הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation
Published 2/29/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wong, S., Lam, P., Nafissi, N., Denniss, S., Slavcev, R. Production of Double-stranded DNA Ministrings. J. Vis. Exp. (108), e53177, doi:10.3791/53177 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בנינו ליניארי הסגור קוולנטית (LCC) DNA minivectors כחלופת וקטור שאינו ויראלי גן-משלוח המיוצרת באמצעות פלטפורמה פשוטה in vivo. Ministrings DNA בעל פרופיל בטיחות מוגבר וגם ביעילות ולספק מטען DNA אל תאים ממוקדים. וקטורי DNA קונבנציונליים לבצע רצפים פרוקריוטים רצויים, כוללים גנים עמידים לאנטיביוטיקה, מוטיבי CPG, ומקורותיה בקטריאלי של שכפול, דבר שעלול להוביל לגירוי של תגובות חיסוניות מארח. הזמינות הביולוגית של וקטורי DNA קונבנציונליים נפגעת גם בשל הגודל המולקולרי הגדול שלהם. טבעו המעגלי שלהם עשוי גם להקנות אינטגרציה כרומוזומליות, שמוביל mutagenesis insertional.

רצפים חיידקית הם נכרתו מן minivectors DNA, ומשאירים רק את הגן של עניין (ממשלת ישראל) ואלמנטי ביטוי איקריוטיים צורך. minivectors DNA LCC שלנו, או ministrings DNA, הם נטולי רצפים חיידקי immunogenic; ולכן שיפור הזמינות ביולוגית EIR וביטוי ממשלת ישראל. במקרה של שילוב וקטור לתוך הכרומוזום, ministring DNA LCC יהיה קטלני לשבש את כרומוזום המארח, ובכך להסיר את המוטציה המסוכנת מן אוכלוסיית התא מתרבה. כתוצאה מכך, ministrings DNA מציע את היתרונות של DNA 'minicircle' תוך ביטול פוטנציאל אירועי אינטגרצית וקטור רצויים. בהשוואה פלסמידים קונבנציונאלי וסגר עגול isogenic שלהם קוולנטית (CCC) עמיתיהם, ministrings DNA להפגין הזמינות הביולוגית מעולה, יעילות transfection, קינטיקה ציטופלסמית - הם כן הם דורשים כמויות נמוכות של חומרים פעילי שטח קטיוני עבור transfection יעילה של תאים היעד.

בנינו-צעד אחד מושרה במערכת vivo לייצור ministrings דנ"א coli Escherichia כי הוא פשוט לשימוש, מהיר, וניתן להרחבה.

Introduction

המטרה היא לייצר כמויות להרחבה של ליניארי סגור קוולנטית (LCC) minivectors ה- DNA באמצעות מושרה חום צעד אחד יעילות פשוט גבוהה מערכת ייצור in vivo DNA ministring. ministrings DNA לספק אסטרטגיה שאינה ויראלי בטוחה ויעילה להעביר דנ"א. הם משלבים את הבטיחות של וקטורי LCC עם היעילות של minicircles DNA, וגם להציע חלופה בטוחה יותר וקטורים הנגזרים וירוס מבלי להתפשר יעילות transfection.

על מנת מערכת המסירה transgene כדי להצליח, וקטור DNA חייב להיכנס לתא היעד המארח ולהביע את הגן המקודד (ים). ישנן מספר מחסומי הסלולר שצריכים להתגבר בפועל, במיוחד במערכות יונקות. כדי למנוע שפלה ידי nucleases בסרום וזיהוי חיסוני על ידי מערכת reticulo-אנדותל, וקטור DNA חייב להיות ביו וחסין-תואם עם מערכת היעד. DNA לא מוגנים מתעכל מהר ידי nucleases פלזמהואת קרום פלסמיד מורכב מחסומים ליפופרוטאין צפופים כך וקטור DNA חייב להיות מסוגל לחצות את קרום התא במהירות של תאי יעד. לאחר בתא, וקטורים חייבים לחצות את הציטופלסמה ולהעביר דרך קרום הגרעין להיכנס לגרעין לביטוי transgene. טכניקות למסירת הגן ללא ויראלי להתמקד שיפור של רקמות ותא מיקוד. עם זאת, השימוש של פלסמידים קונבנציונאלי עם טכניקות אלו מפחית יעילות transfection בשל נוכחותם של רצפים חיידקי immunogenic, אשר במהירות משתיק ביטוי גנים 1,2. פלסמידים קונבנציונלי בדרך כלל לשאת גנים עמידים לאנטיביוטיקה לצורך התחזוקה במערכות פרוקריוטים. עם זאת, אלה עשויים לייצר השפעות שליליות אפשריות ב מארחי אדם או להקנות עמידות המתרחשים מארח צומח טבעי באמצעות אפקטי העברת גנים אופקיים. פלסמידים קונבנציונלי גם מכילים מוטיבים CPG dinucleotide 2, אשר יכול לעורר תגובה immunostimulatory רצויות, באופן פוטנציאליצמצום ביטוי transgene או השתקה.

כפי שהם מורכבים אך ורק של קלטת ביטוי איקריוטיים, DNA minivectors, כגון דנ"א minicircles 3, הם אלטרנטיבה טובה יותר עבור משלוח גן כפי שהם מציגים שיפור זמינות ביולוגית תאית ו תאי ביטוי גנים משופר בשל הגודל המופחת שלהם ואת העדר אלמנטים פרוקריוטים immunostimulatory 4. פארס גודל הווקטור המופחת טוב יותר ביחס התנגדות לכוחות גזירה הקשורים in vivo ממשל אתר יעד 5. מספר העותק הגבוה של הווקטור לכל המוני יחידה דורש הגיב transfection פחות, ובכך להקטין רעילות. עם זאת, במקרה של שילוב וקטור אקראי לתוך כרומוזום מארח, מעגלי סגור קוולנטית (CCC) וקטורים, כולל שני minicircles דנ"א פלסמידים קונבנציונלי, להקנות המשכיות מולקולרית ועל כן היא עשויה להוביל mutagenesis insertional, אשר יכולה להיות השלכות הרסניות 7. ביטוי גנים Minimalistic מוגדר אימונולוגית (מידג ') וקטורים 8 ו וקטורים ליניארי מיקרו 9 (MiLV) הם וקטורים LCC דנ"א שפותח במבחנה. וקטורי מידג הפגינו עד ביטוי transgene השתפר 17 פי in vivo בהשוואה ל- DNA פלסמיד הקונבנציונלי וקטורי 11, ו הראו תוצאות מבטיחות 10 חיסון ריפוי גנטי לסרטן 8. בנוסף, בשל מבנה פיתול חינם של minivector LCC, מגיב transfection נדרש פחות בהשוואה למקבילו supercoiled CCC, ובכך להקטין רעילות 7.

וקטורים DNA LCC משופרת שלנו, ministrings DNA, הוכיחו יעילות ביטוי מעולה bioavaiלביליונים 7. יתר על כן, ministrings DNA מיוצר על מערכת ייצור חום-מושרה צעד אחד in vivo, חלופה כדאית וחסכונית וקטורי מידג ו MiLV LCC, הדורשים שלבים מרובים במבחנה. מערכת ייצור DNA ministring להיות הפגינה היא תהליך חום מושרה פשוט בצע in vivo, מה שהופך אותו הן חסכונית וניתן להרחבה בקלות. מערכת זו מנצלת את תל PY54 הנגזר בקטריופאג enterocolitica Yersinia / PAL protelomerase מערכת רקומבינציה 12 להפריד את קלטת ביטוי איקריוטיים המינימאלית מן שדרת פלסמיד פרוקריוטים. יש לנו מהונדסים Escherichia coli תאים (W3NN) להביע תל protelomerase תחת שליטה של האמרגן λ בקטריופאג חום מושרה, CI [Ts] 857 13. עם הביטוי, תל protelomerase פועלת באתרים PAL היעד הנוכחי בתוך "רצף סופר" (SS) אתרים הממוקמים על פלסמיד מבשרכדי להניב מוצרי LCC, שממנה ministring DNA יכול להיות מטוהר אז (איור 1). האתרים SS על פלסמיד מבשר DNA ministring גם לקודד אתרי היעד recombinases אחרים כולל Cre recombinase (לקס), TelN protelomerase (telRL) ו FLP recombinase (FRT), ובכך מקלות על ייצור של LCC isogenic ו CCC minivectors מן הפלסמיד מבשר אחד. בנוסף, כל אתר SS הוא מוקף משני עברי רצפים משפרים SV40 (SV40e), המשמשים לשיפור טרנסלוקציה גרעין 14. אנחנו הוכחנו במקום אחר כי בנוסף רצוף של SV40e בהדרגה מקנה עליות המקבילה יעיל transfection 7. הפלסמיד המבשר (pDNA MiniString או PDMS) מכיל polylinker (איור 1) כדי להקל על כניסה של כל גן רצוי של עניין היתוך תעתיק עם כתב הניאון הירוק (GFP).

הטכנולוגיה DNA minivector רשאילשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, והערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים "מיני" עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. פלטפורמת הפקת הצעד אחד החזקה שלנו במהירות ובקלות מייצרת ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ומציעה פרופיל בטיחותי גבוה.

Protocol

1. הכנת Media ותרבויות

  1. עבור LB + Amp: כן 500 מיליליטר של מרק לוריא- Bertani (LB) מעוקר באמצעות חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסף עם אמפיצילין להניב לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרשים.
  2. עבור TB + Amp: היכונו גדול (500 מ"ל או יותר) כרכים של ministring הייצור. כן 600 מיליליטר של מרק נהדר סטרילי (TB) מעוקר באמצעות חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסף עם אמפיצילין להניב לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרשים.
  3. עבור LB אגר + Amp: להכין צלחות אגר LB סטרילי על ידי הכנת LB + Amp השלימו עם 15 גר '/ ל של אגר. Aliquot כ 15 - 20 מ"ל במנות סטרילי פטרי החנות במהופך על 4 מעלות צלזיוס עד לרגע השימוש.
  4. הכינו צלחת פס של W3NN [PDMS] על ידי בסביבה נקייה מחיידקים פסים W3NN [PDMS] תאים על אגר LB + Amp. דגירה את הצלחת overnight על 30 מעלות צלזיוס, עד שניתן לראות מושבות אחת. אין דגירה W3NN מעל לטמפרטורה זו כדי למנוע derepressing ביטוי protelomerase.
  5. בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 5 מ"ל של LB + Amp לתוך מבחנה סטרילית. הכן תרבות הלילה של W3NN [PDMS] על ידי יחסנו נפח זה עם מושבה אחת מהצלחת פס. דגירת לילה התרבות ב 30 מעלות צלזיוס שייקר ב 230-250 סל"ד.

2. צמיחת שלב

  1. בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 10 מ"ל של LB + Amp לתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer סטרילית לחסן עם 100 μl של תרבות לילה W3NN [PDMS] לתוך Amp LB + מוכן, מה שהופך דילול 1: 100.
    1. לקבלת נפחים גדולים יותר, להוסיף 500 μl של תרבות הלילה לתוך 50 מ"ל של שחפת + Amp בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל, במקום LB + Amp.
    2. לחלופין, להשתמש כמו התרבות "נציג" השנייה בשלב 2.2.
  2. דגירת חממה רועדת ב 30 ° C ו 250 סל"ד עד המבוי הסתוםture מגיע באמצע לשלב יומן מאוחר, שמסומן על ידי צפיפות אופטית (OD) או ספיגה: 600 = 0.8. לאחר 1-2 שעות, המדיום צריך להתחיל להופיע עכור לעין בלתי מזוינת.
    1. בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 1 מ"ל של תרבות קובט ספקטרופוטומטר נקי.
    2. מדוד את ספיגת האור באמצעות ספקטרופוטומטר UV-VIS עם אורך גל מוגדר 600 ננומטר. השתמש 1 מ"ל של התקשורת שבו התאים גדלו להגדיר את החסר (LB או TB). לחלופין, השתמש תרבות נציג משלב 2.1.3 עבור שלב זה במקום.
    3. אם התרבות טרם הגיעה OD המתאים, לחזור שייקר ולבדוק שוב כל חצי שעה. בדוק את OD בתדירות גבוהה יותר כמו A 600 מתקרב 0.8.
  3. לאחר התרבות הגיעה בשלב מאוחר יומן, שמציינים 600 = 0.8, בסביבה נקייה מחיידקים ולהעביר את התרבות לתוך צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל.
  4. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה התרבות ב XG 10,000 למשך 10 דקות. בדוק עבור PEllet בתחתית של התחתית.
  5. למזוג supernatant פינה לתוך מיכל פסול Biohazard מתאים. נא לא להפריע התא גלול.
  6. חזור על שלבים 2.4-2.5 עד שכל התאים כבר נאספו.
  7. Re- להשעות גלולה ב 100 μl LB + Amp. לשאוב באמצעות micropipette או להשתמש במיקסר מערבולת. לייצור ministring יותר, מחדש להשעות את הגלולה מתוך 50 מיליליטר TB + תרבות Amp לתוך 1 מיליליטר של תקשורת LB + Amp הטרי.

3. הפקת Ministring

  1. בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 20 מ"ל של LB + Amp בבקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer וחום עד 42 ° C. לייצור ministring יותר, להכין 500 מ"ל של LB + Amp, שחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את resuspension לתוך המדיום שחומם מראש.
  3. לדגור על 42 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד עד שלב יומן בעבר, שמציינים 600 = 1.0. אל תשאיר 20 מ"ל של התרבות ב 42 מעלות צלזיוס בעבר 1 hr.
  4. מנמיכים את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר את התרבות עבור addi90 דקות תזונתיות. עבור 500 מיליליטר, לעזוב את התרבות לתקופת אינדוקציה נוספת של 90 - דקות 120 ואינו להפחית את הטמפרטורה.
  5. מנמיך את הטמפרטורה ל 30 מעלות צלזיוס ולהשאיר את התרבות הרועדת ב 200 סל"ד במשך תקופת downshift טמפרטורה נוספת של 2 שעות. עבור 500 מ"ל, להאריך את downshift הטמפרטורה ל 4 שעות או למשך הלילה.

4. Ministrings קציר

  1. בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את התרבות לתוך צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 10 דקות ולבדוק עבור גלולה.
  2. למזוג supernatant לתוך מיכל פסול Biohazard מתאים מבלי להפריע הגלולה. חזור על הפעולה עד שכל התאים כבר נאספו.
  3. שמור גלול להפקת פלסמיד עם כל הפקה מסחרית וערכת הסרת רעלן פנימית או להקפיא פלאש בחנקן נוזל חנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך חילוץ מאוחר יותר.

Representative Results

לאחר מיצוי DNA, פלסמיד מבשר שיורית, עמוד השדרה פרוקריוטים LCC, ואת ministring DNA יהיה התאושש. תשואה וטוהר פלסמיד בסך הכל ניתן להעריך באמצעות ספקטרופוטומטר. טוהר נאמד לפי היחס של הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר (A260 / A280) שבו יחס של 1.9-2.0 הוא אופטימלי. הכל מוצרי LCC ו CCC ניתן להפריד באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose (AGE) (איור 2). גיל מדמיין את תוצאות ministring ייצור לאחר אינדוקציה, לפני ministring טיהור. הערכה איכותית של ייצור ministring יכול להתבצע בשלב זה על ידי השוואת עוצמת הלהקה של ministring (2.4 kb) כדי פלסמיד הורה (5.6 kb) (איור 2). Ministring DNA ניתן לשחזר באמצעות פרוטוקולי מיצוי ג'ל תקן פלסמיד הבאים AGE. איור 3 מסכם ministring יעיל ייצור בתנאים שונים עשויים להתרחש בעת carrying את הפרוטוקול. יעילות הייצור Ministring נקבע בהתבסס על עוצמת הלהקה DNA באמצעות תוכנית ניתוח של היצרן. כל תוכנית צפיפות דומה ניתן להשתמש כדי לנתח את התוצאות של גיל.

איור 1
איור 1:. סקירה כללית של ministring ייצור (א) וקטור האב מכילה polylinker בתהליך איחוי תעתיק עם גן כתב, ממוסגרת על ידי שני אתרי SS. עמוד השדרה מקודד-lactamase בטא להתנגדות אמפיצילין וגם מכיל מספר אתרים לחתוך ייחודיים לשדרה לעיכול במבחנה. (ב) סקירה כללית של הפרוטוקול הראשי. שלבים 2) צמיחת שלב ו -3) Ministring הפקה מיוצגים דיאגרמה לספק סכמטית כוללת של השלבים הכרוכים, המדגיש את הפשטות של הפרוטוקול. (C) אינדוקציה Ministring. אינדוקציה חומה inactivates המדכא רגישה לטמפרטורה, המאפשר ביטוי תל ואחריו פעילות תל באתרי ס"ס פלסמידים ההורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Ministring ייצור לאחר חריגות פרוטוקול. 1: שליטה, 2: Uninduced, 3: מגודל, 4: Overinduced, 5: הסרת הקדומה. DNA ministring הוא כ 2.4 קילו, עמוד השדרה LCC הוא 3 kb, ואת הפלסמיד הורה pNN9 הוא 5.6 kb. עוצמת להקה של להקות עמוד שדרת ministring ו LCC טיפה עם חריגות פרוטוקול, מציין תשואת ministring נמוכה. משמאל לימין: 1 סולם kb מניו אינגלנד Biolabs; שליטה, בעקבות פרוטוקול; Uninduced, לא upshift הטמפרטורה; מגודל, הטמפרטורה upshift דוריןבשלב נייח גרם; Overinduced, upshift טמפרטורה מורחב; הסרה מוקדם, לא downshift טמפרטורה. פלסמידים חולצו באמצעות ערכת מיני פלסמיד אומגה Biotek EZNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. השפעות חריגות פרוטוקול על ministring יעילות הייצור (PE) תוצאות הם ממוצע של 3 ניסויים. PE נאמד עוצמת הלהקה יחסית למדוד באמצעות AlphaImager HP לאחר גיל. הסטיות להתרחש בכל השלבים הבאים: בקרה, בעקבות פרוטוקול; Uninduced, לא upshift הטמפרטורה בשלב 2; upshift מגודל, הטמפרטורה החל בשלב נייח בשלב 1.6; Overinduced, upshift הטמפרטורה הוארך בשלב 2.3; הסרת מוקדם, תאים יוסרו חילוץללא downshift הטמפרטורה בשלב 2.3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לייצור ministrings LCC DNA באמצעות פרוטוקול חום מושרת צעד אחד, שאינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד זה אשר משמש התפתחות חיידקים טיפוסית ומניפולציה. ministrings DNA הם נטול פיתול, קלטות ביטוי ה- DNA ליניארי יציבות, נטולות אלמנטים גנטיים פרוקריוטים. הם עשויים לשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, כמו גם בהערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים "מיני" עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. הצעד האחד החזק שלנו ב לפלטפורמת הפקת vivo במהירות ובקלות מייצר ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ללא הצורך בתהליכים במבחנה יקר רבים.

ישנם מספר צעדים קריטייםלהבטיח ייצור ministring אופטימלי (איורים 2 ו -3). אינדוקציה החום הוא השלב הקריטי ביותר כדי ministring הייצור. חוסר מוחלט של ministring הייצור הוא ככל הנראה בשל חוסר אינדוקציה (תאי שמר על 30 מעלות צלזיוס), שבו דיכוי הביטוי protelomerase מונע ההמרה של פלסמיד מבשר ministring LCC. בעקבות פרוטוקול האינדוקציה, מצפה יעיל ייצור של כ 75%. אינדוקציה חומה היא אופטימלית תוך תאים נמצאים בשלב יומן. למרות שאין הבדל משמעותי סטטיסטית ministring PE בעת שימוש תאים בשלב נייח ( "מגודל", איור 3), עשינו להשקיף כמעט ירידה של 50% בתשואה פלסמיד הכולל. תשואות תהיינה תלויות בפרוטוקול חילוץ פלסמיד המשמש. לייצור ministring אופטימלי, לעורר השראה חומה תוך תאים נמצאים בשלב יומן. ייצור ministring מסכן יהיה ככל הנראה בעקבות upshift הטמפרטורה ממושכת או insufficiedownshift הטמפרטורה NT. טמפרטורת upshift הממושכת היא מיואשת כמו זה מפעיל את ה בתגובת הלם חום coli 15, אשר עשוי לעכב פעילות protelomerase ולהפריע יציבות פלסמיד. לכן, תזמון downshift הטמפרטורה היא עוד שלב קריטי לייצור ministring יעיל. בלי זמן הדגירה נוסף על 30 מעלות צלזיוס, יעילות הייצור ministring נמצאה להיות מאוד עלוב ( "הסרת מוקדמת", איור 3). זה ניתן לייחס את כמות הזמן הנדרשת עבור ביטוי תל ופעילות. Protelomerase תל קידוד שמקורם prophage PY54 בדרך כלל מדביק Yersinia, אשר גדל בצורה אופטימלית סביב 28 מעלות צלזיוס 12, המציין כי 30 ° C יכול להיות גם אופטימלי יותר לפעילות תל.

מערכת ייצור DNA minivector מנצל פלטפורמה in vivo כדי ליצור minivectors רצף ה- DNA ללא חיידקים באיכות גבוהה. שינויים בפרוטוקול יורשה ליnclude לשנות את התקשורת צמיחה לייעל פלסמיד וייצור חלבון כדי להאיץ גדילת תאים במהלך שלב הצמיחה (TB במקום LB), או להגדיל ministring יעילות הייצור וההמרות. עבור אמצעי אחסון תרבות גדול יותר (200 מ"ל ו יותר), downshift הטמפרטורה הדגירה על 30 מעלות צלזיוס ניתנת להארכה לילה ללא השפעה שלילית חמורה על ministring PE. כללנו שינויים בפרוטוקול שלנו עבור 500 מ"ל תרבויות כדוגמה. טיהור ministrings DNA יכול להיות מזורזת דרך עיכול במבחנה endonuclease של עמוד השדרה פרוקריוטים. ישנם מספר אתרי יעד endonuclease (למשל, PI-SCEI, PvuI, SCAI) נגיש עמוד השדרה פרוקריוטים של פלסמיד המבשר, אשר ניתן לחתוך לחשוף ליניארי פתוח מסתיים, המאפשר שפל במבחנה של עמוד השדרה פרוקריוטים. בידוד של ministrings ממיני וקטור אחרים יכול גם להיות מושג באמצעות כרומטוגרפיה קרום אניוני 16.

מגבלה הנוכחית אחת הקשורים למערכת ההפקה וקטור LCC DNA הוא הצורך לטיהור של ministring DNA ממוצרים LCC ו CCC אחרים. למרות מטוהרים בקלות באמצעות שיטות בידוד פלסמיד סטנדרטיות, צעד הבידוד עדיין יכול להיות חסרון באווירה בקנה מידה גדולה. ההפרדה של ministring יכול להימשך זמן רב באמצעות AGE אם ministring ועמוד השדרה פרוקריוטים LCC דומות מדי בגודל. לחלופין, כרומטוגרפיה קרום אניוני עשויה לספק הפרדה טובה יותר של ministrings ממיני וקטור CCC 16. Upshift טמפרטורה יכול להיות אחרת הגבלה פוטנציאל כמו טמפרטורות גבוהות גם מפעיל את התגובה להלם חום ב E. coli, אשר משפיע באופן שלילי חלבון רקומביננטי מניב 17 ולהפחית עקב שיעורי פלסמיד ministring המרה. אנו מדווחים במקום אחר אופטימיזציות של פלטפורמת ההפקה לעקוף ו / או להפחית תופעות כאלה של חום הלם 18. אָנוּגם הם אופטימיזציה שיטות כרגע למנוע או להפחית LCC זיהום עמוד השדרה פרוקריוטים in vivo.

אינטגרציה כרומוזומלית של ministring DNA LCC משבש את כרומוזום מארח ומשעבד התא לאפופטוזיס. לא זו בלבד להפחית תוצאות שליליות אפשריות של mutagenesis insertional כגון oncogenesis והשתקה של גנים סמוכים, ובכך לשפר את הבטיחות שלה; האפקט הקטלני גם יכול לשמש ככלי עזר אידיאליים-ב דפיקה ומחקרי החלפת הגן ללא תופעות הלוואי הקשורות והניזק של אינטגרציה. וקטורים DNA ministring יכול להיות מיושם כלפי ההעברה ואת הביטוי של גנים עבור חלבונים תרופתיים, RNA, נוגדנים, או אנטיגנים לתוך יעד נתון in vivo או להחליף אלל פונקציונלי רַע או אי. החום-מושרה צעד אחד פשוט במערכת הייצור vivo מאפשרת וקטורי ministring DNA להיות מיוצרים בקלות ליישומים קליניים או תעשייתיים.

Disclosures

החוקרים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) למימון עבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli W3NN Mediphage strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFP Mediphage parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244620
Fisher BioReagents Terrific Broth Fisher Scientific BP2468500
BD Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific 214010
Ampicilin MP Biomedicals LCC 2190147
Ultrapure Milipore Water Fisher Scientific  Z00Q0V0US Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System
Surgical Gloves VWR (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
30 ml KIMAX Test Tubes VWR 89001-448
Spectrophotometer Cuvette Sarstedt 67.74
Sterile 15 ml Falcon Tubes  BD Falcon 62406-200,
Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  FroggaBio 2930-S0
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml BD Falcon 13-675-20
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml BD Falcon 13-668-2 
Micropipettor (100-1,000 μl) FroggaBio C1000-1
Micropipettor (20-200 μl) FroggaBio C200-1
Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) VWR 89079-472 
Sterile Pipette Tips (1-200 μl) VWR 89079-460
Fisher Scientific Economy Burner Fisher Scientific 03-917Q
Incubator Shaker New Brunswick Scientific  M1352-00000
Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980125 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980250 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980500 Aldrich 
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 335901 Model: Genesys 10 Vis
Floor Centrifuge Beckman Coulter  369001 Model: Avanti J-E
Benchtop Centrifuge Beckman 362114 Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific  02-215-365
1 kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10, (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6, (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21, (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19, (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118, (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3, (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3, (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7, (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21, (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21, (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11, (1), 154 (2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272, (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9, (2), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats