डबल असहाय डीएनए Ministrings का उत्पादन

1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation
Published 2/29/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wong, S., Lam, P., Nafissi, N., Denniss, S., Slavcev, R. Production of Double-stranded DNA Ministrings. J. Vis. Exp. (108), e53177, doi:10.3791/53177 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

हम एक गैर-वायरल जीन-वितरण वेक्टर विकल्प विवो में एक साधारण मंच के माध्यम से उत्पादन के रूप में रेखीय covalently बंद (एलसीसी) डीएनए minivectors का निर्माण किया। डीएनए ministrings बढ़ सुरक्षा प्रोफ़ाइल के अधिकारी और भी कुशलता से लक्षित कोशिकाओं के डीएनए माल उद्धार। पारंपरिक डीएनए वैक्टर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन, CPG रूपांकनों, और नकल के जीवाणु मूल, जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना को जन्म दे सकती सहित अवांछनीय प्रोकार्योटिक दृश्यों, ले। पारंपरिक डीएनए वैक्टर की bioavailability भी उनके बड़े आणविक आकार की वजह से समझौता किया है। उनके परिपत्र प्रकृति भी इन्सर्शनल mutagenesis के लिए अग्रणी, गुणसूत्र एकीकरण प्रदान कर सकते हैं।

बैक्टीरियल दृश्यों डीएनए minivectors से excised हैं, केवल ब्याज (भारत सरकार) और आवश्यक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति तत्वों के जीन को छोड़कर। हमारे एलसीसी डीएनए minivectors, या डीएनए ministrings, immunogenic बैक्टीरियल दृश्यों से रहित हैं; इसलिए वें सुधारEir जैव उपलब्धता और भारत सरकार अभिव्यक्ति। गुणसूत्र में वेक्टर एकीकरण की घटना में, एलसीसी डीएनए ministring घातक मेजबान गुणसूत्र को बाधित करेगा, जिससे proliferating सेल की आबादी से संभावित खतरनाक उत्परिवर्ती हटाने। नतीजतन, डीएनए ministrings 'minicircle' डीएनए का लाभ अवांछनीय वेक्टर एकीकरण की घटनाओं के लिए संभावित को नष्ट करते हुए प्रदान करते हैं। पारंपरिक plasmids और उनके isogenic परिपत्र covalently बंद (सीसीसी) समकक्षों की तुलना में, डीएनए ministrings बेहतर bioavailability, अभिकर्मक दक्षता, और cytoplasmic कैनेटीक्स का प्रदर्शन - वे इस प्रकार लक्ष्य कोशिकाओं के प्रभावी अभिकर्मक के लिए cationic surfactants की कम मात्रा की आवश्यकता होती है।

हम कोलाई में डीएनए ministrings का उत्पादन है कि प्रयोग करने में आसान है, तेजी से, और स्केलेबल है के लिए एक एक कदम विवो प्रणाली में inducible का निर्माण किया है।

Introduction

लक्ष्य रेखीय covalently बंद (एलसीसी) डीएनए minivectors एक सरल और उच्च दक्षता के एक कदम गर्मी inducible इन विवो डीएनए ministring उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने का स्केलेबल मात्रा में उत्पादन होता है। डीएनए ministrings एक सुरक्षित और प्रभावी गैर वायरल डीएनए रणनीति देने के लिए प्रदान करते हैं। वे डीएनए minicircles की दक्षता के साथ एलसीसी वैक्टर की सुरक्षा के गठबंधन, और भी अभिकर्मक दक्षता समझौता किए बिना वायरस व्युत्पन्न वैक्टर करने के लिए एक सुरक्षित विकल्प प्रदान करते हैं।

एक transgene वितरण प्रणाली के लिए आदेश में सफल होने के लिए, डीएनए वेक्टर लक्ष्य मेजबान कोशिका में प्रवेश और इनकोडिंग ट्रांस्जीन (ओं) व्यक्त करना चाहिए। वहाँ कई सेलुलर बाधाओं, व्यवहार में दूर करने की विशेष रूप से स्तनधारी सिस्टम में जरूरत है कि कर रहे हैं। आदेश reticulo-endothelial प्रणाली द्वारा सीरम न्युक्लिअसिज़ और प्रतिरक्षा पता लगाने के द्वारा गिरावट से बचने के लिए, डीएनए वेक्टर जैव और लक्ष्य प्रणाली के साथ प्रतिरक्षा-संगत होना चाहिए। असुरक्षित डीएनए जल्दी प्लाज्मा न्युक्लिअसिज़ से पच जाता हैऔर प्लाज्मिड झिल्ली घने लिपोप्रोटीन बाधाओं से बना है ताकि डीएनए वेक्टर तेजी से लक्ष्य कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली को पार करने में सक्षम होना चाहिए। सेल में एक बार, वैक्टर कोशिका द्रव्य पार और transgene अभिव्यक्ति के लिए नाभिक में प्रवेश करने के लिए परमाणु झिल्ली के माध्यम से पारित करना होगा। गैर-वायरल जीन डिलीवरी तकनीक ऊतक और सेल को निशाना बनाने की वृद्धि पर ध्यान केंद्रित। हालांकि, इन तकनीकों के साथ पारंपरिक plasmids के उपयोग immunogenic बैक्टीरियल दृश्यों की उपस्थिति है, जो तेजी से जीन अभिव्यक्ति 1,2 चुप्पी के कारण अभिकर्मक दक्षता कम कर देता है। परम्परागत plasmids आम तौर पर प्रोकार्योटिक प्रणालियों में रखरखाव के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों ले। हालांकि, इन मानव मेजबान टीम में संभावित प्रतिकूल प्रभाव उत्पादन या स्वाभाविक रूप से क्षैतिज जीन स्थानांतरण प्रभाव के माध्यम से मेजबान होने वाली वनस्पतियों के लिए प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं। परम्परागत plasmids भी डाईन्यूक्लियोटाइड सीपीजी रूपांकनों 2, जो एक अवांछित immunostimulatory प्रतिक्रिया ट्रिगर कर सकते हैं जिनमें संभावितकम करने या transgene अभिव्यक्ति मुंह बंद।

वे पूरी तरह से यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति कैसेट के शामिल कर रहे हैं, इस तरह के डीएनए minicircles 3 के रूप में डीएनए minivectors, उनके कम आकार और immunostimulatory प्रोकार्योटिक तत्वों के अभाव के कारण के रूप में वे बाह्य और intracellular जैव उपलब्धता और बेहतर जीन अभिव्यक्ति में सुधार एक्ज़िबिट जीन डिलीवरी के लिए एक बेहतर विकल्प हैं 4। कम हो वेक्टर आकार का किराया एक लक्ष्य साइट से 5 विवो प्रशासन के साथ जुड़े कतरनी बलों के प्रतिरोध के लिए सम्मान के साथ बेहतर है। इकाई बड़े पैमाने पर प्रति वेक्टर के उच्च प्रतिलिपि संख्या कम अभिकर्मक अभिकर्मक की आवश्यकता है, इस प्रकार विषाक्तता को कम करें। हालांकि, एक मेजबान गुणसूत्र में यादृच्छिक वेक्टर एकीकरण की घटना में, चक्राकार covalently बंद कर दोनों डीएनए minicircles और पारंपरिक plasmids सहित (सीसीसी) वैक्टर, आणविक निरंतरता प्रदान और इसलिए इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस, विनाशकारी परिणाम हो सकते हैं जो करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 7 को रोकने। न्यूनतर प्रतिरक्षा परिभाषित जीन अभिव्यक्ति (मिड्ज) वैक्टर 8 और सूक्ष्म रेखीय वैक्टर 9 (MiLV) इन विट्रो में विकसित एलसीसी डीएनए वैक्टर हैं। मिड्ज वैक्टर पारंपरिक प्लास्मिड डीएनए वैक्टर 11 की तुलना में विवो में एक 17 गुना सुधार किया transgene अभिव्यक्ति करने के लिए प्रदर्शन किया है, और टीका 10 और कैंसर 8 जीन थेरेपी में आशाजनक परिणाम का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, एलसीसी minivector की मरोड़ मुक्त संरचना के कारण, कम अभिकर्मक अभिकर्मक सीसीसी supercoiled समकक्ष की तुलना में आवश्यक है, इस प्रकार की विषाक्तता 7 को कम करने।

हमारी बढ़ाया एलसीसी डीएनए वैक्टर, डीएनए ministrings, बेहतर अभिव्यक्ति क्षमता और bioavai दिखा दिया हैlability 7। इसके अलावा, डीएनए ministrings एक एक कदम गर्मी inducible इन विवो उत्पादन प्रणाली, मिड्ज और MiLV एलसीसी वैक्टर, जो इन विट्रो में कई कदम की आवश्यकता के लिए एक समीचीन और लागत प्रभावी विकल्प पर उत्पादित कर रहे हैं। डीएनए ministring उत्पादन प्रणाली का प्रदर्शन किया जा करने के लिए एक सरल गर्मी inducible प्रक्रिया विवो में प्रदर्शन किया, जिससे यह है दोनों लागत प्रभावी और आसानी से स्केलेबल। इस प्रणाली Yersinia enterocolitica जीवाणुभोजी PY54 व्युत्पन्न तेल / पाल पुनर्संयोजन प्रणाली 12 protelomerase प्रोकार्योटिक प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी से कम से कम यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति कैसेट को अलग करने का लाभ उठाते। हम कोलाई कोशिकाओं (W3NN) गर्मी inducible जीवाणुभोजी λ प्रमोटर, सीआई [टी] 857 13 के नियंत्रण में तेल protelomerase व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है। अभिव्यक्ति पर, तेल protelomerase "सुपर अनुक्रम" (एसएस) अग्रदूत प्लाज्मिड पर स्थित साइटों के भीतर मौजूद पाल लक्ष्य साइटों पर काम करता हैएलसीसी उत्पादों, जिसमें से डीएनए ministring तो शुद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1) उपज के लिए। डीएनए ministring अग्रदूत प्लाज्मिड पर एसएस साइटों को भी, Cre recombinase (Lox), TelN protelomerase (telRL) और FLP recombinase (FRT) सहित अन्य recombinases के लिए लक्षित साइटों सांकेतिक शब्दों में बदलना जिससे एक अग्रदूत प्लाज्मिड से isogenic एलसीसी और सीसीसी minivectors के उत्पादन की सुविधा। इसके अलावा, प्रत्येक एसएस साइट SV40 बढ़ाने (SV40e) दृश्यों, जो परमाणु translocation 14 में सुधार करने के लिए सेवा द्वारा दोनों पक्षों पर घिरे हुए है। हम कहीं और दिखा दिया कि SV40e की लगातार इसके उत्तरोत्तर अभिकर्मक दक्षता 7 में इसी बढ़ जाती है प्रदान की है। अग्रदूत प्लाज्मिड (pDNA MiniString या PDMS) एक polylinker (चित्रा 1) हरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (GFP) के साथ ट्रांसक्रिप्शनल संलयन में ब्याज की किसी भी वांछित जीन की प्रविष्टि की सुविधा के लिए होता है।

डीएनए प्रौद्योगिकी मई minivectorजीन स्थानांतरण, संवाददाता जीनों की अभिव्यक्ति, और यूकेरियोटिक प्रणालियों में transgene अभिव्यक्ति की दक्षता की दिशा में आकलन के लिए पारंपरिक तरीकों के स्थान पर प्रयोग किया। डीएनए ministrings biocompatibility और बढ़ रैखिक डीएनए वैक्टर की बेहतर सुरक्षा के प्रोफाइल के साथ "मिनी" वैक्टर अभिकर्मक दक्षता लाभ गठबंधन। हमारे मजबूत एक कदम उत्पादन मंच तेजी से और आसानी से किसी भी जीन स्थानांतरण आवेदन के लिए डीएनए ministrings पैदा करता है और एक उच्च सुरक्षा प्रोफाइल प्रदान करता है।

Protocol

1. मीडिया और संस्कृति की तैयारी

  1. पौंड + amp के लिए: तैयार Luria-Bertani शोरबा (पौंड) की 500 मिलीलीटर 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव का उपयोग निष्फल। एम्पीसिलीन के साथ पूरक 4 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन और दुकान के 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता उपज के लिए जब तक आवश्यक।
  2. टीबी + amp के लिए: बड़े (500 मिलीलीटर या अधिक) उत्पादन ministring की मात्रा के लिए तैयार करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव का उपयोग निष्फल बाँझ भयानक शोरबा (टीबी) की 600 मिलीलीटर की तैयारी। एम्पीसिलीन के साथ पूरक 4 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन और दुकान के 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता उपज के लिए जब तक आवश्यक।
  3. लेग अगर + amp के लिए: LB + amp के साथ अगर की 15 ग्राम / एल पूरक की तैयारी द्वारा बाँझ लेग अगर प्लेटों की तैयारी। अशेष लगभग 15 - 20 बाँझ पेट्री डिश और दुकान में मिलीलीटर उल्टा 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे तक की आवश्यकता है।
  4. W3NN [PDMS] की एक लकीर की थाली से aseptically streaking W3NN [PDMS] तैयार लेग अगर + amp पर कोशिकाओं। प्लेट overni सेते30 डिग्री सेल्सियस पर GHT, जब तक एकल कालोनियों मनाया जा सकता है। इस तापमान के ऊपर W3NN सेते protelomerase अभिव्यक्ति derepressing से बचने के लिए नहीं है।
  5. Aseptically हस्तांतरण एक बाँझ टेस्ट ट्यूब में पौंड + amp के 5 मिलीलीटर। लकीर प्लेट से एक भी कॉलोनी के साथ इस मात्रा inoculating द्वारा W3NN [PDMS] की एक रात संस्कृति तैयार करें। 230-250 rpm पर एक प्रकार के बरतन में 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति रातोंरात सेते हैं।

2. विकास के चरण

  1. Aseptically एक बाँझ 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में पौंड + amp के 10 मिलीलीटर हस्तांतरण और तैयार पौंड + amp में रात भर W3NN [PDMS] संस्कृति के 100 μl, एक 1 बनाने के साथ टीका लगाना: 100 कमजोर पड़ने।
    1. बड़ी मात्रा के लिए, रातोंरात संस्कृति के 500 μl टीबी + एएमपी के 50 मिलीलीटर में एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में, पौंड + एएमपी के बजाय जोड़ें।
    2. वैकल्पिक रूप से, 2.2 चरण में दूसरी "प्रतिनिधि" संस्कृति के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस और 250 rpm पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सेते संस्कृति तकसंरचना देर लॉग चरण के मध्य तक पहुँच जाता है, एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) या absorbance ने संकेत: एक 600 = 0.8। 1-2 घंटे के बाद, मध्यम नग्न आंखों के लिए परेशान प्रकट करने के लिए शुरू करना चाहिए।
    1. Aseptically हस्तांतरण के लिए एक साफ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर क्युवेट संस्कृति के 1 मिलीलीटर।
    2. प्रकाश absorbance के उपाय तरंग दैर्ध्य 600 एनएम के लिए सेट के साथ एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर। मीडिया में जो कोशिकाओं को खाली (पौंड या टीबी) स्थापित करने के लिए बड़े हो रहे थे के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, बजाय इस कदम के लिए कदम 2.1.3 से प्रतिनिधि संस्कृति का उपयोग करें।
    3. अगर संस्कृति अभी तक उचित आयुध डिपो नहीं पहुंचा है, एक प्रकार के बरतन में लौटने और एक बार फिर से हर आधे घंटे की जाँच करें। अधिक बार ओवर ड्राफ्ट की जाँच के रूप में एक 600 दृष्टिकोण 0.8।
  3. एक बार जब संस्कृति देर लॉग चरण, ए 600 = 0.8 ने संकेत तक पहुँच गया है, aseptically बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति हस्तांतरण।
  4. 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifuging संस्कृति से कोशिकाओं को इकट्ठा। एक पीई के लिए निरीक्षण कियाट्यूब के नीचे llet।
  5. एक उपयुक्त biohazard अपशिष्ट कंटेनर में मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला छानना। सेल गोली परेशान मत करो।
  6. दोहराएँ 2.4-2.5 कदम जब तक सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है।
  7. 100 μl पौंड + amp में गोली फिर से निलंबित। महाप्राण एक micropipette का उपयोग कर या एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें। अधिक से अधिक ministring उत्पादन के लिए, ताजा पौंड + amp मीडिया के 1 मिलीलीटर में एक 50 मिलीलीटर टीबी + amp संस्कृति से गोली फिर से निलंबित।

3. Ministring उत्पादन

  1. Aseptically 42 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क और गर्मी में पौंड + amp के 20 मिलीलीटर जोड़ें। अधिक से अधिक उत्पादन के लिए ministring, पौंड + एएमपी के 500 मिलीलीटर, 42 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते तैयार करते हैं।
  2. preheated माध्यम में मेजबान स्थानांतरण।
  3. 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 250 आरपीएम अतीत लॉग चरण तक, एक 600 = 1.0 से संकेत दिया। 1 घंटा पिछले 42 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के 20 मिलीलीटर मत छोड़ो।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान कम करने और एक addi के लिए संस्कृति छोड़राष्ट्रीय 90 मिनट। 500 मिलीलीटर के लिए, 90 के एक अतिरिक्त प्रेरण अवधि के लिए संस्कृति छोड़ - 120 मिनट और तापमान में कमी नहीं है।
  5. 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान में कमी और 2 घंटा की अतिरिक्त तापमान downshift अवधि के लिए 200 rpm पर झटकों संस्कृति छोड़ दें। 500 मिलीलीटर के लिए, 4 घंटा या रात को तापमान downshift का विस्तार।

4. कटाई Ministrings

  1. Aseptically बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति हस्तांतरण। 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र और एक गोली के लिए निरीक्षण किया।
  2. गोली परेशान बिना एक उपयुक्त biohazard अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला छानना। दोहराएँ जब तक सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है।
  3. बाद में निकासी के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी व्यावसायिक निष्कर्षण और endotoxin हटाने किट या तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज के साथ प्लाज्मिड निकासी के लिए गोली को बनाये रखें।

Representative Results

डीएनए निष्कर्षण, अवशिष्ट अग्रदूत प्लाज्मिड, एलसीसी प्रोकार्योटिक रीढ़ की हड्डी, और डीएनए ministring के बाद बरामद किया जाएगा। कुल मिलाकर प्लाज्मिड उपज और पवित्रता एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। पवित्रता 260 एनएम और 280 एनएम (A260 / A280) जहां 1.9-2.0 के अनुपात के इष्टतम है पर absorbance के अनुपात का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है। सभी एलसीसी और सीसीसी उत्पादों agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (उम्र) (चित्रा 2) के माध्यम से अलग किया जा सकता है। उम्र गर्मी शामिल होने के बाद उत्पादन ministring, शुद्धि ministring से पहले के परिणामों visualizes। Ministring उत्पादन की एक गुणात्मक मूल्यांकन माता पिता प्लाज्मिड (5.6 KB) (चित्रा 2) को ministring (2.4 केबी) के बैंड तीव्रता की तुलना द्वारा इस स्तर पर बनाया जा सकता है। Ministring डीएनए उम्र निम्न मानक प्लाज्मिड जेल निकालना प्रोटोकॉल के माध्यम से ठीक किया जा सकता है। चित्रा 3 जबकि कैरी होने की संभावना विभिन्न शर्तों के तहत उत्पादन क्षमता ministring का सारप्रोटोकॉल बाहर हैैं। Ministring उत्पादन क्षमता में डीएनए बैंड निर्माता के विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग तीव्रता के आधार पर निर्धारित किया गया था। किसी भी इसी तरह डेन्टिसिटोमीटरी कार्यक्रम आयु के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Ministring उत्पादन का अवलोकन (ए) माता-पिता वेक्टर एक पत्रकार जीन के साथ ट्रांसक्रिप्शनल संलयन में एक polylinker, दो एसएस साइटों द्वारा तैयार होता है। रीढ़ की हड्डी को कूटबद्ध एम्पीसिलीन प्रतिरोध के लिए बीटा-लैक्टामेज़ और भी कई कटौती साइटों में इन विट्रो पाचन के लिए रीढ़ की हड्डी के लिए अद्वितीय होता है। (बी) के मुख्य प्रोटोकॉल का अवलोकन। कदम 2) विकास के चरण और 3) Ministring उत्पादन एक चित्र में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, शामिल कदम की एक समग्र योजनाबद्ध प्रदान करने के लिए प्रोटोकॉल की सादगी पर प्रकाश डाला। (सी) Ministring प्रेरण। गर्मी प्रेरण तापमान संवेदनशील repressor निष्क्रिय, तेल अभिव्यक्ति माता पिता plasmids में एसएस साइटों पर तेल गतिविधि के द्वारा पीछा अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल से विचलन के बाद उत्पादन Ministring। 1: नियंत्रण, 2: uninduced, 3: ऊंचा हो गया, 4: Overinduced, 5: प्रारंभिक निकालना। डीएनए ministring एलसीसी रीढ़ 3 KB है लगभग 2.4 केबी में है, और pNN9 माता पिता प्लाज्मिड 5.6 KB है। ministring और एलसीसी रीढ़ बैंड के बैंड तीव्रता प्रोटोकॉल से विचलन के साथ छोड़ देता है, कम ministring उपज का संकेत है। बाएं से दाएं: न्यू इंग्लैंड Biolabs से 1 केबी सीढ़ी; नियंत्रण, प्रोटोकॉल के बाद; Uninduced, कोई तापमान Upshift; ऊंचा हो गया, तापमान upshift ड्यूरिनजी स्थिर चरण; Overinduced, विस्तारित तापमान Upshift; प्रारंभिक हटाने, कोई तापमान downshift। प्लास्मिड ओमेगा बायोटेक EZNA प्लाज्मिड मिनी किट का उपयोग कर निकाले गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। उत्पादन क्षमता (पीई) ministring पर प्रोटोकॉल से विचलन के प्रभाव परिणाम 3 परीक्षण का मतलब कर रहे हैं। पीई उम्र के बाद हिमाचल प्रदेश AlphaImager का उपयोग करके मापा रिश्तेदार बैंड तीव्रता से अनुमान लगाया गया है। विचलन निम्नलिखित कदम पर होते हैं: नियंत्रण, प्रोटोकॉल के बाद; Uninduced, चरण 2 में कोई तापमान Upshift; ऊंचा हो गया, तापमान Upshift कदम 1.6 पर स्थिर चरण के दौरान शुरू हुआ; Overinduced, 2.3 कदम पर तापमान Upshift बढ़ाया; प्रारंभिक हटाने, कोशिकाओं को हटा दिया और निकाले2.3 कदम पर तापमान downshift के बिना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम यहाँ एक एक कदम गर्मी inducible प्रोटोकॉल है, जो कि जो ठेठ बैक्टीरिया विकास और हेरफेर में प्रयोग किया जाता है एक तरफ से कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता का उपयोग कर एलसीसी डीएनए ministrings के उत्पादन के लिए एक सरल प्रणाली का वर्णन है। डीएनए ministrings मरोड़ मुक्त, स्थिर रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट, प्रोकार्योटिक आनुवंशिक तत्वों से रहित हैं। वे जीन स्थानांतरण, संवाददाता जीनों की अभिव्यक्ति है, साथ ही में यूकेरियोटिक प्रणालियों में transgene अभिव्यक्ति की दक्षता की दिशा में आकलन के लिए पारंपरिक तरीकों के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। डीएनए ministrings biocompatibility और बढ़ रैखिक डीएनए वैक्टर की बेहतर सुरक्षा के प्रोफाइल के साथ "मिनी" वैक्टर अभिकर्मक दक्षता लाभ गठबंधन। विवो उत्पादन मंच में हमारे मजबूत एक कदम तेजी से और आसानी से कई महंगा प्रक्रियाओं में इन विट्रो के लिए आवश्यकता के बिना किसी भी जीन स्थानांतरण आवेदन के लिए डीएनए ministrings पैदा करता है।

वहाँ करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंइष्टतम ministring उत्पादन (आंकड़े 2 और 3) किया जाता है। गर्मी प्रेरण उत्पादन ministring करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। उत्पादन ministring के पूर्ण अभाव गर्मी प्रेरण (30 डिग्री सेल्सियस पर बरकरार रखा कोशिकाओं), जहां protelomerase अभिव्यक्ति के दमन एलसीसी ministring के अग्रदूत प्लाज्मिड के रूपांतरण को रोकता की कमी के कारण सबसे अधिक संभावना है। गर्मी प्रेरण प्रोटोकॉल के बाद, लगभग 75% की उत्पादन क्षमता की उम्मीद है। जबकि कोशिकाओं लॉग चरण में हैं गर्मी प्रेरण इष्टतम है। हालांकि पीई ministring जब ( "ऊंचा हो गया", चित्रा 3) स्थिर चरण में कोशिकाओं का प्रयोग करने में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, हम समग्र प्लाज्मिड उपज में लगभग एक 50% कमी का निरीक्षण किया था। पैदावार प्लाज्मिड निकासी इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर निर्भर करेगा। इष्टतम ministring उत्पादन के लिए, गर्मी प्रेरण को गति प्रदान करते हुए कोशिकाओं लॉग चरण में हैं। गरीब ministring उत्पादन की संभावना सबसे अधिक लंबे समय तक तापमान Upshift या insufficie का परिणाम हो जाएगाNT तापमान downshift। इस सक्रिय हो जाता है के रूप में लंबे समय तक तापमान Upshift हतोत्साहित किया जाता है कोलाई गर्मी झटका प्रतिक्रिया 15 है, जो protelomerase गतिविधि को बाधित और प्लाज्मिड स्थिरता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसलिए, समय तापमान downshift कुशल ministring उत्पादन के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। 30 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त ऊष्मायन समय के बिना, ministring उत्पादन क्षमता में बहुत गरीब हो ( "प्रारंभिक निकालना", चित्रा 3) मिला था। इस तेल की अभिव्यक्ति और गतिविधि के लिए आवश्यक समय की राशि के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। प्रारंभिक prophage PY54 एन्कोडिंग तेल protelomerase सामान्य रूप से Yersinia, जो बेहतर, लगभग 28 डिग्री सेल्सियस 12 बढ़ता है यह दर्शाता है कि 30 डिग्री सेल्सियस से भी तेल गतिविधि के लिए अधिक इष्टतम हो सकता है संक्रमित।

डीएनए minivector उत्पादन प्रणाली के एक विवो मंच उच्च गुणवत्ता वाले जीवाणु से मुक्त अनुक्रम डीएनए minivectors उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल करता है। प्रोटोकॉल में संशोधन मैं मईविकास मीडिया में फेरबदल के क्रम में विकास के चरण के दौरान सेल के विकास (पौंड की बजाय टीबी) को बढ़ावा देने, या उत्पादन और रूपांतरण दक्षता ministring बढ़ाने के लिए प्लाज्मिड और प्रोटीन के उत्पादन का अनुकूलन करने के nclude। बड़े संस्कृति मात्रा में (200 मिलीलीटर और अधिक से अधिक), तापमान downshift और 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के लिए पीई ministring पर गंभीर नकारात्मक प्रभाव के बिना रात भर बढ़ाया जा सकता है। हम एक उदाहरण के रूप में 500 मिलीलीटर संस्कृतियों के लिए हमारे प्रोटोकॉल में संशोधनों को शामिल किया है। डीएनए ministrings की शुद्धि प्रोकार्योटिक रीढ़ की इन विट्रो endonuclease पाचन के माध्यम से तेजी लाई जा सकती है। Endonuclease लक्ष्य साइटों की एक नंबर रहे हैं (उदाहरण के लिए, पीआई-SCEI, PvuI, ScaI) अग्रदूत प्लाज्मिड, जो खुले रेखीय बेनकाब करने के लिए काटा जा सकता है की प्रोकार्योटिक रीढ़ की हड्डी पर उपलब्ध है, समाप्त हो जाती है प्रोकार्योटिक रीढ़ की इन विट्रो गिरावट के लिए अनुमति देता है। अन्य वेक्टर प्रजातियों से ministrings के अलगाव भी आयनों विनिमय झिल्ली क्रोमैटोग्राफी 16 के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।

एक मौजूदा एलसीसी डीएनए वेक्टर उत्पादन प्रणाली के साथ जुड़े अन्य सीमा एलसीसी और सीसीसी उत्पादों से डीएनए ministring की शुद्धि के लिए की जरूरत है। हालांकि आसानी से मानक प्लाज्मिड अलगाव तरीकों का उपयोग कर शुद्ध, अलगाव कदम अभी भी एक बड़े पैमाने पर स्थापित करने में एक नुकसान हो सकता है। ministring के पृथक्करण समय लेने वाली उम्र का उपयोग कर यदि ministring और एलसीसी प्रोकार्योटिक रीढ़ की हड्डी के आकार में भी इसी तरह के हैं हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, आयनों विनिमय झिल्ली क्रोमैटोग्राफी सीसीसी वेक्टर प्रजातियों 16 से ministrings के बेहतर जुदाई प्रदान कर सकता है। तापमान Upshift एक और संभावित सीमा हो सकती है के रूप में उच्च तापमान भी में गर्मी झटका प्रतिक्रिया सक्रिय कोलाई, जो नकारात्मक पुनः संयोजक प्रोटीन को प्रभावित करता है और फलस्वरूप 17 पैदावार रूपांतरण ministring को प्लाज्मिड की दरों को कम। हम कहीं और रिपोर्ट उत्पादन मंच का अनुकूलन दरकिनार और / या गर्मी झटका 18 के इस तरह के प्रभाव को कम करने के लिए। हमवर्तमान में भी खत्म करने या विवो में एलसीसी प्रोकार्योटिक रीढ़ प्रदूषण को कम करने के तरीकों अनुकूलित कर रहे हैं।

एलसीसी डीएनए ministring के गुणसूत्र एकीकरण मेजबान गुणसूत्र बाधित और apoptosis के लिए सेल विषयों। इतना ही नहीं इस तरह के oncogenesis और आसन्न जीन का मुंह बंद, जिससे इसकी सुरक्षा में सुधार के रूप में इन्सर्शनल mutagenesis के संभावित नकारात्मक परिणामों को कम करता है; घातक प्रभाव भी जुड़े दुष्प्रभाव और एकीकरण की क्षति के बिना तोड़े और जीन प्रतिस्थापन के अध्ययन के लिए एक आदर्श तरीका के रूप में काम कर सकते हैं। डीएनए ministring वैक्टर विवो में हस्तांतरण और एक निश्चित लक्ष्य में चिकित्सीय प्रोटीन, आरएनए, एंटीबॉडी, या एंटीजन के लिए जीनों की अभिव्यक्ति की दिशा में लागू या एक mal- या गैर कार्यात्मक एलील की जगह किया जा सकता है। सरल एक कदम गर्मी inducible इन विवो उत्पादन प्रणाली डीएनए ministring वैक्टर आसानी से नैदानिक ​​या औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए उत्पादन किया जा करने की अनुमति देता है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते है कि उनमें कोई वित्तीय हितों की प्रतिस्पर्धा नहीं है।

Acknowledgements

लेखक इस काम के वित्तपोषण के लिए प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli W3NN Mediphage strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFP Mediphage parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244620
Fisher BioReagents Terrific Broth Fisher Scientific BP2468500
BD Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific 214010
Ampicilin MP Biomedicals LCC 2190147
Ultrapure Milipore Water Fisher Scientific  Z00Q0V0US Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System
Surgical Gloves VWR (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
30 ml KIMAX Test Tubes VWR 89001-448
Spectrophotometer Cuvette Sarstedt 67.74
Sterile 15 ml Falcon Tubes  BD Falcon 62406-200,
Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  FroggaBio 2930-S0
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml BD Falcon 13-675-20
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml BD Falcon 13-668-2 
Micropipettor (100-1,000 μl) FroggaBio C1000-1
Micropipettor (20-200 μl) FroggaBio C200-1
Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) VWR 89079-472 
Sterile Pipette Tips (1-200 μl) VWR 89079-460
Fisher Scientific Economy Burner Fisher Scientific 03-917Q
Incubator Shaker New Brunswick Scientific  M1352-00000
Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980125 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980250 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980500 Aldrich 
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 335901 Model: Genesys 10 Vis
Floor Centrifuge Beckman Coulter  369001 Model: Avanti J-E
Benchtop Centrifuge Beckman 362114 Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific  02-215-365
1 kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10, (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6, (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21, (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19, (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118, (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3, (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3, (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7, (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21, (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21, (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11, (1), 154 (2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272, (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9, (2), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats