로 mRNA의 전사 반응을 설정합니다.
  3. 믹스반응은 부드럽게 피펫 후 4 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  4. 2 % 아가 로스 젤 (TAE)에 반응 1 μl를 확인합니다.
  5. 반응에 DNase의 1 μl를 추가 P20 부드럽게 혼합하고 37 ℃에서 추가로 15 분 동안 반응을 품어.
  6. 분자 수준의 물 340 μL, 아세트산 암모늄의 40 μL와 반응 페놀 - 클로로포름 400 μL를 추가한다. 30 초 동안 반응을 소용돌이.
  7. 5 분, 14,000 XG, 4 ° C에 대한 mRNA의 스핀.
  8. 신선한 1.5 ml의로 이동 각 반응에서 상단 (수성) 층을 피펫 캡 microcentrifuge 관 나사.
  9. 경사 각 반응에 클로로포름 동일한 볼륨. 30 초 동안 샘플을 소용돌이.
  10. 5 분, 14,000 XG, 4 ° C에 대한 mRNA의 스핀
  11. 신선한 1.5 ㎖의 스크류 캡 microcentrifuge 관으로 이동 각 반응으로부터 상부 수층 피펫.
  12. 각각의 반응 이소프로판올 동량을 첨가하고 침전 씨NA 30 분 -80 ° C에서.
  13. mRNA의 펠렛, 14,000 XG에서 4 ° C를 15 분 동안 반응의 각 스핀
  14. 펠렛의 mRNA를 방해하지 뜨는 돌보는 제거
  15. 상기 반응을 각각 70 % 에탄올 200 μL를 추가 반응을 혼합 한 후 14,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 스핀.
  16. 상기 mRNA를 방해 진공 건조기 또는 단축 VAC를 사용 실온에서 펠렛을 건조하지 에탄올 돌보는을 제거한다.
  17. 분자 수준의 물을 10 ~ 20 μL에서의 mRNA를 다시 일시 중지합니다. 간단히 스핀과 얼음에 샘플을 유지. 참고 : 1 분 동안 80 ℃로 샘플을 가열하는 것이 용해 도움이 될 수 있습니다.
  18. 2 % 아가 로스 젤 (TAE)에서의 mRNA의 1μL를 실행하고 농도의 정확한 판독을 얻을 수있는 분광 광도계에 1.2 μl를 분석합니다.
    중요한 단계 : 합성 mRNA는 400 NG / μL의 농도는 다음의 실험을 수행 할 필요가있다.

    중요한 단계 : 260/280 비율이면2.00에서 2.20 사이의 범위, 또는 mRNA의 전체 양의 외부는 리튬 클로라이드의 침전을 수행, 12 μg의 초과.
  19. -80 ° C에서 1 μL 씩 보관의 mRNA. 분취 액을 사용하고 버린다; mRNA의 동결을 다시하지 않습니다.

4. 생성 Xenopus의 laevis의 배아

  1. (; Chorulon HCG) 실험 전 주 총리 Xenopus의 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 호르몬의 50 단위를 피하 주사에 의해 여성을 laevis의.
  2. 제노 푸스는 HCG 250 단위를 주입하고 19 ℃에서 어두운, O / N에서 그들을 배양하여 실험 전날 밤에 여성을 laevis의 유도.
  3. 4 ° C에서 1xNAM에 euthanised 남성 개구리와 저장소에서 고환을 해부하다. 참고 : 남성 개구리가 동물의 일정 1 항에 따라 단말기 마취에 의해 euthanised한다 (과학적인 절차) 법 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. 마사지 여성 Xenopus의는 라를 수집, 배란을 유도하는 laevis의55 mm 직경의 원형 페트리 접시에 ID 계란.
  5. 순수한 물 1 mL에 아프리카 발톱 개구리 laevis의 고환의 ¼을 분쇄하여 정자 정지를 생성합니다.
  6. 브러쉬 제노 푸스는 파스퇴르 피펫과 피펫 전구를 사용하여 분쇄 정자 서스펜션 난자 중요한 단계 :. 실험의 날에 약 오후 4시 30 분 수정 반응을 수행합니다.
  7. NAM / 10에서 21 ° C에서 문화 배아는 물 (물)에 희석 1 % 아가 로스로 코팅 된 55mm 배양 접시에 (솔루션을 표 3 참조).
  8. 시스테인 / HCL (표 3)을 사용하여 45 분 후에 탈 젤리 배아. 주 : 21 ° C에서, 배아는 90 분 후 2 세포 단계에 도달하고 그 이후 매 20 분을 절단.

5. 마이크로 인젝션 Xenopus의 배아

  1. 1의 X 90mm 유리 모세관과 Narishige PC-10 듀얼 스테이지 유리 마이크로 피펫 풀러를 사용하여, 주사에 대한 마이크로 피펫을 잡아 당깁니다. 좋은 팁을 달성하기 위해 경험적으로 설정을 조정합니다 (이하 하나 마이크론 diame터).
  2. (예를 들어, 하버드 Appartaus PLI-100 PICO-인젝터)를 반복 시간주기 동안 디지털 설정 압력을 조절함으로써 정확한 양의 액체를 전달하는 가스 마이크로 인젝터에 마이크로 피펫 (바늘)을 부착. 레티클 또는 교정 슬라이드를 사용하여 결정 1.25-10 nanolitres의 볼륨을 제공 할 수있는 공기압을 조정합니다.
  3. 코트 1 % 아가로 오스 (물)의 5 mL를 55mm 페트리 접시. 접시에서 아가로 오스의 35-35mm 사각형을 잘라,이 배아를 microinject하는 안정된 표면을 제공 할 것입니다.
  4. NAM으로 전송 배아 / 3 + 피콜 (표 3)과 주사 접시로 이동합니다.
  5. 그들은 실험에 필요한 단계에 도달하면 동물 반구에서 배아를 주입한다.
    1. , 세포 표면 리간드에 GFP 태그의 분포를 분석 셀당 두 세포 단계, 10nl에서 양방향 측방 배아를 주입. Wnt8a-HA-eGFP는 아래 표시된 예 mRNA의 희석. 중요한 단계 : 모든 mRNA를 일을 농도 있는지 확인400 NG / μL에서 예술.
      주 :의 mRNA 양이 분사되도록하는 농도 테스트와 형광 리간드를 시각화하는데 필요한 최소한의 양을 구함으로써 경험적으로 결정될 필요가있다. 항 HA 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 mRNA는이 두 개의 서로 다른 형광 태그 된 리간드의 비교를 위해 비슷한 수준으로 번역되는지 결정하기 위해 필수적인 단계이다; 우리는 Fellgett 등. 2015 년 Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는이 일을하고있다.
      주 : (후보 레귤레이터와 같은 하나의 부호화) 주입의 mRNA의 효과를 평가할 때, 전형적인 제어는 추가의 임의의 효과를 제어하기 위해 형제 배아 내로, 예컨대 LacZ를 같은 비활성 RNA를 주입하는 것이다 배아의 성적 증명서.
      1. 100 NG / μL로 농도를 줄이기 위해 분자 수준의 물 4 (1μL + 3μl DH 2 O)에 memRFP mRNA의 1을 희석.
      2. 4 (1μL + 3μl DH에 Wnt8a-HA-eGFP는 mRNA의 1을 희석분자 수준의 물로 2 O)을 100 NG / μL로 농도를 감소시킨다.
      3. Wnt8a-HA-eGFP는 mRNA의 1 비율 : 1 memRFP의 mRNA를 섞는다.
      4. 제어 mRNA의 LacZ를하거나 Sulf1 같은 변조기 중 1 비율 : 1 5.5.1.3에서의 mRNA를 섞는다.
      5. 셀 당 mRNA를 10nl (20nl 총)와 2 세포 단계에서 양측 배아를 주입한다. 참고 :이 M 엠의 RFP의 250 페이지, Wnt8a-HA-전자 GFP의 250 페이지, 각 셀에 주입되는 전자 GFP와 LacZ를 또는 Sulf1 mRNA의 2 NG Wnt11b-HA-500 페이지에 발생합니다.
    2. GFP의 확산이 리간드 태그 분석하기 위해, mRNA를, 16-32 세포 단계에서 이러한 memRFP 같은 혈통 마커와 함께 리간드-GFP를위한 셀 당 1.25 NL 코딩 주입.
    3. 리간드의 잠재적 확산 변조의 효과를 분석하기 위해, mRNA를 리간드 리니지 트레이서 함께 변조 코딩 동시 - 주입. 또한, 인접 셀을 주입 : GFP - 태그 ligan 코딩의 mRNA와 하나D 및 혈통 추적 (memRFP)와 변조기와 다른 계보 추적 (memCerulean)를 코딩의 mRNA와 다른.
  6. 다음 날까지 12.5 ° C 배양기와 문화로 전송 배아, Nieuwkoop 및 페이버 (NF) 단계 8.

6. 절제 동물 모자의 Explants

  1. 1 % 아가로 오스 (물)을 5 ml로 코팅 된 55mm 페트리 접시에 전송 배아. NAM / 2 (표 3)와 접시를 채 웁니다.
  2. . 중요한 단계를 텅스텐 바늘을 사용하여 원형 동물 모자를 보자이 더 나은 치료와 이미지에 쉬울 것 같은이 단계에서 대형주를 타고, 더 수렴 확장이 발생하지 보장하기 위해 컨트롤 캡을 유지.
  3. 4 시간 동안 21 ℃에서 55mm 1 % 아가로 오스 (물)와 문화 배아로 코팅 된 배양 접시를 동물 외식 이동 중요한 단계를 :. 4 시간 배양은 형광 단백질 성숙 할 수 있도록해야합니다.
  4. PVC의 insulatio의 두 층을 고집하여 구호 슬라이드를 생성현미경 슬라이드 상에 n 개의 테이프. . 동물 캡을 장착하기위한 챔버를 떠나 테이프 중 10mm 구형으로 중요한 단계를 14mm를 잘라 : 사각형을 절단하기 전에 철저하게 슬라이드에 테이프의 두 층을 평평하게.
  5. 피펫 구호 슬라이드에 NAM 2 별도의 방울 / 2 (표 3), 드롭 당 약 30 μL.
  6. 차단 P20 팁을 사용하여 구호 슬라이드에 동물 외식을 전송하고 치근단 측이 위쪽으로 향하도록 배향. 참고 : 각 슬라이드는 10 ~ 15 동물 모자를 저장할 수있는 중요한 단계를 :. 동물 모자가 부분적으로 치유해야이 단계에서,이 그들이 덜 섬세하고 집게를 사용 지향 할 수 있다는 것을 의미한다.
  7. 조심스럽게 구호 슬라이드에 유리 커버 슬립을 낮추고 커버 슬립이 20 분 동안 건조 할 수 있도록 중요한 단계를 : 동물 캡의 크기는 중요하다;. 캡은 유리 커버 슬립이 구제 슬라이드에 저하되는 경우가 PR 충분히 동물 캡 세포 꼭대기 층을 압축 충분히 크다 확보이미지에 평평한 표면을 oduce. 동물 모자가 너무 작은 경우 여전히 다음 한 층에 PVC 테이프를 줄일 수 있습니다.
  8. 손톱 광택을 사용하여 슬라이드를 밀봉 중요한 단계를 :. PVC 테이프가되면 너무 위로 올리고 슬라이드를 망칠 것 습기 때문에 구호 슬라이드를 밀봉하기 위해 너무 많은 손톱 광택을 사용하지 마십시오.
  9. 20 어둠 속에서 분하고 이미지에 준비가 마른 구호 슬라이드, 일반적으로 동물 모자 번 슬라이드에 밀봉 4-6 시간 동안 건강을 유지합니다.

7. 영상

주 : 이미징 반전 공 초점 현미경을 사용하여 수행 하였다. 이것이 사용되는 서명을 중첩하여 여러 형광체를 허용하고, 검사 시료 간의 전위 운동의 문제를 제거로 람다 촬상 모드가 선택되었다.

  1. 낮은 배율 목표를 사용하여 외식 후 더 높은 해상도의 영상을 위해 63X / 1.4 오일 목표로 전환하실 수 있습니다.
  2. 필요한 레이저에 스위치; 이 예 (405)에 대한memCerulean 레이저를 여기하기 위해 사용하고, 레이저 (488)는 GFP를 자극하는 데 사용하고, 레이저 (561)는 405과 561분의 488 이색 미러를 사용 memRFP를 여기시키기.
  3. (선 2011 년 선택 람다 모드 - 32 쓰레기통)을 사용 람다 모드.
  4. , 넓은 시야를 허용 (0.6 배에) 이미지를 축소 lasers.To이 405nm, 488nm 및 561nm를 선택합니다.
  5. 원하는 영상 크기 (220nm 내지 화소의 크기가 1024 X 1024이 데이터 세트에 대해 사용되었다)에 프레임 크기를 설정한다.
  6. 신호대 잡음비를 높이기 위해 일반적으로도 4 내지도 8을 참조하여 평균을 설정한다.
  7. (이 데이터 세트에 사용 된 561nm 레이저에 의한 통풍 1 부) 핀홀을 최적화.
  8. . CRITICAL STEP을 레이저 파워를 최적화 모든 형광체가 적정한 전압 이득의 양을 최소화하는 반면에 검출기 어레이 (32)를 사용하여 검출 할 수 있도록이 405nm, 488nm 및 561nm의 레이저 대차.
  9. memCerulean, GFP 및 memRFP에서 방출 된 빛의 존재를 수집합니다. 이 작업 빛 ~ 매를 수집415-720nm에서 10nm의 큰 컬렉션 간격도 가능하지만 (예., 매 ~ 20 ㎚).

8. 이미지 분석

  1. GFP 표지 된 리간드의 세포 표면 발현의 조절 효과를 조사
    주 : 다음 단계는 분석 실험실에서 수행 된 방법의 상세한 설명서이다. 최종 사용자는 수동 단계의 일부를 제거하기 위해 ImageJ에 또는 피지 스크립트를 작성하여 프로세스를 간소화 할 수 있습니다.
    CRITICAL STEP : 그것은 최종 사용자 샘플 최종 실험 최종 실험에 사용 된 다수의 형광 스펙트럼의 효율적인 ORM unmixing PERF를 위해 수행되는 것과 동일한 조건에서 사용되는 형광체의 스펙트럼 중요하다.
    분석의 두 가지 주요 유형은이 섹션에서 수행된다 :
    1. 세포막과의 Wnt-HA-eGFP는 픽셀 공동 현지화의 총 수를 계산하는 단계를 포함한다.
      1. 녹색을 UnmixZEN 소프트웨어에서 이러한 형광의 단일 주사에서 샘플링 된 스펙트럼을 사용하여 빨간색과 하늘색 채널. 별도의 LSM 문서는 다음의 모든 단계에서 사용할 수있는 이러한 이미지를 저장합니다.
      2. 열기 LSM은 이미지 편집 소프트웨어에서 파일을 직접. 참고 : 다음 지침은 피지 이미지 J.위한
      3. 이 자동으로 별도의 채널로 이미지를 분할한다, 이미지 시퀀스 문서로 LSM 이미지를 저장합니다.
      4. 데이터를 분석하는 데 사용되는 스크립트를 해석 소프트웨어를위한 스크립트 (실제 기업 스크립트 코드 파일 참조)와 동일한 폴더에 이미지 시퀀스를 저장한다. 참고 : 다음은 matlab에 대한 것입니다.
      5. 스크립트 분석 소프트웨어를 열고 스크립트가 기록되는 디렉토리를 엽니 다.
      6. 위치 분석중인 파일 이름을 입력 소프트웨어는 파일 이름을 가지고 분석을 수행한다.
        주 : 파일 이름은 각 IMA에 대한 ImageA0000과 ImageA0001를 읽GE. 화상을 사용 스크립트 분석 소프트웨어 마스크로 표시된 0001 및 CO-지역화이 마스크 이미지 0000 픽셀의 비율을 분석한다.
      7. (인구 세포막으로 주석) 비율의 공동 현지화 번호를 가지고 스프레드 시트에이 복사합니다. 참고 : 다음 지침은 Excel 용입니다.
      8. 절대 또는 상대 값으로 두 막대 차트에 백분율 공동 현지화 번호를 플롯.
    2. 이 Wnt-HA-eGFP는의 puncta의 수, 크기와 모양을 분석하는.
      1. 오픈 혼합되지 않은 LSM은 이미지 편집 소프트웨어에서 파일을 직접. 참고 : 다음 지침은 피지 이미지 J.위한
      2. 그 별도의 채널 (이미지> 컬러> 분할 채널)에 각각의 이미지를 분할합니다.
      3. 임계 값 모두의 Wnt-HA-eGFP는 멤브레인 마커 채널 (이미지> 자동 임계 값> 조정) 중요한 단계 :. 과도한 노출을하지 않고, 하나의 대표 이미지를 생성하는보고 임계 값의 숫자를보십시오채널.
      4. (마스크 만들기> 프로세스> 이진) 마스크 막 마커 채널을 변환합니다.
      5. 이 마스크 (편집> 반전)을 반전.
      6. 위와 같이 마스크의 Wnt-HA-eGFP는의 puncta의 변환합니다.
      7. (셋톱 박스, 아래 상자에 막 마스크 공정> 이미지 계산기>의 Wnt 마스크) 리간드-GFP 마스크에서 막 마커 마스크를 뺍니다.
      8. 입자 함수를 분석 용도. 여기에서 필요한 매개 변수를 선택하고 데이터 (분석한다>를 분석한다 입자를) 분석 할 수 있습니다.
      9. 스프레드 시트로의 입자의 평균 입경 및 진원도의 데이터의 개수를 복사하고이 데이터로부터 그래프를 플롯. 참고 :이 분석을 위해, 단지 0.1 내지 10 ㎛ 인 2 크기를 분석 하였다 사이에 아무런 제한이 입자의 원형에 배치되지 않았다 입자. 이 명령은 엑셀입니다.
  2. 리간드의 확산 범위를 분석하는
    1. 공 초점 메신저의 모든 혼합되지 않은 이미지를 엽니 다소프트웨어를 노화 다음 원시 데이터로 및 RGB 이미지로, TIF 형식으로 파일을 내보낼 참고 :..이 명령은 선 라이트 2011입니다 중요한 단계 : 그 거리가 될 수 있도록 이미지 중 적어도 하나에 규모 바를 포함 분석에서 계산.
    2. 열 화상을 화상 해석 소프트웨어로 분석한다. 참고 :. 다음은 오른쪽 이미지의 배경을 클릭하고 새 레이어를 만들려면 '배경에서 레이어'를 선택) 포토샵 8.2.3에 대한 것입니다.
    3. . 만 리간드-GFP 채널은 볼 (레이어]> [새 조정 레이어]> 채널 믹서) 중요한 단계가되도록 0으로 막 마커 채널을 설정합니다 분석되는 이미지에 대한 새로운 조정 레이어 클립, 옵션은 새 레이어를 클립에 이 이미지에 채널 믹서 옵션을 클릭 한 후 눈금 상자로 사용할 수 있습니다.
    4. 새 작업 영역을 엽니 다. RGB 색에 인치당 300 픽셀 해상도 및 컬러 모드 (파일 설정>새로운> 클립 보드).
    5. 이미지의 모든 단일 작업 공간으로 분석되고 복사 (이미지를 클릭하고 그 다음 제어 및 Alt 키를 누른 상태에서 작업 영역으로 이미지를 드래그 컨트롤을 잡고 채널 믹서 가위 차기습니다).
    6. 각각의 이미지에 대한 확산의 최대 길이의 Wnt-HA-eGFP는 왼쪽으로 배향 발현 세포, 횡축을 따라 측정 할 수 있도록 모든 이미지를 배향.
    7. TIF로 작업 공간을 저장하고 이미지 분석 소프트웨어에서이 작업을 엽니 다. 참고 : 다음 지침은 피지 이미지 J.위한
    8. 투자 수익 (ROI) 관리자 창 (분석한다> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자)를 엽니 다.
    9. 첫 번째 이미지에 사각형 그리기, 사각형의 정확한 크기 지정 (선택 사각형 도구> 편집> 선택> 지정한 사각형을 그립니다) 할 수 있습니다. 주 : 650 × 100 픽셀 길이 x 폭의 크기는이 연구에 사용 하였다.
    10. WN을 표현 도메인의 매우 가장자리에 사각형을 배치T-HA-eGFP는. 이 Wnt-HA-eGFP는 확산의 최대 거리와 지역을 통해 사각형을 배치합니다. 중요한 단계 : 심지어 막 마커없이이 Wnt-HA-E는 GFP를 표현 영역이 때문에 배경 형광을 볼 수 있어야합니다; 하지 다음하다면 RAW 이미지를 참조하십시오.
    11. 오른쪽에있는 상자 10 μm의 시프트. 이미지 중 하나에 포함되는 스케일 바의 길이를 측정하여 마이크로 미터의 수를 결정 (스케일 바> 분석한다> 설정 스케일 추적 선 그리기). 참고 :이 픽셀에 10 μM의 값을 제공합니다.
    12. 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 추가 버튼을 눌러 투자 수익 (ROI) 관리자의 상자를 추가합니다.
    13. 다음 이미지로 이동 사각형은 사각형을 이동하려면 사각형 도구를 다시 클릭하여 측정한다. 반복 8.2.10-11 단계를 반복합니다.
    14. 일단 모든 패널이 측정되었습니다 투자 수익 (ROI) 관리자 메뉴 (투자 수익 (ROI) 관리자> 더보기> Multiplot> 목록)에서 선택 multiplot.
      주 : 데이터의 Wnt 픽셀 INTE을 나타냅니다(픽셀 단위 X) 가로축 멀어짐 nsity (Y). Y의 값은 X 점에서의 리간드 - GFP의 평균 신호 세기이며, 평균은 각 X 값에 대해 Y ​​축에서 모든 픽셀로부터 계산된다. 따라서 상자 키, 더 많은 픽셀이 평균을 생산하기 위해 분석됩니다. (Y 축)에 작은 상자는 아수라장이 될 것이다; 키가 큰 상자가 매우 낮은 평균 픽셀 강도를해야합니다.
    15. 스프레드 시트 따라 재 라벨에 multiplot 상자에서 데이터를 복사합니다. 참고 : 다음 지침은 Excel 용입니다.
    16. 이러한 리간드 - 발현 세포에서 GFP 형광 배경을 나타내는 그래프와 왜곡 각 분석에서 데이터의 제 10-20μm 폐기.
    17. 과학적인 분석 및 그래프 소프트웨어를 열고 새 노트북을 만들 수 있습니다. 참고 : 다음은 Sigmaplot (13)에 대한 것입니다.
    18. O 수평 번호를 두 번 클릭하여 데이터에 대한 열 필요한 수의 레이블n은 워크 시트 μm의에서 그들에게 거리를 라벨, Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는.
    19. 과학적인 분석 및 그래프 소프트웨어 관련 컬럼에 스프레드 시트에서 데이터를 복사합니다.
    20. 분산 형 그래프를 작성 (그래프 만들기> 살포> 다중 분산> 선택 X 많은 Y> Y 값에 대한 X>를 선택 Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는> 마침의 거리 열을 선택).
    21. 분산 그래프에 Wnt8a-HA-eGFP는 점에서 왼쪽 버튼으로 클릭하여 Wnt8a-HA-eGFP는 곡선 회귀 분석을 수행합니다. 모든 포인트는 강조한다. 분석> 회귀 마법사를 클릭합니다.
    22. 곡선 방정식 카테고리 (지수 형 감쇠)과 식 이름 (싱글, 3 매개 변수) 다음을 눌러 선택합니다.
    23. 곡선이 다음 키를 누릅니다 (데이터가 이전에 강조 표시 한 경우,이 자동으로 수행되어야한다)가 장착되어야하는 X와 Y 값을 선택합니다.
    24. 숫자 출력 옵션까지 마법사를 계속의 페이지, 다음 쳤다 다음을 누릅니다된다 '보고서 작성'을 확인합니다. 주 : 장착 곡선의 매개 변수는 보고서 1에 표시됩니다. *
    25. 그래프 옵션 페이지에서 다음 쳤다 마무리를 누르면된다 '타이틀을 그래프로 식을 추가'를 확인합니다. 참고 : 마법사는 보고서 1 *와 그래프 1 * 참고 책의 상단에있는 탭을 만든 것입니다. 또한 곡선 (8.2.20)에서 생성 그래프에 추가 된 것이다.
    26. 반복 Wnt11b-HA-eGFP는 대한 곡선에 맞게 8.2.21-8.2.25 단계 중요한 단계는 :. 데이터에 맞는 여러 방정식 범주와 식 이름을보십시오. 참고 : 최적으로 곡선은 사각형의 가장 낮은 잔류 액으로 가장 높은 R 2 값을 생성한다.

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Representative Results

형광 태그로 단백질을 발현하는 동물 캡 이식편의 촛점 분석은 다양한 실험 조건 하에서 리간드 분포를 시각화하기위한 효과적인 시스템을 제공한다. 일 예에서, GFP의 분포는 쉬 (도 1)를 나타낸다 태그. 2- 세포 단계에서 Xenopus의 배아 제어의 mRNA 또는 mRNA를 Sulf1, 세포 표면 헤파 란 황산 수정 및 쉬 morphogen 구배 16 영향을 미치는 효소의 코딩 중 하나와 모두 세포 내로 주입된다. 이 배아는 32 세포 단계까지 배양 및 단일 세포 공동 주입의 mRNA가 (혈통 추적 등) 쉬-GFP 및 memRFP에 대한 코딩입니다. 이것은 세포막 닿는 RFP로 표시됩니다 쉬-GFP를 발현하는 세포의 복제를 만듭니다. 포배 단계에서, 동물 모자 외식은 공 초점 현미경으로 분석을 수행한다. 그림 1 제어 조건 하에서, 쉬-GFP가 분비되는 것을 보여주고 다시 외부 확산기온이 주입 된 mRNA를 발현. 그러나 Sulf1의 존재하에 쉬-GFP는이 샘플을 생산 세포 클론의 외측에 검출되지 않고, 그 분포의 더 제한하고. 쉬-GFP 분포 Sulf1의 효과는 16보다 완전하게 분석되었다.

제노 푸스 배아로 표현하면, 형광 세포막에 축적하고, 셀의 필드에 걸쳐 확산되어,이 Wnt 리간드가 분비 태그. 그림 2에서, 우리는 fluorecently 주입 된 세포에서의 Wnt 리간드 태그 및 단백질을 발현하는 서로 다른 두 가지의 quantitaive 질적 특성을 특징. 그림 2A-H는 Wnt8a과 Wnt11b-HA-eGFP는 동물 캡 세포의 막에 축적하는 방법의 예를 보여줍니다 . 패널 (2B)과 2 층을 비교함으로써이 Wnt8a-HA-eGFP는이 Wnt11b-HA-eGFP는보다 세포막에보다 효율적으로 축적 것이 분명하다. 정량적 인 정보는 COM을 이용하여 공 초점 화상으로부터 추출 된이미지와 스크립트 분석 소프트웨어 (보충 코드 파일)의 컴비네이션은. 그림 2I는 Wnt11b-HA-eGFP는 비교 세포막에 Wnt8a-HA-eGFP는 상대적 축적을 보여줍니다. 데이터는 각 이미지에서 세포막 픽셀의 Wnt-HA-eGFP는 픽셀 공동 현지화의 총 수를 결정하는 컴퓨터 스크립트를 사용하여 수득 하였다. 다른 접근법에서, 세포막과 공동 - 지역화의 Wnt-HA-eGFP는의 puncta의 총 수는 이미지 분석 소프트웨어 (도 2J)를 사용하여 계산된다. 크기 및 모양의 개별 puncta에 대한 정성적인 정보는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 추출 할 수있다. Wnt11b-HA-eGFP는이 puncta에의 세포막 (그림 2J)이 puncta의와 공동으로 현지화 적은 외에도 Wnt8a-HA-eGFP는의 puncta의 (그림 2K)보다 작은 평균 크기를 가지고있다. 또한, Wnt11b-HA-eGFP는의 puncta의는 Wnt8a-HA-eGFP는의 puncta의 (그림 2L)에 비해 감소 원형이있다. CIRCularity 개체에서 1 진원 0.1 긴 비 원형 형상을 나타내는 함께, 진원 얼마나 유사한의 척도이다. 이 방법은 리간드의 Wnt 확산 중 어느 후보 레귤레이터를 테스트하는데 사용될 수있다. 이를 위해, 제어 된 세포의 mRNA가 제어 후보 레귤레이터의 비활성 형태 또는 베타 - 갈 락토시다 제 (lacZ의)로서 부적합 단백질을 코딩 주입한다; 이것은 단순히 레귤레이터를 주입하지보다 더 유효한 제어를 제공한다. 이들 예에서 데이터는 비 - 파라 메트릭 시험 맨 - 휘트니 U 18-19를 사용하여 분석 하였다. 통계 분석 프로그램이 테스트를 수행하는 데 사용되었다.

도 3에서는이 Wnt 리간드 확산을 조사. 하나의 할구는 동물 캡 이식편는 일부 세포 Wnt8a-HA-eGFP는 또는 Wnt11b-HA-eGFP는 어느 하나를 발현하는 세포의 필드를 표현되도록 ​​4- 세포 단계에서 주입 하였다. 셀 혈통 추적을 포함함으로써, 우리는 expre를 식별 할 수 있습니다비 발현하는 세포에 비해 ssing이 (그림 3B 및 3C) 분석 할 Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는 리간드 확산의 범위 멀리 소스 세포 수 있습니다. 인해 동물 캡 이식편의 곡률에 안정적이 분석법을 이용하여 측정 될 수있는 최대 거리가 리간드 확산의 절대 거리를 측정하기에 충분하지 않았다 160μm이었다. 그러나, 소프트웨어를 해석 공 촛점 이미지 분석 및 과학적 분석의 조합을 사용하여 그래프의 Wnt-HA-eGFP는 morphogen의 그라데이션의 전체적인 형상은 (도 3d)를 분석 할 수있다. 이 데이터는 동일한 셀 내의 태그 된 리간드와 함께 다른 단백질을 과발현하는이 Wnt 분비 또는 확산에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하기 위해 사용될 수있다. 실험의 또 다른 형태 (도 3E-3J)는 세포를받는 전위 조정기의 효과는 세포 EX 인접 세포 클론 후보 단백질을 과발현에 의해 측정 될 수있다Wnt8a 또는 Wnt11b-HA-eGFP는 키를 눌러. 이것은의 Wnt-HA-eGFP는 리간드 확산에 레귤레이터의 비 세포 자치 효과를 검사 할 수 있습니다. 그림 2과 일치, 더 Wnt8a-HA-eGFP는 모두 확산 실험에서 Wnt11b-HA-eGFP는보다 세포에서 멀리 확산을 검출 할 수있다.

이 논문에서 설명 된 실험의 유형의 Wnt가 쉬 및 16,17 시그널링에 Sulf1의 효과를 분석하기 위해 사용되어왔다.

그림 1
쉬-GFP 분포의도 1 변조 Xenopus의 동물 캡 촛점 분석에 의해 검출 될 수있다. (A) 배아 제 mRNA를 Sulf1 또는 제어 mRNA를 코딩으로 주입 실험 분석을 묘사 만화 같은 배아 후에 mRNA를 단일 세포로 쉬-GFP를 코딩하는 유전자와 32 세포 단계에서 주입된다. (BC) 동물 모자 이식편S는 단계 8에서 찍은 4 시간 후 몇 군데 있었다. 이미지는 세포의 쉬-GFP + memRFP 표현 클론의 가장자리에 표시됩니다. 제어 배아 (B)에서, 쉬-GFP는 거리 신호 생성 세포의 memRFP 표시 클론 배포됩니다. Sulf1 (C)를 ​​표현하는 배아에서 쉬-GFP가 더 유통에 제한되어있는 경우, (16)을 참조하십시오. memRFP는 마젠타에 도시 녹색 쉬-GFP된다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 양적 및 세포막에 Wnt8a 및 Wnt11b-HA-eGFP는 puncta에의 정성 분석. (AH) 배아의 mRNA는 두 세포 단계에서 동물 반구에 memRFP (500 페이지)을 인코딩 양방향 측면 미세 주입했다. 또한 배아 씨 주사 하였다 NA 인코딩 (AD) Wnt8a-HA-eGFP는 (500 페이지) 또는 [EH] Wnt11b-HA-eGFP는은 (1ng). 잠재적 레귤레이터의 효과를 분석 할 때의 mRNA LacZ를 추가 / 단백질에 대한 제어를 제공하기 위해 배아는 mRNA의 코딩 주사 하였다. (C)(G)에서 흰색 박스는 각각 패널 (D)에서 확대 영역 및 (H)를 표시한다. 이 Wnt-HA-eGFP는 형광 세포막과 공동 현지화 총량 화상 및 스크립트 분석 소프트웨어 및 정규화 (I)을 사용하여 계산 하였다. 정 성적 정보는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추출 하였다. Wnt8a 및 Wnt11b-HA-eGFP는 punctae은 입자 수 (J), 입자 크기 (K) 및 입자의 원형 (L)을 분석 하였다. 맨 - 휘트니 U (** P <0.01), N = 배아의 수. memRFP는 마젠타에 표시되며, Wnt8a / 11B-HA-GFP가 녹색으로 표시되고, 스케일 바는 20 ㎛ 나타냅니다.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
형광의 확산 범위를 측정 그림 3.의 Wnt 리간드 태그. (A)도 얻어 발현 세포에서 Wnt8a 및 Wnt11b-HA-eGFP는 분비과 확산을 측정하는 데 사용하는 분석을 묘사. (BC) mRNA의 인코딩 (B) memCerulean (600 페이지), LacZ를이 (4ng)과 Wnt8a-HA-eGFP는 (2ng) 또는 (C) memCerulean (600 페이지), LacZ를 (4ng)과 Wnt11b-HA-eGFP는 (2 NG 분석을 묘사) 네 개의 세포 단계에서 하나의 할구의 동물 반구에 주입 하였다. (D) Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는 확산의 범위 제어 배경을 통해 측정 하였다. (E)도 사용 LacZ를 표현 배경을 통해 Wnt8a과 Wnt11b-HA-eGFP는 확산을 측정하기 위해, DET에 대한 방법을 참조 괴롭히는는 (FG)의 mRNA는 Wnt11b-HA-eGFP는이 네 가지에서 하나의 할구의 동물 반구에 주입 memCerulean (600 페이지) 및 (F와 H) Wnt8a-HA-eGFP는 (2 NG) 또는 (G와 I)을 인코딩. 세포 단계. 인접 할구는 배경 표현 LacZ를 통해 측정 하였다 memRFP (600 페이지)와 LacZ를 (4 NG) 자세한 내용은 키를 참조하십시오. (J) Wnt8a-HA-eGFP는과 Wnt11b-HA-eGFP는 확산의 범위를 암호화하는 mRNA를 주입했다. 데이터는 정량 분석​​ 및 공 촛점 이미지 분석 및 과학적 분석 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯 팅 하였다. memCerulean (파란색 (CD)과 노란색 (F와 H는))의 Wnt-HA-eGFP는 (녹색), memRFP (마젠타), 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 파일의 더 큰 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

파일 / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>

표 1. 프라이머는 PCS2에 Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP는과 쉬-GFP를 서브 클로닝하는 데 사용됩니다.

반응 구성 요소들
예 CS2 + 다이제스트 1.5 PCS2의 μg의 +
제한 효소 (1)의 2 μL
제한 효소 2/2 μL
제한 효소 완충액 5 μL (10X)
분자 수준의 물을 50 μL로 구성
예 mRNA의 합성 2 μL 선형화 템플릿
2 μL 10 배 Megascript의 TRX 믹스
2 μL의 50 mM ATP
2 μL 50mm의의 CTP
2 μL 50mm의의 UTP
2 μL 5mM의 GTP
2.5 μL 40MM 캡 아날로그 (m7G (5 ')
2 μL SP6 효소 믹스
3.5 μL 분자 수준의 물
예 PCR 반응 0.5 μL 높은 충실도 DNA 중합 효소 (000 유니트 / ml) 중
2 NG 템플릿 DNA
2.5 앞으로의 μL 및 역방향 프라이머 (10μM)
0.5의 dNTPs의 μL
DNA의 ploymerase 완충액 5 μL (10X)
분자 수준의 물을 50 μL로 구성
예 PCR 조건 98 ° C에서 Intial 변성 2 분
15 초 98 ° C
15 초 65 ° C 30 회
40 초 72 ° C
72 ° C에서 최종 연장 10 분
예 PCR 제품 다이제스트 PCR 생성물의 28 μL
제한 전자의 2 μLnzyme 1
제한 효소 2/2 μL
제한 효소 완충액 5 μL (10X)
13 μL 분자 수준의 물
예 T4 결찰 1 μL 컷 CS2 +
3 μL 절단 PCR 생성물 1
3 μL 컷 PCR 산물 2
T4 DNA 리가 제 1 μL
1 ㎕의 T4 DNA 리가 아제 완충액 (10X)
1 μL 분자 수준의 물
예 템플릿은 소화 5 UG 플라스미드 DNA
10 ㎕를 제한 효소 완충액 (10X)
3 μL Not1 (쉬-GFP를 제외하고, Kpn1 사용)
분자 수준의 물 100 μL까지 제작

서브 클로닝 및 Wnt8a-HA-eGFP는 대한 합성 mRNA의 생산에 사용되는 표 2. 예 반응 조건.

<TD>
해결책 구성 요소들
시스테인 HCL 0.1X NAM
2.5 %의 L 시스테인 염산염 일 수화물 (pH7.8)
NAM 염 110 mM의 NaCl를
2 밀리미터의 KCl
1mM의 CA (NO3) 2
0.1 mM의 EDTA
NAM / 2 0.5X NAM 염
5 mM의 HEPES pH 7.4로
0.25 mM의 중탄산염
25 UG / ㎖ 겐타 마이신
NAM / 3 + 피콜 0.33X NAM 염
5 mM의 HEPES pH 7.4로
0.25 mM의 중탄산염
2 5 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신
5 % 피콜
NAM / 10 0.1X NAM 염
5 mM의 HEPES pH 7.4로
25 UG / ㎖ 겐타 마이신

표 3. 솔루션 제노의 생산 및 마이크로 인젝션 동안에 사용고름은 배아를 laevis의.

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Discussion

이 프로토콜의 핵심적인 부분은 일반적으로, 처리 된 분비, 및 장착 된 형광 부분이 있음에도 불구하고, 수용 세포의 반응을 유도 할 수있는 생물학적 활성 리간드를 생성한다. 이 형광 표지 된 유전자 산물은 적절한 분석법을 이용하여 생물학적으로 활성화되어 있음을 확립하는 것이 중요합니다. 쉬-GFP를 들어 PTC1의 발현을 활성화 할 수있는 능력을 확인 하였다 (16). Wnt8a는 하나의 복부 할구 20 ~ 21로 표현하고, Wnt8a-HA-eGFP는이 생물학적 활성을 유지 보였다 때 보조 축을 유도하는 현저하게 강력한 기능을 가지고 있습니다. Wnt11b은 수렴 확장 21-22를 겪고에서 티빈 처리 외배엽 외식을 억제하고, Wnt11b-HA-eGFP는 또한 그것의 생물학적 활성 (17)을 유지합니다. 태그가 지정되지 않은 단백질에 상응하는 반응을 유도 할 수있는 태그 리간드의 능​​력은 결론입니다 b 형광 리간드를 사용하여 실험을 기반으로 제안정상적인 단백질 관련 전자. 리간드와 형광 단백질 사이 HA 에피토프의 첨가는 활성이 Wnt 형광 둘 수 있도록 구성한다 스페이서 영역을 제공 하였다.

이러한 유형의 분석의 주요 한계는 직접 내인성 morphogen 구배에 통지하지 않는다는 것이다. 예를 들어, 동물 모자 세포의 들판을 가로 질러 쉬의 확산이 방법을 배아에서 원주 신경 상피를 통해 내생 쉬 움직임을 반영하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜의 단순성은 리간드의 분포에 외인성 규제의 효과를 테스트 할 수 있도록 실험. 이러한 방법의 결과는 가설에 기초하여 생체 내 분석에 더 요구하여 시험 할 형성 할 수있다. 예를 들어,이 문서에서 기술 된 방법을 사용하여 쉬-GFP의 유통을 제한하는 과발현 Sulf1의 능력 쉬 morphogen 래드를 변조 Sulf1에 대한 전위가 가리키는ient. 이것은 직접 테스트 모르 폴리 노 Sulf1의 노크 다운 및 신경관 16 내생 쉬 시각화하는 면역 세포 안티센스를 이용하여 검증 하였다. 우리에게 유사한 방법 리간드 확산을 규제 할 수 특정 메카니즘을 조사하기 위해 사용되어왔다. 스미스와 동료들은 GFP - 태그 노드 (Xnr2가) 단순 확산을 사용하고, 경사 (23)를 형성하는 확장 (cytonemes) 또는 트랜스 사이토 (소포 사용) 셀하지 않는 것이 보여 주었다.

특정 경로를 차단하는 다른 단백질이 신호 전달 분자에 대한 응답은 다른 하나의 셀로부터 신호를 중계하는 중개 필요한지 여부를 조사하기 위해 표적 세포에서 발현 할 수있는이 방법의 추가의 정교함이 가능하다. 예를 들어, 티빈의 소스 및 응답 세포 간의 우성 네거티브 티빈 수용체를 발현하는 것은 간단한 리간드 확산 소스 (E)로부터 떨어져 여러 응답 기포 직경을 유도 할 수 있음을 보여 주었다(24) 사이에 응답하지 않는 세포 VEN. 야생형 세포는 절점 (25)을위한 필수적인 공동 수용체 결여 무응답 돌연변이 세포에 의해 둘러싸여 불구하고, 노드의 소스에 대응할 수있는 이러한 결론은 제브라 피쉬의 작업에 의해 지원되었다. 다른 연구는 형광 태그 리간드 (28, 29)의 확산을 조사하기 위해 제브라 피쉬를 사용했다. 일부 연구가 가능하기 때문에 단백질의 형태에 기여하는 고도로 보존 된 시스테인의, 신호 활동에 영향을 미칠 수의 Wnt 단백질의 C- 말단에 태그를 에피토프 것을 관찰했다. 우리의 이전 작업 (예 : HA 태그 등) 스페이서를 포함하는 17 생물학적 활성 태그의 Wnt 리간드 결과 것으로 나타났습니다. 스페이서의 Wnt-FRZ 30 바인딩의 엄지 손가락 집게 손가락 모델로 리간드 - 수용체 상호 작용에 필요한 유연성 등을 제공하기 때문에이 가능성이 높습니다.

우리의 연구를위한 발전 다음 단계는 힘을 포함한다신호 전달 경로의 활성화를위한 연간 판독. 예를 들어, GFP-태그 Wnt11b 신호하는 능력을 보유하고있는 범위에 걸쳐 허용 리간드의 광원으로부터 먼 DVL 26 세포에서 측정 할 표현. Wnt8a 시그널링 활성의 범위는 소스로부터의 거리에서 셀 (27) B-카테닌의 핵 이행을 측정하는 항체 염색을 이용하여 도시 될 수있다. 이런 종류의 실험이 논문에서 기재된 기술을 이용하여 가능하다. 하나 morphogen의 임계 범위를 결정하는 리간드의 분배하지만 신호 전달 경로의 또한 출력을 측정하고, 이러한 방법뿐만 아니라 다른 경우 형광 단백질 또는 형광체의 종류를 채용함으로써, 정보의 부가적인 레벨을 제공 할 것이다 .

아프리카 발톱 개구리 laevis의는 조달 배아, mRNA의 합성, 미세 주입 및 해부위한 방법에 GFP - 태그 리간드 및 추가 정보를 시각화하는 유용한 모델이다이온은 31 사용할 수 있습니다.

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Acknowledgments

BBSRC에 의해 투자 된이 작품은 (BB / H010297 / 1), SAR에 BBSRC 할당량 재학 및 SWF에 MRC 학생이기을 MEP에 부여합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

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References

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