Konfokal Analizi Kullanımı

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu protokol, hücrelerin bir alanı boyunca dağıtılmış ligandlar görselleştirmek için bir yöntemi anlatmaktadır. Birlikte erken embriyolar kendi hücrelerinin büyük boyutu ile, eksojen proteinleri ifade kolaylığı, Xenopus GFP etiketli ligandların görüntülenmesi için yararlı bir model laevis olun. Sentetik mRNA verimli erken evre Xenopus embriyoların içine enjeksiyondan sonra çevrilir ve enjeksiyonlar tek bir hücre hedeflenebilir. Membran gergin RFP olarak soy izleyici ile kombine edildiğinde, Süreksprese protein üreten enjekte hücre (ve onun soyundan) kolayca takip edilebilir. Bu protokol, üretimi için bir yöntem olup, floresan enjekte mRNA'dan Wnt ve Shh ligandlan etiketli açıklanmaktadır. Yöntemler mil dahilektodermal eksplantlar (hayvan kapaklar) ve çoklu örneklerinde ligand difüzyon analizi cro diseksiyonu. Confocal görüntüleme kullanarak, hücrelerin bir alanı üzerinde bir ligand salgılanması ve difüzyon ile ilgili bilgiler elde edilebilir. Konfokal görüntüleri İstatistiksel analizler ligand geçişlerini şekline nicel veri sağlamaktadır. Bu yöntemler morfojen geçişlerini şeklini düzenleyen faktörlerin etkilerini test etmek istediğiniz araştırmacılar için yararlı olabilir.

Introduction

Erken dönemde embriyo gelişimi sırasında, hücreler giderek farklılaşma spesifik soy takip kararlı Bu totipotent (veya pluripotent) bir hücre tipine neden kararlı projenitör hücrelerin popülasyonları kuran giderek kısıtlı hale hücre grubu anlamına gelir. Hücre-hücre sinyal embriyonik gelişim sırasında soy şartnamenin düzenlenmesi merkezidir. Bu sinyallerin idaresi ise, yeni tıbbi tedaviler destek, özellikle kaderi doğru kök hücreleri yönlendirmek için gerekli olacaktır.

Sinyal yollarının nispeten az sayıda TGF süper ailesinin (nodals ve BMPler) 1-2, FGF'ler 3, Wnts 4 ve kirpi 5 yanıt yolakları dahil olmak üzere gelişme sırasında tekrarlanır. Bu proteinler böylece gen salgılanan ekspresyonunu ve / veya hücre davranışını değiştirerek sinyal iletimini etkinleştirmek için hücre zarı üzerinde mevcut olan reseptörlerine bağlanır. Hücre işareti sıkı düzenlemeAlling hücre soyu özellikleri ve normal gelişim için gereklidir. Bu yollar arasında cross-talk hücre kaderini belirlemede önemli olmakla birlikte, tek bir ligand kendisi farklı konsantrasyonlarda farklı tepkiler olabilir. Morfojen degrade hücre tipleri hücrelerin 6 bir alandan elde edebilirsiniz ne kadar farklı açıklamak için bir teori olarak 100 yıl önce tarif edildi. Hücrelerin bir grup tarafından üretilen moleküller Sinyal kaynağı daha büyük bir mesafe ile konsantrasyonunu azaltarak, belirli bir aralık içinde yayılabilir. Sinyaline maruz hücreler farklı pozisyonlarda yer alan hücreler sinyalin farklı seviyelerde farklı yanıt olan, hücre alanındaki pozisyonda lokal konsantrasyona yanıt verecektir. Morphogens varlığı için kanıt, erken Drosophila embriyo 7 ve kanat disk 8, hem de omurgalı bacak 9 ve nöral borunun 10 üzerinde yapılan çalışmalardan elde.

Yöntemler için gerekli olanKurulan nasıl morfojen gradyanlar incelenmelidir ve bu geçişlerini düzenlenmesinde önemli diğer molekülleri tespit etmek. Farklı genetik arka bağlamında in vivo endogen proteinleri görselleştirmek için immünohistokimya kullanılarak zarif deneyler morfojen gradyanlar 11-12 araştırmak için kullanılmıştır. Ancak, iyi antikorlar ve spesifik mutantlar her zaman geçerli değildir, bu yüzden alternatif, ekzojen gen ürünleri hücre alanın karşısındaki ligandların dağılımını nasıl etkilediği incelemek için basit bir yöntem sağlamak, Xenopus floresan ligandların aşın kullanarak burada bir protokol açıklar. Xenopus laevis onlar erken evrelerinde erişilebilir, böylece onların embriyoların dışarıdan geliştirmek gibi deneyler bu tür üstlenmek için mükemmel bir sistem sağlar. Onlar (yine yaklaşık 20 nispeten büyük olduğundan onların büyük boy (çapı 1-1.5mm) mikroenjeksiyon ve cerrahi manipülasyon kolaylaştırır ve blastula aşamaları ile hücrelerin görüntüye kolay81;) karşısında değilim. Xenopus overekspresyonu çalışmaları yapmak basit: Erken embriyo enjekte mRNA belirli hücrelere hedeflenebilir ve verimli çevrilmiştir.

Floresan etiketli Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP konstruktları PCS2 Wnt8a-HA 13, PCS2 Wnt11b-HA 14 ve eGFP kullanılarak üretilmiştir. HA peptid gen ürünleri hem de çalışması için izin Wnt ve eGFP proteinleri ayıran bir ara parçası olarak işlev gördüğü tahmin edilmektedir, çünkü ek bir moleküler etiket sağlar, ancak aynı zamanda sadece dahil etmek çok önemlidir. Shh'nin görüntülenmesi için kullanılan konstrukt, daha önce bir Shh-EGFP füzyon proteinini 15 eksprese eden transgenik bir fare üretmek için kullanılmıştır; Bu nazik Andy McMahon tarafından sağlandı. Önemli bir şekilde, bütün konstruktlar için olan GFP etiketi işleme sonra da baki kalmaktadır şekilde sinyal sekansına 3 'klonlanır. Nihai protein tadil etme için gereken dizileri, bu additio içerir sağlamak da önemlidirgibi lipitler n sentetik mRNA prodution için optimize edilmiş pCS2 sentezleme vektörüne alt-klonlanmıştır Shh ve Wnt ligands.The cDNA'lar için geçerlidir; bir SP6 başlatıcısını içeren ve poliadenilasyon sinyali (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors) içerir.

Burada anlatılan çalışma salgılanmasını ve floresan difüzyon karşılaştırmak için basit bir protokol Wnt ve Shh ligandlar tagged sağlar. Sentetik mRNA belirlenen miktarda enjekte edilerek, protokol farklı promotörler kullanarak farklı vektörler değişken ekspresyonu ile bağlantılı herhangi bir sorun çevrelemiyor. Bu yöntemler son zamanlarda Şşş-eGFP ve Wnt8a / Ksenopus 16-17 in Wnt11b-HA-eGFP salgılanması ve difüzyon heparan sülfat endosulfatase Sulf1 etkilerini araştırmak amacıyla uygulanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: Hayvan deneyleri MEP İngiltere Ev ofis lisansı altında yapıldı ve yürütülen deneyler GELİYORUM uygun olarak University of York etik komitesi tarafından onaylandı: kurallar (Hayvan Research In Vivo Deneyler ve Raporlama). (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

Floresan Tagged Ligandları oluşturmak için 1. Strateji

Aşağıda çerçeve füzyonu Wnta-HA-eGFP oluşturmak üretilmesi amacıyla, PCS2 içine Wnt8a-HA ve eGFP alt klonlama için bir örnek protokolüdür:

  1. Wnt8a-HA ve eGFP için kurmak ve çalıştırmak PCR reaksiyonları. Tablo 2. Not görüntülenen Tablo 1 ve Örnek PCR reaksiyonu ve Örnek PCR, aşağıdaki koşullar görüntülenen primer bilgileri kullanın: Şablon DNA yapısına göre, bu örnekte, Wnt8a-HA şablon DNA olarak kullanılmıştır, üretilen değişecektir.
  2. , Bir jel ekstre etme kiti kullanılarak PCR reaksiyonları temizleyin 3 son elüsyon gerçekleştirmekMoleküler sınıf su 0μl.
  3. TAE hazırlanan bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünü 2 ul kontrol edin.
  4. Uygun kısıtlama enzimleri kullanılarak Digest Wnt8a-HA ve EGFP PCR ürünleri ve PCS2 Tablo 2 (Örnek PCR ürünü sindirimi) de tarif edildiği gibi reaksiyonların oluşması, (bakınız Tablo 1).
  5. 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe reaksiyonlar ve daha sonra buz üzerinde Wnt8a-HA ve GFP PCR ürünleri depolamak.
  6. PCS2 sindirmek dana alkalin bağırsak fosfatazı (CAIP) 1ul ekleyin ve 37 ° C'de 6 dakika inkübe edilir.
  7. Isı 65 ° C 'de 15 dakika boyunca inkübe edilerek CAIP etkisiz hale getirirler.
  8. Çalışma PCS2 ve PCR TAE hazırlanmış bir% 1 ultra saf agaroz jelinde sindirir.
  9. Jel özü ve bir jel ekstre etme kiti kullanılarak PCS2 ve PCR ürünleri temizlemek moleküler sınıf su 30ul son elüsyon gerçekleştirin.
  10. Tablo 2 (Örnek T4 ligasyonu) 'de tarif ve 16 saat boyunca 12 ° C'de inkübe olarak ligasyon ayarlayın.

2. mRNA sentezi: T oluşturmaemplate

  1. Membran Cerulean (memCerulean), zar-RFP (memRFP), Şşş-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP: Aşağıdaki Plazmidlerin kısıtlayıcı enzim sindirimi (ifade vektörü PCS2 tüm) kullanarak şablonları üretin.
    1. (Örnek şablon sindirmek) Tablo 2'de açıklandığı gibi ayarlayın kısıtlama sindirir.
    2. İyice karıştırın ve 37 ° C 'de 2 saat süre ile inkübe reaksiyonları.
  2. Reaksiyon tamamlanana kadar azalttığını kontrol etmek için bir% 1 agaroz jeli (TAE) üzerine sindirilmiş plasmidin 2,5 ul çalıştırın.
  3. Jel ekstre etme kiti kullanılarak digests temizleyin, moleküler sınıf su 50 ul son elüsyon gerçekleştirin.

3. mRNA sentezi: In Vitro Transkripsiyon içinde

  1. SP6 mRNA transkripsiyon kiti kullanılarak fonksiyonel mRNA sentezleme. 1.5 ml DNAz / RNAse ücretsiz mikrosantrifüj tüpler reaksiyonları birleştirin.
  2. Tablo 2 (Örnek mRNA sentezi) de tarif edildiği gibi mRNA transkripsiyon reaksiyonlarını ayarlayın.
  3. Karıştırmakreaksiyonlar hafifçe bir pipet ile ve daha sonra 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. % 2 agaroz jeli (TAE) üzerindeki reaksiyon 1 ul kontrol edin.
  5. Reaksiyona DNAz 1 ul ekle P20 ile yavaşça karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika daha inkübe reaksiyonu.
  6. Moleküler dereceli su 340 ul, amonyum asetat 40 ul ve reaksiyona fenol-kloroform 400 ul ekle. 30 sn için reaksiyonlar vorteksleyin.
  7. 5 dakika, 14,000 xg, 4 ° C sıcaklıkta mRNA Spin.
  8. Taze 1,5 ml taşımadan her reaksiyondan üst (sulu) tabakayı Pipet kapaklı ependorf tüp vidalı.
  9. Boşaltıldı reaksiyonların her kloroform eşit hacim. 30 saniye boyunca numune Vortex.
  10. 5 dakika, 14,000 x g, 4 ° C, mRNA Spin
  11. Taze bir 1.5 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp taşırken her reaksiyondan üst sulu tabakanın pipetle.
  12. Reaksiyonların her izopropanol eşit hacimde ekleyin ve mR çökeltilmesiNA 30 dakika boyunca -80 ° C 'de.
  13. MRNA pelet haline getirildi 14.000 x g'de 4 ° C'de 15 dakika boyunca reaksiyonların her Spin
  14. Pelet haline mRNA rahatsız etmemek için süpernatant özen kaldır
  15. , Reaksiyonların her% 70 etanol içinde 200 ul ekle reaksiyonları karıştırın ve daha sonra 14,000 x g'de, 4 ° C'de 10 dakika boyunca dönerler.
  16. , MRNA rahatsız bir vakum desikatörde veya hızlı-vac kullanılarak oda sıcaklığında pelet kuruması için etanol özen çıkarın.
  17. Moleküler sınıf su 10-20 ul mRNA yeniden askıya. Kısaca Spin ve buz üzerinde örnekleri tutmak. Not: 1 dakika boyunca 80 ° C'ye kadar ısıtma örnek eritmek yardımcı olabilir.
  18. % 2 agaroz jeli (TAE) üzerine mRNA 1ul çalıştırın ve konsantrasyon doğru bir okuma elde etmek için bir spektrofotometre ile 1,2 ul analiz eder.
    KRİTİK ADIM: Sentetik mRNA 400 ng / ul bir konsantrasyon aşağıdaki deneyler yürütmek için gereklidir.

    KRİTİK ADIM: 260/280 oranı ise2.00-2.20 aralığında veya mRNA'nın toplam miktarının dışında lityum klorür çökelmesi yerine, 12 ug aşmaktadır.
  19. -80 ° C'de 1 ul alikolar içinde mağazası mRNA. Alikotları kullanın ve daha sonra atmak; mRNA-freeze yeniden yoktur.

4. Yaratma Xenopus laevis Embriyolar

  1. (; Chorulon HCG) deneyden önce bir hafta Başbakan Xenopus hCG hormonu 50 adet ile deri altına enjeksiyon ile kadın laevis.
  2. Xenopus HCG 250 birimlerini enjekte ve 19 ° C sıcaklıkta karanlık, O / N onları kuluçka deneyden önce gece kadın laevis neden olur.
  3. 4 ° C'de 1xNAM içinde ötenazi erkek kurbağa ve mağaza testis parçalara ayır. Not: Erkek kurbağa Hayvanların Çizelge 1'e göre, terminal anestezi ile ötenazi edilir (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Masaj dişi Xenopus la toplamak, ovulasyonu laevis55 mm çaplı yuvarlak petri id yumurta.
  5. Iyonu giderilmiş su, 1 ml bir Xenopus laevis testis ¼ ezilmesiyle sperm süspansiyonu elde edin.
  6. Fırça Xenopus Pasteur pipeti ve pipet ampul kullanılarak ezilmiş sperm süspansiyon ile oocytes KRİTİK ADIM:. Deney gününde yaklaşık at 4:30 pm gübreleme reaksiyonları gerçekleştirin.
  7. NAM / 10 21 ° C'de, kültür embriyoları, su (su) seyreltildi,% 1 agaroz ile kaplanmış 55 mm Petri tabaklarda (çözümler için bakınız Tablo 3).
  8. Sistein / HCL (Tablo 3) ile 45 dakika sonra De jöle embriyolar. Not: 21 ° C 'de, embriyolar 90 dakika sonra 2 hücreli aşamaya ulaşacak ve bundan sonra her 20 dakikada bir yarılmasına neden olmaktadır.

5. microinjecting Xenopus Embriyolar

  1. 1 X 90mm cam kılcal ve Narishige PC-10 çift kademeli cam mikropipet çektirmenin kullanarak, enjeksiyonlar için mikropipetler çekin. Ince bir ipucu elde etmek için ampirik ayarlarını yapın (az bir mikron diameter).
  2. (Örneğin, Harvard Appartaus PLI-100 piko ENJEKTÖR) sürekli bir zaman dijital set süre için düzenlenmiş bir baskı uygulayarak sıvının kesin hacimleri sunmak için bir gaz mikropüskürtücü bir mikropipet (iğne) takın. Bir retikül veya kalibrasyon slayt kullanılarak belirlenen 1.25 ila 10 nanolitres bir hacim sunmak için pnömatik basıncını ayarlayın.
  3. Coat% 1 agaroz (su), 5 ml ile 55 mm petri kabı. Yemeğin dışında agaroz bir 35-35 mm kare kesin, bu embriyolar Microinject istikrarlı bir yüzey sağlayacaktır.
  4. NAM içine embriyolar transfer / 3 + Ficoll (Tablo 3) ve enjeksiyon çanak taşımak.
  5. Deneme için gerekli aşamaya ulaştığınızda hayvan yarımkürede embriyolar enjekte edilir.
    1. Hücre yüzeyi üzerinde GFP etiketli ligandların dağılımının analizi, hücre başına iki cep aşamasında, 10nl de iki yanal embriyolar enjekte etmek. Wnt8a-HA-eGFP için aşağıda gösterilen örnek mRNA dilüsyonları. KRİTİK ADIM: Tüm mRNA st konsantrasyonlar emin olun400 ng / ul sanat.
      Not: mRNA miktarı enjekte edilecek konsantrasyonlarda test edilmesi ve floresan lıgand görselleştirmek için gerekli minimum miktarda bularak deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir. Bir anti-HA antikoru kullanılarak Western lekeleme mRNAlar iki farklı floresan etiketli ligandların karşılaştırılmasına olanak sağlamak için benzer seviyelerde çevrilir olduğunu belirlemek için önemli bir adımdır; Biz Fellgett ve diğ., 2015 yılında Wnt8a-HA-eGFP ve Wnt11b-HA-eGFP için bunu yaptım.
      Not: (aday regülatör gibi bir kodlama) enjekte edilen mRNA etkisini değerlendirmek zaman, tipik bir kontrol, ek herhangi bir etkileri kontrol etmek için kardeş embriyolara, örneğin LacZ olarak aktif olmayan bir RNA enjekte etmektir embriyo transkript.
      1. 100 ng / ul konsantrasyonunu azaltmak için moleküler sınıf su 4 (1ul + 3ul dH 2 O) içinde memRFP mRNA 1 seyreltin.
      2. 4 (1ul + 3ul DH de Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 seyreltinMoleküler sınıf su 2 O) 100 ng / ul konsantrasyonunu azaltmak için.
      3. Wnt8a-HA-eGFP mRNA ile: 1 oranında bir 1 memRFP mRNA karıştırın.
      4. Kontrol mRNA LacZ veya Sulf1 bir modülatör ile ya: 1 oranında bir 1 5.5.1.3 mRNA karıştırın.
      5. Hücre başına mRNA 10nl (20nl toplam) ile 2 hücre aşamasında bilateral embriyolar enjekte edilir. Not: Bu m em RFP 250 pg, Wnt8a-HA e GFP 250 pg, her bir hücre enjekte edilen e GFP ve LacZ veya Sulf1 mRNA 2 ng Wnt11b-HA 500 ​​pg sonuçlanır.
    2. GFP difüzyon ligandlarını etiketli analiz etmek, mRNA, 16-32 hücre aşamada böyle memRFP gibi soy işaretleyici ile birlikte ligand-GFP için hücre başına 1.25 nl kodlama enjekte.
    3. Ligand difüzyon olası modülatörü etkilerini analiz etmek için, mRNA ligandı ve soy izleyici ile birlikte modülatör için kodlama ko-enjekte. Alternatif olarak, komşu hücre enjekte GFP-etiketli ligan kodlayan mRNA ile bird ve a soy tracer (memRFP) ve modülatör ve farklı bir soy tracer (memCerulean) kodlayan mRNA ile diğer.
  6. Şu güne kadar 12.5 ° C inkübatör ve kültür embriyolar transfer, Nieuwkoop ve Faber (NF) aşama 8.

6. eksize Hayvan Cap Eksplantlarındaki

  1. % 1 agaroz (su), 5 ml ile kaplanmış bir 55 mm'lik petri kaplarının transfer embriyolar. NAM / 2 (Tablo 3) ile çanak doldurun.
  2. . KRİTİK ADIM Tungsten iğneler kullanılarak dairesel hayvan kapaklar atın: bu daha iyi iyileşmek ve görüntü daha kolay olacak gibi bu aşamada büyük kapaklar atın, hiçbir yakınsak uzantısı oluşur sağlamak için kontrol kapaklarını tutmak.
  3. 4 saat 21 ° C'de 55 mm% 1 agaroz (su) ve kültür embriyolar ile kaplanmış petri yemekler hayvan eksplantlar aktarın KRİTİK ADIM:. 4 saat inkübasyon floresan proteinleri olgun izin için gereklidir.
  4. PVC insulatio iki kat aşağı yapışarak kabartma slaytlar oluşturunmikroskop lamı üzerine n bant. . Hayvan kapaklar monte etmek için bir bölmeyi bırakmak için bant dışına 10 mm dikdörtgen KRİTİK ADIM 14 mm Kesme: dikdörtgen kesmeden önce iyice slayt üzerine bant her iki katmanları düzleştirin.
  5. Pipet kabartma slayt içine NAM 2 ayrı damlacıkları / 2 (Tablo 3), damla başına yaklaşık 30 ul.
  6. Bir kesti P20 ucunu kullanarak kabartma slaytlar hayvan eksplantlar aktarın ve apikal tarafı yukarı bakacak şekilde yolunuzu. Not: Her slayt 10-15 hayvan kapaklar tutabilir KRİTİK ADIM:. Hayvan kapaklar kısmen iyileşmiş olması gereken bu aşamada, bu daha az hassastır ve forseps kullanılarak odaklı anlamına gelir.
  7. Yavaşça kabartma slayt üzerine bir cam kapak kayma düşürmek ve kapak kayma 20 dakika kurumasını bekleyin KRİTİK ADIM: Hayvan kapağı boyutu çok önemlidir;. kapak cam lamel kabartma slayt üzerine indirilir zaman pr yeterli hayvan kap hücrelerin apikal tabakasını sıkıştırır yeterince büyük olduğundan emin olunGörüntüye düz bir yüzey oduce. Hayvan kapaklar çok küçük ise hala o bir tabaka PVC bandı azaltır.
  8. Tırnak vernik kullanarak slayt Seal KRİTİK ADIM:. PVC bant olursa da o kadar yükseltmek ve slayt berbat olacak nemli çünkü kabartma slaytlar mühür çok tırnak cilası kullanmayın.
  9. 20 Karanlıkta dakika ve görüntüye hazır Kuru kabartma slaytlar, tipik hayvan kapaklar kez slayt mühürlü 4-6 saat sağlıklı kalacaktır.

7. Görüntüleme

Not: Görüntüleme ters konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu kullanılacak imzaları örtüşen çoklu fluorophores izin ve taramalar arasındaki potansiyel örnek hareketinin sorunu kaldırıldı olarak Lambda modu görüntüleme için seçildi.

  1. Düşük büyütmeli objektif kullanarak eksplantlar daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 63x / 1.4 yağ amacı geçmek bulun.
  2. Gerekli lazerler açın; Bu örnekte 405Lazer memCerulean heyecanlandırmak için kullanılan, 488 lazer GFP heyecanlandırmak için kullanıldı ve 561 lazer 405 ve 488/561 dichroic aynalar kullanarak memRFP heyecanlandırmak için.
  3. (Zen 2011 seçeneğini lambda modunda - 32 depo) kullanın lambda modu.
  4. , Geniş bir görüş alanı izin (0.6x kadar) görüntü uzaklaştırmak lasers.To 405nm, 488nm ve 561nm seçin.
  5. İstenilen görüntü boyutuna (220nm'de piksel boyutları ile 1024 x 1024 bu veri seti için kullanılmıştır) çerçeve boyutunu ayarlayın.
  6. Sinyal gürültü oranını geliştirmek için, tipik olarak 4 ila 8 ortalama ayarlayın.
  7. (Bu veri seti için kullanılan 561nm lazer göre 1 havadar birimi) iğne deliği optimize edin.
  8. . KRİTİK ADIM lazer güçleri optimize: Tüm fluorophores gerekli voltaj ve kazanç miktarını en aza indirgerken 32 dedektör dizisi kullanılarak tespit edilebilir böyle 405nm, 488nm ve 561nm lazer dengeleyin.
  9. MemCerulean, GFP ve memRFP yayılan ışık varlık toplayın. Bu çalışma ışık ~ Her toplandı415-720nm gelen 10nm, daha büyük bir toplama aralıkları da mümkün olmasına rağmen (örn., Her ~ 20 nm).

8. Resim Analizi

  1. GFP etiketli ligandların hücre yüzey ifadesi üzerindeki etkilerini incelemek modülatörlerinin
    NOT: Aşağıdaki adımlar analiz laboratuvarımızda gerçekleştirildi nasıl ayrıntılı bir rehber vardır. Son kullanım kılavuzu adımlardan bazıları kaldırmak için ImageJ veya FIJI komut yazarak süreci hızlandırmaya isteyebilirsiniz.
    KRİTİK ADIM: Bu son kullanıcı numuneler son deney, son deneyde kullanılan çoklu fluorophores orm etkili bir spektral Karışmama ki yönlü amacıyla gerçekleştirilir aynı koşullarda kullanılan herhangi bir florofor spektrumu önemlidir.
    Analiz iki ana tip Bu bölümde gerçekleştirilir:
    1. Hücre zarı ile Wnt-HA-eGFP piksel ko-localising sayısı hesaplanıyor.
      1. , Yeşil UnmixZEN yazılımı bu fluorophores tek enjeksiyonları örneklenmiş spektrumları kullanılarak kırmızı ve gök mavisi kanalları. Ayrı LSM belgeleri aşağıdaki adımlardan tüm kullanmak üzere bu görüntüleri kaydedin.
      2. Açık LSM resim düzenleme yazılımı doğrudan dosyaları. Not: Aşağıdaki yönergeler FIJI Görüntü J. içindir
      3. Bu otomatik olarak ayrı kanal içine görüntüleri bölecek, görüntü sırası belgeler olarak LSM görüntüleri kaydedin.
      4. Verilerin analizinde kullanılacak komut analiz yazılımı için komut dosyaları (gerçek komut dosyası için ek kod dosyaları görmek) aynı klasöre görüntü dizisi kaydedin. Not: Aşağıdaki talimatlar Matlab içindir.
      5. Script analiz yazılımı açın ve komut dosyaları yazılı olduğu dizini açın.
      6. Yer analizi altında dosya adını girin, yazılım dosya adını almak ve analiz yapmak olacaktır.
        Not: Dosya adları her ima için ImageA0000 ve ImageA0001 okuyacakge. Resim kullanacağız komut analiz yazılımı maskesi olarak 0001 işaretlenmiş ve co-lokalize bu maske ile görüntüdeki 0000 piksel yüzdesini analiz.
      7. (Nüfuslu Hücre zarı olarak açıklamalı) yüzde co-lokalizasyon numarasını alın ve bir elektronik tabloya bu kopyalayın. Not: Aşağıdaki talimatlar Excel içindir.
      8. Mutlak veya göreli değer olarak ya bir çubuk grafikte yüzde co-lokalizasyon numarasını çiziniz.
    2. Wnt-HA-eGFP puncta sayısı, boyutu ve şekli analiz.
      1. Açık karıştırılmamış LSM resim düzenleme yazılımı doğrudan dosyaları. Not: Aşağıdaki yönergeler FIJI Görüntü J. içindir
      2. Onun ayrı kanalda (Görüntü> Renk> Böl kanalları) her bir görüntüyü Böl.
      3. Eşik hem Wnt-HA-EGFP ve membran işaretleyici kanalları (Görüntü> Otomatik eşik> Ayar) KRİTİK ADIM:. Işığa maruz kalmadan, tek bir temsilci görüntü üreten görmek için eşikler bir dizi deneyinKanal.
      4. (Maske yapın> Proses> Binary) bir maske membran işaretleyici kanalını dönüştürün.
      5. Bu maske (Düzenle> Invert) ters çevirin.
      6. Yukarıdaki gibi bir maskeye Wnt-HA-eGFP puncta dönüştürün.
      7. (Top box, alt kutuya zarı maskesi olarak Süreci> Görüntü hesap> Wnt maskesi) ligand-GFP maskesi membran işaretleyici maskesini çıkarın.
      8. Parçacık fonksiyonunu analiz kullanın. Buradan, gerekli parametreleri seçin ve veri (Analiz> Analiz parçacıkları) analiz.
      9. Bir elektronik tabloya parçacıklar, ortalama parçacık boyutu ve dairesellik verilerin sayısını kopyalayın ve daha sonra bu verilerden grafikler çizmek. Not: Bu analiz için, sadece 0.1-10μm 2 boyutlu analiz edildi arasında, herhangi bir kısıtlama parçacık dairesellik yerleştirildi parçacıklar. Bu talimat, Excel içindir.
  2. Ligand difüzyon dizi analizi
    1. Konfokal im tüm karışmamış görüntüleri açınyazılım yaşlanma ve sonra ham veri olarak ve bir RGB görüntüsü olarak, TIF formatındaki dosyaları dışa Not:.. Bu talimat Zen lite 2011 için KRİTİK ADIM: Bu mesafe olabilir bu yüzden görüntülerin en az birinde bir ölçek çubuğu ekleyin Analiz sırasında hesapladı.
    2. Aç görüntüleri görüntü analiz yazılımı analiz edilecek. Not:. Aşağıdaki yönergeler Sağ resmin arka plan üzerine tıklayın ve yeni bir katman yaratmak için, 'arka plan katmanı' seçin) Photoshop 8.2.3 içindir.
    3. . Sadece ligand-GFP kanal görünür (Katman> Yeni ayarlama katmanı> Kanal mixer) KRİTİK ADIM böylece, 0 membran işaretleyici kanalları ayarlayın: analiz edilen görüntüye yeni ayarlama katmanı Clip, seçenek yeni bir katman klibi Bu görüntüye kanal mikser seçeneği tıkladıktan sonra kene kutu olarak mevcuttur.
    4. Yeni çalışma alanı açın. RGB renk inç başına 300 piksel çözünürlük ve renk modunu (Dosya ayarlama>Yeni> Pano).
    5. Tüm görüntüleri tek çalışma alanına analiz edilen kopyalama (resmin üzerine tıklayın ve daha sonra kontrol ve Alt tutun ve çalışma alanına sürükleyin kontrolünü tutarak kanal mikser kısaltıldı oluyor).
    6. Her resim için difüzyon maksimum uzunluğu Wnt-HA-eGFP sola odaklı ifade hücreler ile, yatay eksen boyunca ölçülen böylece tüm görüntüleri yolunuzu.
    7. Bir TIF olarak çalışma alanını kaydedin ve sonra görüntü analiz yazılımı bu açın. Not: Aşağıdaki yönergeler FIJI Görüntü J. içindir
    8. ROI yöneticisi penceresini (Analiz> Araçlar> ROI yöneticisi) açın.
    9. İlk görüntüde bir dikdörtgen çizin, dikdörtgenin tam boyutunu belirtilen (Seç dikdörtgen aracı ve> Düzenle> Seçim> belirtin herhangi dikdörtgen çizin) olabilir. Not: 650 x 100 piksel uzunluk x genişlik bir boyutu, bu çalışmada kullanılmıştır.
    10. Wn ifade etki çok kenarında dikdörtgen yerleştirint-HA-eGFP. Wnt-HA-eGFP difüzyon maksimum mesafe ile bölgede dikdörtgen yerleştirin. KRİTİK ADIM: Hatta membran işaretleyici olmadan Wnt-HA e GFP ifade bölgeler nedeniyle eşiğe görünür olmalıdır; değil o takdirde ham görüntüleri danışın.
    11. Sağa kutusunu 10 mcM Shift. Görüntülerin birinde yer alan ölçek çubuğunun uzunluğu ölçerek mikrometre sayısını belirler (ölçek çubuğu> Analiz> set ölçek izleme bir çizgi çizin). Not: Bu piksel 10 uM bir değer sağlar.
    12. ROI yöneticisi penceresinde eklenti düğmesine basarak ROI yöneticisine kutusu ekleyin.
    13. Bir sonraki görüntüye taşı dikdörtgen dikdörtgen taşımak için dikdörtgen aracını geri tıklayarak ölçülecek. Tekrarlayın 8.2.10-11 adımları.
    14. Bir kez tüm panelleri ölçülmüştür, ROI yöneticisi menüsü (ROI yöneticisi> Diğer> Multiplot> Liste) seçin multiplot.
      Not: Veri Wnt piksel inte temsil(Piksel cinsinden ölçülen X) yatay eksen boyunca artan mesafe ile nsity (Y). Y değeri X noktasında ligand-GFP ortalama sinyal yoğunluğu ve ortalama her bir X değeri için Y eksenine içindeki piksellerin hepsi hesaplanır. Dolayısıyla kutu uzun, daha fazla piksel bu ortalama üretmek için analiz edilecektir. (Y ekseninde) küçük bir kutu gürültüsü olacaktır; Uzun boylu bir kutu çok düşük ortalama piksel yoğunluğu sahip olacaktır.
    15. Bir elektronik ve buna göre yeniden etiket içine multiplot kutusundan verileri kopyalayın. Not: Aşağıdaki talimatlar Excel içindir.
    16. Bu ligand-GFP ifade hücrelerden arka plan floresan temsil eder ve grafikler bozan her analizden verilerin ilk 10-20μm atın.
    17. Bilimsel analiz ve grafik yazılımı açın ve yeni bir not defteri oluşturun. Not: Aşağıdaki talimatlar SigmaPlot 13 içindir.
    18. O yatay sayılar üzerine çift tıklayarak veriler için sütunların gerekli sayıda Etiketn çalışma ve mikron onlara mesafeyi etiketleme, Wnt8a-HA-EGFP ve Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Bilimsel analiz ve grafik yazılımı ile ilgili sütunlar halinde elektronik tablodan veri kopyalayın.
    20. Bir dağılım grafiği oluşturmak (grafik oluşturma> Dağılım> Birden dağılım> Select X birçok Y> Y değerleri için X> Select Wnt8a-HA-eGFP ve Wnt11b-HA-eGFP> Bitir için mesafe sütununu seçin).
    21. Dağılım grafiği üzerinde bir Wnt8a-HA-eGFP noktada sol tıklama ile Wnt8a-HA-eGFP eğrisi üzerinde regresyon analizi yapın. Tüm noktaları vurgulamak gerekir. Analiz> Regresyon sihirbazında tıklayın.
    22. Eğri denklemi kategori (Üstel çürüme) ve denklem adını (Single, 3 parametresi) sonra bir sonraki basınız.
    23. Eğri sonra sonraki basın (veri önceden vurgulanmış, bu otomatik olarak yapılmalıdır) monte edilmelidir hangi X ve Y değerlerini seçin.
    24. Sayısal Çıkış seçeneği kadar sihirbaza devams sayfa, sonra işaretli sonraki basın 'raporu oluşturmak' sağlamak. Not: monte eğri parametreleri Raporunda 1 gösterilecektir *.
    25. Grafik seçenekleri sayfasında sonra işaretli bitirmek basın 'unvanını grafik denklemi eklemek' sağlamak. Not: Sihirbaz Raporu 1 * ve Grafik 1 * not defteri üstündeki sekmeler yaratmış olacaktır. Buna ek olarak eğrisi (8.2.20) 'de üretilen grafik eklenmiş olur.
    26. Yineleyin Wnt11b-HA-eGFP bir eğriye uyacak şekilde 8.2.21-8.2.25 adımları KRİTİK ADIM:. Verilere uydurma çoklu denklem kategorileri ve denklem isimleri deneyin. Not: En iyi uyum ile eğri kareler düşük kalıntı toplamı en yüksek R2 değer üretmek gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Floresan etiketli proteinleri ifade hayvan kap eksplant Konfokal analizi, farklı deneysel koşullar altında ligand dağılımını görselleştirmek için etkili bir sistem sağlar. Bir örnekte, GFP dağılımı Shh (Şekil 1) gösterilmiştir etiketli. 2 hücreli aşamada, Xenopus embriyolar bir kontrol mRNA ile veya mRNA Sulf1, hücre yüzeyi heparan sülfat değiştirir ve Shh morfojen gradyanı 16 etkileyen bir enzimi kodlayan halinde her iki her iki hücre enjekte edilir. Bu embriyolar 32 hücreli aşamasına kadar kültürlü ve tek bir hücre ko-enjekte mRNAlar (bir soy izleyici olarak) Şşş-GFP ve memRFP için kodlama ile. Bu hücre membranı gergin RFP ile işaretlenmiştir Shh-GFP eksprese eden bir hücre klonu. Blastula aşamada, hayvan kap eksplantlar konfokal mikroskopi ile analiz için alınır. Şekil 1 kontrol koşulları altında, Shh-GFP salgılandığını gösterir ve yeniden dışına yayılırgion enjekte mRNA'lara ifade. Ancak, Sulf1 varlığında, Şşş-GFP bu örnekte, bunu üreten hücrelerin klon dışında tespit edilmez, onun dağıtım daha kısıtlı olduğunu ve. Şşş-GFP dağılımına Sulf1 etkileri daha tam 16 analiz edilmiştir.

Xenopus embriyolarındaki ifade edildiğinde, hücre zarı üzerinde floresan birikir, ve hücreler konusunda çapında yaygın Wnt ligandları salgılanan etiketli. Şekil 2'de, fluorecently enjekte edilen hücrelerin Wnt ligandları etiketli ve proteinleri eksprese eden, iki farklı ve kantitatif ve kalitatif özelliklerini karakterize. Şekil 2A-H Wnt8a ve Wnt11b-HA-eGFP hayvan kap hücrelerinin zar üzerinde biriktiği örnekleri bulunmaktadır . Paneller 2B ve 2F kıyaslandığında, Wnt8a-HA-eGFP Wnt11b-HA-eGFP göre hücre zarı üzerinde daha verimli bir şekilde biriken olduğu açıktır. Sayısal bilgi, com uygulanarak konfokal görüntülerden çıkarılır edilmiştirgörüntü ve komut dosyası analiz yazılımı (ek kod dosyası) binasyonunun. Şekil 2I Wnt11b-HA-eGFP kıyasla hücre zarında Wnt8a-HA-eGFP göreli birikimini göstermektedir. Veriler, her bir görüntü, hücre membranı piksel Wnt-HA-eGFP piksel eş localising toplam sayısını belirleyen bir bilgisayar komut kullanılarak elde edilmiştir. Başka bir yaklaşımda, hücre membranı ile lokalize eş Wnt-HA-eGFP puncta toplam sayısı, görüntü analizi yazılımı (Şekil 2J) kullanılarak sayılır. Boyut ve bireysel puncta şekli hakkında Kalitatif bilgiler, görüntü analizi yazılımını kullanarak veri elde edilebilir. Wnt11b-HA-eGFP puncta hücre zarı (Şekil 2J), bu puncta ile birlikte lokalize daha az olacak şekilde ilave olarak, aynı zamanda Wnt8a-HA-eGFP puncta (Şekil 2K) daha küçük bir ortalama boyuta sahiptir. Ayrıca, Wnt11b-HA-eGFP puncta Wnt8a-HA-eGFP puncta (Şekil 2 L) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir daireselliğe sahiptir. Circularity bir amacı 1 mükemmel bir daire ve 0.1 bir ince uzun dairesel olmayan şekli temsil eder, mükemmel bir daire ne kadar yakın bir ölçüsüdür. Bu yaklaşım, Wnt ligand difüzyon her aday regülatörü test etmek için de kullanılabilir. Bunu yapmak için, kontrol hücreleri kontrol mRNA aday regülatörü aktif olmayan bir formda ya da beta-galaktozidaz (lacZ) ve ilgisiz bir protein için kodlama enjekte edilmelidir; Bu sadece regülatörü enjekte değil daha geçerli bir kontrol sağlar. Bu örneklerde Veriler parametrik olmayan testi, Mann-Whitney U 18-19 kullanılarak analiz edilmiştir. Istatistiksel analiz programı testi için kullanıldı.

Şekil 3'te, biz Wnt ligand difüzyon araştırmak. Tek bir blastomere hayvan kap eksplantlar, sadece bazı hücreler Wnt8a-HA-eGFP veya Wnt11b-HA-eGFP ya ifade eden hücrelerin bir alanı temsil eder, öyle ki 4-hücre aşamasında enjekte edilmiştir. Bir hücre soyu tracer dahil ederek, Expre belirleyebilirolmayan salgılayan hücrelerin karşı ssing ve bu (Şekil 3B ve 3C) analiz edilecek Wnt8a-HA-eGFP ve Wnt11b-HA-eGFP ligand difüzyon aralığı uzak kaynak hücrelerinden verir. Nedeniyle hayvan kap eksplant eğriliğine, güvenilir bir şekilde, bu deneyi kullanılarak ölçülebilir maksimum mesafe ligand difüzyon mutlak mesafeyi ölçmek için yeterli değildi 160μm oldu. Ancak, yazılım konfokal analizi, görüntü analizi ve bilimsel analiz bir arada kullanarak ve grafik ile Wnt-HA-eGFP morfojen degrade genel şekli (Şekil 3D) analiz edilebilir. Bu veriler, aynı hücrelerde etiketli ligandlar ile birlikte, başka bir proteini aşırı ifade Wnt salgılama veya difüzyon etkileyebilir olup olmadığını araştırmak için kullanılabilir. Deney Başka bir tür (Şekil 3E-3J) hücreler alan potansiyel bir düzenleyici etkisi hücreler ex komşu hücre klonları aday protein aşırı ifade ile ölçülebilirWnt8a veya Wnt11b-HA-eGFP basarak. Bu Wnt-HA-eGFP ligand difüzyon regülatör olmayan hücre özerk etkileri incelenmiştir sağlar. Şekil 2 ile uyumlu olarak, daha fazla Wnt8a-HA-eGFP hem difüzyon deneylerinde Wnt11b-HA-eGFP daha hücrelerinden uzakta difüzyon tespit edilebilir.

Bu yazıda anlatılan deneylerin türleri Shh ve Wnt sinyal 16,17 üzerinde Sulf1 etkisini analiz etmek için kullanılmaktadır.

figür 1
Shh-GFP dağılımı Şekil 1. modülasyonu Xenopus hayvan kapaklar konfokal analizi ile tespit edilebilir. (A) embriyolar ilk mRNA Sulf1 veya bir kontrol mRNA için kodlama ile enjekte edilir deneysel tahlil gösteren bir karikatür, aynı embriyolar daha sonra mRNA tek bir hücrede Shh-GFP için kodlama ile 32 hücreli aşamada enjekte vardır. (BC) Hayvan kap eksplantderecesinde 8 alındı ​​ve 4 saat sonra görüntülenmiştir. Çıkan hücre Shh-GFP + memRFP ifade klonunun kenarında gösterilmiştir. Kontrol embriyoları (B) 'de, Shh-GFP uzağa sinyal üreten hücrelerin memRFP işaretlenmiş klonundan dağıtılır. Sulf1 (C) ifade embriyolarda, Şşş-GFP daha kendi dağıtım sınırlıdır, 16 bkz. memRFP eflatun gösterilen ve yeşil Shh-GFP edilir. Ölçek çubukları 20 um temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Nicel ve hücre zarı üzerinde Wnt8a ve Wnt11b-HA-eGFP puncta kalitatif analizi. (AH) Embriyolar mRNA iki hücre aşamada hayvan yarımkürede içine memRFP (500 pg) kodlayan bi-lateral mikroenjeksiyon yapıldı. Buna ek olarak embriyolar mR enjekte edildi NA kodlama (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) veya [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1NG). Herhangi bir potansiyel düzenleyici etkilerini analiz ederken LacZ ek mRNA / proteini için bir kontrol sağlamak için embriyolar, ayrıca, mRNA'nın kodlama ile enjekte edilmiştir. (C) ve (G) beyaz kutular sırasıyla paneller (D) genişlemiş alanlar ve (H) işaretleyin. Wnt-HA-eGFP floresans hücre membranı ile ko-lokalize toplam miktarı, görüntü ve script analizi yazılım ve normalize (I) 'e göre hesaplandı. Kalitatif bilgiler görüntü analizi yazılımı kullanılarak ekstre edilmiştir. Wnt8a ve Wnt11b-HA-eGFP punctae partikül sayısı (J), parçacık boyutu (K) ve partikül dairesellik (L) için analiz edilmiştir. Mann-Whitney U (** p <0.01), N = embriyo sayısı. memRFP eflatun gösterilir ve Wnt8a / 11b-HA-GFP yeşil gösterilir, ölçek çubukları 20IJm temsil etmektedir.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Floresan difüzyon Ölçüm aralığı Şekil 3. Wnt ligandlar etiketledi. (A) Diyagram uzaklıkta ifade eden hücrelerden Wnt8a ve Wnt11b-HA-EGFP salınımını difüzyon ölçmek için kullanılan deney görünümüdür. (BC) şifreleyen mRNA'nın (B) memCerulean (600 ug), LacZ (4ng) ve Wnt8a-HA-EGFP (2ng) ya da (C) memCerulean (600 ug), LacZ (4ng) ve Wnt11b-HA-eGFP (2 ng tahlili tasvir), dört hücre aşamasında bir blastomere hayvan yarımkürede enjekte edildi. (D) Wnt8a-HA-eGFP ve Wnt11b-HA-eGFP difüzyon aralığı kontrol geri planı ile ölçülmüştür. (E) Diyagram kullanılan LacZ ifade eden bir arka plan ile Wnt8a ve Wnt11b-HA-eGFP difüzyon ölçmek için, det yöntemi bakın ails (FG) mRNA Wnt11b-HA-eGFP dört az bir blastomere hayvan yarımkürede enjekte edildi memCerulean (600 pg) ve (F ve H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) ya da (G ve I) kodlayan. Hücre evresi. Bir komşu blastomere bir arka plan ifade LacZ ile ölçüldü memRFP (600 pg) ve LacZ (4 ng) ayrıntılar için Anahtarını görüyorum. (J) Wnt8a-HA-eGFP ve Wnt11b-HA-eGFP difüzyon aralığını kodlayan mRNA enjekte edildi. Veri miktarı ve konfokal analizi, görüntü analizi ve bilimsel analiz ve grafik yazılımı kullanılarak çizilmiştir. memCerulean (mavi (CD) ve sarı (F ve H)), Wnt-HA-eGFP (yeşil), memRFP (Eflatun), ölçek çubukları 20 mikron temsil etmektedir. Bu dosyanın daha geniş bir sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Dosyaları / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>

Tablo 1. Astarlar PCS2 içine Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP ve Shh-GFP subklonlanması için kullanılır.

Reaksiyon Bileşenler
Örnek CS2 + sindirmek 1,5 PCS2 ug +
Kısıtlama enzimi 1 2 ul
Kısıtlama enzimi 2 2 ul
Kısıtlama enzim tamponu 5 ul (10X)
Moleküler sınıf su ile 50 ul kadar yapılmış
Örnek mRNA sentezi 2 ul lineer şablonu
2 ul 10x Megascript trx karışımı
2 ul 50 mM ATP
2 ul 50 mM CTP
2 ul 50 mM UTP
2 ul 5 mM GTP
2,5 ul 40 mM Cap Analog (m7G (5 '),
2 ul SP6 enzim karışımı
3.5 ul Moleküler dereceli su
Örnek PCR reaksiyonu 0.5 ul yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı (2.000 birim / ml)
2 ng DNA şablonu
2.5 ileri ul ve geri primerler (10 uM)
0.5dNTP ul
DNA ploymerase tamponu 5 ul (10X)
Moleküler sınıf su ile 50 ul kadar yapılmış
Örnek PCR koşulları 98 ° C'de 2 dakikada doğallık İntial
15 sn 98 ° C
15 sn 65 ° C 30 döngü
40 saniye, 72 ° C
72 ° C'de son uzatma 10 dakika
Örnek PCR ürünü özeti PCR ürününün 28 ul
Kısıtlama e 2 ulnzyme 1
Kısıtlama enzimi 2 2 ul
Kısıtlama enzim tamponu 5 ul (10X)
13 ul Moleküler dereceli su
Örnek T4 ligasyon 1 ul Kesme CS2 +
3 ul Kesme PCR ürünü 1
3 ul PCR ürünü, 2 Kesme
T4 DNA ligazı, 1 ul
1 ul T4 DNA ligaz tamponu (10X)
1 ul Moleküler dereceli su
Örnek şablonu sindirmek 5 ug plazmid DNA
10 ul Kısıtlama enzim tamponu (10X)
3 ul Not1 (Shh-GFP hariç Kpn1 kullanılır)
Moleküler sınıf su ile 100 ul kadar yapılmış

Alt-klonlama ve Wnt8a-HA-eGFP sentetik mRNA üretmek için kullanılan Tablo 2. Örnek reaksiyon koşulları.

<td>
Çözüm Bileşenler
Sistein-HCL 0.1x NAM
% 2.5 L-sistein hidroklorür monohidrat (pH 7.8)
NAM tuzları 110 mM NaCl
2 mM KCI
1 mM CA (NO3) 2
0.1 mM EDTA
NAM / 2 0.5x NAM tuzları
5 mM HEPES pH 7.4
0,25 mM Bikarbonat
25 ug / ml Gentamisin
NAM / 3 + Ficoll 0.33X NAM tuzları
5 mM HEPES pH 7.4
0,25 mM Bikarbonat
2 5 ug / ml Gentamisin
5% Ficoll
NAM / 10 0.1x NAM tuzları
5 mM HEPES pH 7.4
25 ug / ml Gentamisin

Tablo 3. Çözümler Xeno'ya üretim ve mikroenjeksiyon sırasında kullanılanirin embriyolar laevis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolün bir parçası, normal olarak, işlenmiş salgılanan ve bağlı bir floresan parçası olmasına rağmen, alıcı hücre içinde bir yanıt ortaya çıkarmak için, biyolojik olarak etkin ligandları oluşturuyor. Bu floresan etiketli gen ürünü, uygun bir deney kullanılarak biyolojik olarak aktif olduğunu belirlemek için çok önemlidir. Shh-GFP, PtC1 ekspresyonunu aktive etme kabiliyeti 16 doğrulandı. Wnt8a tek ventral blastomere 20-21 ile ifade edilmiştir ve Wnt8a-HA-eGFP Bu biyolojik etkinliğini korumak gösterilen ikincil bir ekseni indüklemek için oldukça güçlü bir bir yeteneği vardır. Wnt11b yakınsak uzantısı 21-22 uğramasını aktivin tedavi ektodermal eksplantlar engeller ve Wnt11b-HA-eGFP aynı zamanda biyolojik aktivitesini 17 muhafaza eder. Etiketsiz proteinlere eşdeğer tepkiler etiketli ligandların yeteneği sonuçları olacak b floresan ligandlar kullanılarak deneylere dayalı düşündürmektedirNormal bir protein ile ilgili e. Ligand ve floresan protein arasındaki HA epitopunun eklenmesi Wnt aktif fluoresan hem de olması oluşturur sağlayan bir aralayıcı bölgesini sağladı.

Bu tür bir analiz başlıca sınırlaması doğrudan endojen morfojen geçişlerini üzerinde bilgilendirmek olmamasıdır. Örneğin, hayvan kap hücrelerin alanın karşısındaki Shh'nin difüzyon Way embriyo kolumnar nöral epitel içinden endojen Shh'si hamle yansıtmayabilir. Ancak, bu protokolün sadelik ligandlar dağıtımına ilişkin eksojen düzenleyicilerin etkisi test edilebilir deneyler verir. Bu yaklaşımlardan sonuçları hipotezlerin temeli in vivo analizlerde daha talepkar kullanılarak test edilecek oluşturabilir. Örneğin, bu çalışmada açıklanan yöntemler kullanılarak Shh-GFP dağıtımını engelleyici aşırı ifade Sulf1 kabiliyeti Shh morfojen grad modüle Sulf1 potansiyeline işaretsağ- lasa. Bu doğrudan doğruya test edilmiş ve morfolinodur Sulf1 knock-down ve nöral tüp 16 endojen Shh görselleştirmek için immünsitokimya antisens kullanılarak valide edildi. Bizimkine benzer bir yöntem ligand difüzyon düzenleyen olabilir belirli mekanizmaların araştırılması için kullanılır olmuştur. Smith ve arkadaşları bir GFP etiketli düğüm (Xnr2) basit difüzyon kullanılan ve bir degrade 23 oluşturmak için uzantıları (cytonemes) ya da transsitoz (veziküller kullanarak) hücre değil gösterdi.

Özellikle yolları blok diğer proteinlerin sinyal molekülü bir tepki bir hücreden gelen sinyalleri aktarmak için aracı olarak gerekli olup olmadığını araştırmak için hedeflenmiş hücrelerinde ifade edilebilir burada bu yöntemlerin diğer ayrıntıları mümkündür. Örneğin, aktivin kaynağı ve yanıt hücreler arasında bir dominant negatif aktivin reseptörü ifade eden basit ligand difüzyon kaynak e uzak bir tepki çeşitli hücre çapları ortaya olabileceğini göstermiştir24 arasında duyarlı olmayan hücreleri ile ven. Vahşi tip hücreler nodal 25 için vazgeçilmez bir ortak reseptörü eksik olmayan duyarlı mutant hücreler ile çevrili olmasına rağmen, nodal kaynağı cevap nerede bu sonuç, Zebra balığı çalışma ile desteklenmiştir. Diğer çalışmalar floresan levhası 'ligandlar 28,29 yayılmasını araştırmak için zebrafish kullandık. Bazı çalışmalar, olasılıkla protein konformasyonuna katkı yüksek derecede korunmuş sistein, sinyal aktivitesi üzerindeki etkisi Wnt proteinlerin C-terminalini etiketleme epitop olduğunu gözlemlemiştir. Daha önceki çalışmalar (örneğin, HA tag gibi) bir ara parçası da dahil olmak üzere biyolojik olarak aktif bir 17 olan etiketli Wnt ligandlar ile sonuçlanır göstermiştir. Boşluk Wnt-Frz 30 bağlama başparmak işaret parmağı modelinde olduğu gibi ligandın-reseptör etkileşimi için gereken esnekliği gibi sağladığından bu muhtemeldir.

Çalışmalarımızı ilerleyen için bir sonraki adım bir vis eklemektirsinyal yolunun aktivasyonu için ual okuma. Örneğin, GFP etiketli Wnt11b sinyal yeteneğine sahip olan boyunca sağlanmasına olanak veren bir ligand kaynağı uzak hücrelerinde DVL 26 ölçülecek eksprese. Wnt8a sinyal aktivite aralığının kaynağından bir mesafede hücreler 27 b-katenin, nükleer lokalizasyonunu ölçerler antikor lekeleme kullanılarak gösterilebilir. Bu tür deneyler, bu yazıda tarif edilen teknikler kullanılarak yapılabilir. Biri morfogen eşik aralığının saptanması bir ligandın dağıtım ama sinyal yollarının ayrıca çıkış ölçer ve bu şekilde, sadece burada farklı floresan protein veya florofor çeşitli kullanılmasıyla, ek bir bilgi seviyesi sağlanacak .

Xenopus laevis tedarik embriyolar, mRNA sentezini, mikro enjeksiyon ve incelemek için yöntemlere GFP-etiketli ligandları ve daha fazla ayrıntı görselleştirmek için uygun bir modeldiriyon 31 mevcuttur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bir BBSRC tarafından finanse edildi Bu çalışma (BB / H010297 / 1), SAR bir BBSRC kota öğrenciliği ve SWF bir MRC öğrenciliği MEP hibe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134, (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154, (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15, (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12, (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22, (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5, (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24, (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135, (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398, (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24, (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320, (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120, (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135, (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391, (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128, (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111, (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15, (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127, (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14, (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7, (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411, (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146, (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129, (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics