Produktion af Double DNA Ministrings

1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation
Published 2/29/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wong, S., Lam, P., Nafissi, N., Denniss, S., Slavcev, R. Production of Double-stranded DNA Ministrings. J. Vis. Exp. (108), e53177, doi:10.3791/53177 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi konstruerede lineære kovalent lukket (LCC) DNA minivectors som en ikke-viral gen-overførselsvektor alternativ produceret via en simpel platform in vivo. DNA ministrings besidder en øget sikkerhedsprofil og også effektivt levere DNA last til målrettede celler. Konventionelle DNA-vektorer bærer uønskede prokaryote sekvenser, herunder antibiotiske resistensgener, CpG-motiver, og bakterielle replikationsstartområder, som kan føre til stimulering af værtens immunologiske reaktioner. Biotilgængeligheden af ​​konventionelle DNA-vektorer er også kompromitteret på grund af deres større molekylstørrelse. Deres cirkulære natur kan også bibringe kromosomal integration, der fører til insertionsmutagenese.

Bakterielle sekvenser udskæres fra DNA minivectors, så kun genet af interesse (GOI) og nødvendige eukaryote ekspressionselementer. Vores LCC DNA minivectors eller DNA ministrings, er blottet for immunogene bakterielle sekvenser; derigennem forbedre thEIR biotilgængelighed og indiske regering udtryk. I tilfælde af vektor integration i kromosomet, vil LCC DNA ministring letalt forstyrre værtskromosomet og derved fjerne det potentielt farlige mutanten fra prolifererende cellepopulation. Derfor DNA ministrings tilbyder fordelene ved "minicircle 'DNA samtidig fjerne muligheden for uønskede vektor integration begivenheder. I sammenligning med konventionelle plasmider og deres isogene cirkulære kovalent lukkede (CCC) modstykker, DNA ministrings demonstrerer overlegen biotilgængelighed, transfektionseffektivitet, og cytoplasmiske kinetik - de derfor kræver mindre mængder af kationiske overfladeaktive midler til effektiv transfektion af målceller.

Vi har konstrueret en et-trins inducerbar in vivo-system til produktion af DNA ministrings i Escherichia coli, som er enkel at anvende, hurtig og skalerbar.

Introduction

Målet er at fremstille skalerbare mængder lineær kovalent lukket (LCC) DNA minivectors hjælp af en simpel og høj effektivitet ettrins varme-inducerbar in vivo DNA ministring produktionssystem. DNA ministrings giver en sikker og effektiv ikke-viral strategi til at levere DNA. De kombinerer sikkerheden af ​​LCC vektorer med effektiviteten af ​​DNA minicircles, og tilbyder også et sikrere alternativ til virusafledte vektorer uden at kompromittere transfektionseffektivitet.

For at et transgen leveringssystem skal lykkes, skal DNA-vektoren ind i target værtscelle og udtrykke det kodede transgen (er). Der er flere cellulære barrierer, der skal overvindes i praksis, især i mammale systemer. For at undgå nedbrydning af serumnukleaser og immune påvisning ved retikuloendoteliale system skal DNA-vektoren være bio- og immun-kompatibel med målsystemet. Ubeskyttet DNA hurtigt fordøjet af plasma nukleaserog plasmidet membran består af tætte lipoprotein barrierer, så DNA-vektoren skal være i stand til hurtigt at krydse plasmamembranen af ​​målceller. Når i cellen, skal vektorer krydse cytoplasmaet og passerer gennem kernemembranen at trænge ind i kernen for transgenekspression. Ikke-virale gen levering teknikker fokus på forbedring af vævs- og celle-targeting. Men anvendelsen af konventionelle plasmider med disse teknikker reducerer transfektionseffektiviteten på grund af tilstedeværelsen af immunogene bakterielle sekvenser, som hurtigt tavshed genekspression 1,2. Konventionelle plasmider typisk bære antibiotikaresistensgener for vedligeholdelse i prokaryote systemer. Dog kan disse producere potentielle negative virkninger i humane værter eller give resistens over for naturligt forekommende vært flora via horisontal genoverførsel effekter. Konventionelle plasmider indeholder også dinukleotid CpG-motiver 2, der kan udløse en uønsket immunstimulatorisk respons, potentieltreducere eller silencing transgenekspression.

Da de udelukkende består af den eukaryote ekspressionskassette, DNA minivectors, såsom DNA minicircles 3, er et bedre alternativ for genafgivelse de udviser forbedret ekstracellulær og intracellulær biotilgængelighed og forbedret genekspression på grund af deres reducerede størrelse og fravær af immunstimulerende prokaryote elementer fire. De reducerede vektor størrelse billetpriser bedre med hensyn til resistens over for forskydningskræfter i forbindelse med in vivo-indgivelse til et målsted 5. Den højere kopiantal af vektoren pr masseenhed kræver mindre transfektionsreagens og dermed reducere toksicitet. Men i tilfælde af tilfældig vektor integration i et værtskromosom, cirkulært kovalent lukkede (CCC) vektorer, herunder begge DNA minicircles og konventionelle plasmider, bibringer molekylær kontinuitet og derfor kan føre til insertionsmutagenese, hvilket kan have katastrofale følger 7. Minimalistiske immunologisk definerede genekspression (Midge) vektorer 8 og mikro-lineære vektorer 9 (MiLV) er LCC-DNA-vektorer, der er udviklet in vitro. Midge vektorer har udstillet op til en 17-fold forbedret transgen ekspression in vivo forhold til konventionelle plasmid-DNA vektorer 11, og har vist lovende resultater i vaccine 10 og kræft 8 genterapi. Desuden, på grund af vridning-fri struktur af LCC minivector, er mindre transfektionsreagens kræves i forhold til CCC supersnoet modstykke, hvilket reducerer toksiciteten 7.

Vores forbedrede LCC-DNA-vektorer, DNA ministrings, har vist overlegen udtryk effektivitet og bioavailabilitet 7. Endvidere er DNA ministrings produceret på en et-trins varme-inducerbar in vivo produktionssystem, et effektivt og omkostningseffektivt alternativ til Midge og MiLV LCC vektorer, som kræver flere trin in vitro. DNA ministring produktionssystem, der skal påvises er et simpelt varme-inducerbar proces udføres in vivo, hvilket gør det både omkostningseffektiv og let skalerbar. Dette system udnytter Yersinia enterocolitica bakteriofag PY54-afledt Tel / pal protelomerase rekombination systemet 12 for at adskille den minimale eukaryote ekspressionskassetten fra det prokaryote plasmidskelet. Vi har manipuleret Escherichia coli-celler (W3NN) at udtrykke Tel protelomerase under styring af varmen-inducerbare bakteriofag λ promotor, cl [Ts] 857 13. Ved udtryk, Tlf protelomerase virker på kammerat målområderne stede i "Super Sequence" (SS) sites placeret på forstadiet plasmidettil opnåelse LCC produkter, hvorfra DNA ministring derefter kan oprenses (figur 1). SS steder på DNA ministring forløber plasmid også kode målområder for andre rekombinaser herunder Cre rekombinase (lox), TelN protelomerase (telRL) og Flp rekombinase (FRT), hvilket letter produktionen af isogene LCC og CCC minivectors fra en forløber plasmid. Derudover er hver SS websted flankeret på begge sider med SV40 enhancer (SV40E) sekvenser, som tjener til at forbedre den nukleare translokation 14. Vi har vist et andet sted at successiv tilsætning af SV40E gradvist giver tilsvarende stigninger i transfektionseffektiviteten 7. Precursor plasmid (pDNA MiniString eller PDMS) indeholder en polylinker (figur 1) for at lette indføring af enhver ønsket gen af interesse i transkriptionel fusion med det grønt fluorescerende reporter (GFP).

DNA minivector teknologi kananvendes i stedet for konventionelle fremgangsmåder til genoverførsel, ekspression af reportergener, og vurderinger i retning af effektiviteten af ​​transgen ekspression i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og øget transfektion effektivitetsfordele, som "mini" vektorer med den overlegne sikkerhedsprofil for lineære DNA-vektorer. Vores robuste en-trin produktionsplatform hurtigt og nemt producerer DNA ministrings for enhver genoverførsel ansøgning og tilbyder en højere sikkerhedsprofil.

Protocol

1. Udarbejdelse af Medier og kulturer

  1. For LB + Amp: Forbered 500 ml Luria-Bertani-bouillon (LB) steriliseres ved anvendelse af en autoklave ved 121 ° C i 30 minutter. Supplement med ampicillin til opnåelse af en slutkoncentration på 100 ug / ml ampicillin og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  2. For TB + Amp: Forbered store (500 ml eller højere) mængder af ministring produktion. Forbered 600 ml sterilt Terrific Broth (TB) steriliserede ved anvendelse af en autoklave ved 121 ° C i 30 minutter. Supplement med ampicillin til opnåelse af en slutkoncentration på 100 ug / ml ampicillin og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  3. For LB-agar + Amp: Forbered sterile LB-agarplader ved fremstilling LB + Amp suppleret med 15 g / l agar. Alikvote cirka 15 - 20 ml i sterile petriskåle og butik på hovedet ved 4 ° C, indtil påkrævet.
  4. Forbered en stribe plade af W3NN [PDMS] ved aseptisk striber W3NN [PDMS] celler på LB agar + Amp. Inkubér pladen overniGHT ved 30 ° C, indtil enkelte kolonier kan observeres. Må ikke inkuberes W3NN over denne temperatur for at undgå derepressing protelomerase udtryk.
  5. Overfør aseptisk 5 ml LB + Amp i en steril reagensglas. Forbered en overnatning kultur af W3NN [PDMS] ved at pode denne volumen med en enkelt koloni fra streak pladen. Inkuber kulturen natten over ved 30 ° C i et rysteapparat ved 230-250 rpm.

2. Vækst Phase

  1. Overfør aseptisk 10 ml LB + Amp i en steril 125 ml Erlenmeyer-kolbe og podning med 100 pi af overnight W3NN [PDMS] kultur i den forberedte LB + Amp, hvilket gør en 1: 100 fortynding.
    1. For større mængder, tilsættes 500 pi overnatskultur i 50 ml TB + Amp i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, i stedet for LB + Amp.
    2. Alternativt kan du bruge som det andet "repræsentant" kultur i trin 2.2.
  2. Inkuber i en rysteinkubator ved 30 ° C og 250 rpm, indtil cultur når midten til slutningen af log-fasen, er angivet med en optisk densitet (OD) eller absorbans: En 600 = 0.8. Efter 1-2 timer, bør mediet begynder at dukke uklar for det blotte øje.
    1. Aseptisk overføres 1 ml kultur til en ren spektrofotometer cuvette
    2. Mål lysabsorbans anvendelse af en UV-VIS-spektrofotometer med bølgelængden indstillet til 600 nm. Brug 1 ml af medier, hvori cellerne blev dyrket til at indstille den tomme (LB eller TB). Eventuelt bruge repræsentativ kultur fra trin 2.1.3 til dette trin i stedet.
    3. Hvis dyrkningen endnu ikke har nået den passende OD, vende tilbage til rysteren og tjekke igen hver halve time. Kontroller OD oftere som A 600 nærmer 0.8.
  3. Når kulturen har nået sen logaritmisk fase, angivet ved A 600 = 0,8, aseptisk overføre kulturen i sterile 50 ml centrifugerør.
  4. Indsamle celler ved centrifugering af kulturen ved 10.000 xg i 10 min. Undersøg for en pellet ved bunden af ​​røret.
  5. Dekanteres ryddet supernatant i en passende beholder til biologisk farligt affald. Forstyr ikke cellepelleten.
  6. Gentag trin 2,4-2,5 indtil alle celler er blevet indsamlet.
  7. Re-suspendere pellet i 100 pi LB + Amp. Aspirer anvendelse af en mikropipette eller bruge en vortex-blander. For større ministring produktion, re-suspendere pellet fra en 50 ml TB + Amp kultur i 1 ml frisk LB + Amp medier.

3. Ministring Production

  1. Tilsættes aseptisk 20 ml LB + Amp i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe og opvarmes til 42 ° C. For større ministring produktion, forberede 500 ml LB + Amp, forvarmet til 42 ° C.
  2. Overfør resuspensionen i den forvarmede medium.
  3. Inkuber ved 42 ° C og 250 rpm indtil forbi logaritmisk fase, angivet ved A 600 = 1,0. Lad ikke 20 ml kultur ved 42 ° C forbi en time.
  4. Sænk temperaturen til 37 ° C og lade kulturen for en yderlitionale 90 min. For 500 ml, forlader kulturen i yderligere induktionsperiode er mellem 90 - 120 minutter og ikke sænke temperaturen.
  5. Sænk temperaturen til 30 ° C og lade kulturen omrystning ved 200 opm i en yderligere temperatur nedgearing periode på 2 timer. For 500 ml, forlænge temperaturen nedgearing til 4 timer eller natten over.

4. Høst Ministrings

  1. Overfør aseptisk kulturen i sterile 50 ml centrifugerør. Centrifuger ved 10.000 xg i 10 min og inspicere for en pellet.
  2. Dekanteres i en passende beholder til biologisk farligt affald uden at forstyrre bundfaldet. Gentag, indtil alle cellerne er blevet opsamlet.
  3. Behold pillen for plasmid ekstraktion med kommerciel udvinding og endotoksin fjernelse kit eller flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C til senere udvinding.

Representative Results

Efter DNA-ekstraktion, resterende forløber plasmid, LCC prokaryot rygrad, og DNA ministring vil blive genvundet. Samlet plasmid udbytte og renhed kan vurderes ved anvendelse af et spektrofotometer. Renhed skønnes anvendelse af forholdet mellem absorbansen ved 260 nm og 280 nm (A260 / A280) når et forhold på 1,9-2,0 er optimal. Alle LCC og CCC produkter kan adskilles ved agarosegelelektroforese (AGE) (figur 2). AGE visualiserer resultatet af ministring produktion efter varme induktion, før ministring rensning. Kan foretages en kvalitativ vurdering af ministring produktionen på dette tidspunkt ved at sammenligne band intensiteten af ministring (2,4 kb) til forældre plasmid (5,6 kb) (figur 2). Ministring DNA kan inddrives via standard plasmid gel ekstraktionsprotokoller efter ALDER. Figur 3 opsummerer ministring produktionseffektivitet under forskellige forhold, der kan forekomme, mens carrying ud protokollen. Ministring produktionseffektiviteten blev fastsat på grundlag af DNA-bånd intensitet ved hjælp af producentens analyse program. Ethvert lignende densitometri program kan bruges til at analysere resultaterne af AGE.

Figur 1
Figur 1:. Oversigt over ministring produktion (A) Den forælder vektor indeholder en polylinker i transkriptionel fusion med et reportergen, indrammet af to SS sites. Rygraden koder beta-lactamase for ampicillinresistens og indeholder også flere kløvningspunkter unikke for rygraden til in vitro fordøjelse. (B) Oversigt over hovedenheden protokol. Trin 2) Vækst fase og 3) Ministring Production er repræsenteret i et diagram for at give et samlet skematisk af de involverede trin fremhæver enkelhed af protokollen. (C) Ministring induktion. Heat induktion inaktiverer den temperaturfølsomme repressor, så tlf udtryk efterfulgt af Tel aktivitet på SS steder i moderselskabet plasmider. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Ministring produktion efter afvigelser fra protokollen. 1: Kontrol, 2: ikke-induceret, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: Tidlig Removal. DNA ministring er cirka 2,4 kb, LCC rygrad er 3 kb, og pNN9 forælder plasmid er 5,6 kb. Band intensitet ministring og LCC backbone bands falde med afvigelser fra protokollen, hvilket indikerer lavere ministring udbytte. Fra venstre mod højre: 1 kb stige fra New England Biolabs; Kontrol, følgende protokol; Ikke-induceret, ingen temperatur upshift; Overgrown, temperatur upshift During stationær fase; Overinduced, udvidet temperaturområde upshift; Tidlig fjernelse, ingen temperatur downshift. Plasmider blev udvundet ved hjælp af Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Effekter af afvigelser fra protokollen om ministring produktionseffektiviteten (PE) Resultaterne er middelværdien af 3 forsøg. PE anslås fra relativ band intensitet målt ved hjælp AlphaImager HP efter AGE. Afvigelserne forekommer ved følgende trin: Kontrol, efter protokol; Ikke-induceret, ingen temperatur upshift ved trin 2; Overgrown, temperatur upshift begyndte under stationær fase i trin 1.6; Overinduced, udvidet temperatur upshift ved trin 2.3; Tidlig sletning, celler fjernet og ekstraheretuden temperatur downshift ved trin 2.3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi beskriver her et simpelt system til produktion af LCC DNA ministrings bruger ettrins varme-inducerbar protokol, der kræver ikke særligt udstyr bortset fra den, der anvendes i typisk bakterievækst og manipulation. DNA ministrings er torsion-fri, stabile lineære DNA ekspressionskassetter, blottet for prokaryote genetiske elementer. De kan anvendes i stedet for konventionelle fremgangsmåder til genoverførsel, ekspression af reportergener, samt i vurderinger i retning af effektiviteten af ​​transgen ekspression i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og øget transfektion effektivitetsfordele, som "mini" vektorer med den overlegne sikkerhedsprofil for lineære DNA-vektorer. Vores robuste et-trins in vivo produktionsplatform hurtigt og nemt producerer DNA ministrings for enhver genoverførsel ansøgning uden behov for flere dyre in vitro processer.

Der er flere kritiske trin tilsikre en optimal ministring produktion (figur 2 og 3). Varmeinduktion er den mest kritiske trin til ministring produktion. Fuldstændig mangel på ministring produktion er mest sandsynligt på grund af mangel på varme induktion (celler tilbageholdt ved 30 ° C), hvor undertrykkelse af protelomerase ekspression forhindrer omdannelse af precursor plasmidet til LCC ministring. Efter varme induktionsprotokol, forventer en produktionseffektivitet på ca. 75%. Varmeinduktion er optimal mens cellerne er i log-fase. Selvom der ikke er nogen statistisk signifikant forskel i ministring PE ved brug celler i stationær fase ( "Tilgroet", figur 3), gjorde vi observere næsten et fald i den samlede plasmidudbytte 50%. Udbytter vil afhænge af plasmid ekstraktion anvendte protokol. For optimal ministring produktion, udløser varme induktion mens celler er i log-fase. Dårlig ministring produktionen vil højst sandsynligt være et resultat af langvarig temperatur upshift eller insufficient temperatur downshift. Langvarig temperatur upshift frarådes, da dette aktiverer E. coli varmechok respons 15, som kan inhibere protelomerase aktivitet og forstyrre plasmidstabilitet. Derfor timing temperaturen downshift er endnu et afgørende skridt til effektiv ministring produktion. Uden yderligere inkubationstid ved 30 ° C, blev ministring produktionseffektivitet sig at være meget fattige ( "Early Removal", figur 3). Dette kan tilskrives den tid, der kræves til Tel ekspression og aktivitet. Den oprindelse profag PY54 kodning Tel protelomerase inficerer normalt Yersinia, som optimalt vokser omkring 28 ° C 12, hvilket indikerer, at 30 ° C også kan være mere optimalt for Tel aktivitet.

DNA minivector produktion system anvender en in vivo platform til at generere høj kvalitet bakterielle sekvens-fri DNA minivectors. Ændringer af protokollen kan jegnclude ændring af vækst- medier for at optimere plasmid og proteinproduktion for at fremme cellevækst under vækstfasen (TB stedet for LB), eller øge ministring fremstilling og forarbejdning effektivitet. Til større mængder kultur (200 ml og større), temperatur nedgearing og inkubation ved 30 ° C, kan forlænges natten uden alvorlige negative følger for ministring PE. Vi har medtaget ændringer i vores protokol for 500 ml kulturer som et eksempel. Oprensning af DNA ministrings kan fremskyndes gennem in vitro-spaltning af den prokaryote rygrad. Der er en række endonuklease målsteder (fx PI-Scel, Pvul, Scal) til rådighed på det prokaryote rygraden i precursor plasmid, som kan skæres for at blotlægge åben lineær ender, hvilket muliggør in vitro nedbrydning af den prokaryote rygrad. Isolering af ministrings fra andre vektorarter kan også opnås gennem anionbytningsmembran kromatografi 16.

En strømbegrænsning forbundet med LCC DNA-vektoren produktionssystem er behovet for oprensning af DNA ministring fra andre LCC og CCC produkter. Selvom let oprenses ved anvendelse af standard plasmid isoleringsmetoder, kan isoleringstrinnet stadig være en ulempe i en storstilet indstilling. Adskillelse af ministring kan være tidskrævende at bruge AGE hvis ministring og LCC prokaryote rygrad er for ens i størrelse. Alternativt kan anionbytningsmembran kromatografi give bedre adskillelse af ministrings fra CCC vektorarter 16. Temperatur upshift kan være en anden potentiel begrænsning, så høje temperaturer også aktivere varmechok-respons i E. coli, som krænker rekombinant protein giver 17 og dermed reducere satserne for plasmid til ministring konvertering. Vi rapporterer andre steder optimeringer af produktionen platform til at omgå og / eller afbøde sådanne virkninger af varme chok 18. Vier også i øjeblikket at optimere metoder til at fjerne eller reducere LCC prokaryot rygrad forurening in vivo.

Kromosomal integration af LCC DNA ministring forstyrrer værtskromosomet og underkaster cellen for apoptose. Dette er ikke blot reducere eventuelle negative konsekvenser af insertionsmutagenese såsom onkogenese og lyddæmpning af tilstødende gener, og derved forbedre dets sikkerhed, den letale virkning kan også tjene som en ideel metode til knock-in og generstatningsteknikker studier uden de associerede bivirkninger og skader af integration. DNA ministring vektorer kan blive anvendt til overførsel og ekspression af gener til terapeutiske proteiner, RNA, antistoffer eller antigener i et givet mål in vivo eller erstatte en fejl- eller ikke-funktionel allel. Den enkle ettrins varme-inducerbar in vivo-fremstilling system tillader DNA ministring vektorer til at let fremstilles til kliniske eller industrielle applikationer.

Disclosures

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Forfatterne takker naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC) til finansiering dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli W3NN Mediphage strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFP Mediphage parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244620
Fisher BioReagents Terrific Broth Fisher Scientific BP2468500
BD Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific 214010
Ampicilin MP Biomedicals LCC 2190147
Ultrapure Milipore Water Fisher Scientific  Z00Q0V0US Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System
Surgical Gloves VWR (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
30 ml KIMAX Test Tubes VWR 89001-448
Spectrophotometer Cuvette Sarstedt 67.74
Sterile 15 ml Falcon Tubes  BD Falcon 62406-200,
Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  FroggaBio 2930-S0
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml BD Falcon 13-675-20
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml BD Falcon 13-668-2 
Micropipettor (100-1,000 μl) FroggaBio C1000-1
Micropipettor (20-200 μl) FroggaBio C200-1
Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) VWR 89079-472 
Sterile Pipette Tips (1-200 μl) VWR 89079-460
Fisher Scientific Economy Burner Fisher Scientific 03-917Q
Incubator Shaker New Brunswick Scientific  M1352-00000
Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980125 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980250 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980500 Aldrich 
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 335901 Model: Genesys 10 Vis
Floor Centrifuge Beckman Coulter  369001 Model: Avanti J-E
Benchtop Centrifuge Beckman 362114 Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific  02-215-365
1 kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10, (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6, (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21, (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19, (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118, (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3, (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3, (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7, (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21, (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21, (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11, (1), 154 (2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272, (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9, (2), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats