Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

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Curry, F. R., Clark, J. F., Adamson, R. H. Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery. J. Vis. Exp. (103), e53210, doi:10.3791/53210 (2015).

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Abstract

개별적으로 관류 미세 혈관의 투과성 특성을 측정하는 실험은 배양 된 내피 세포의 단층 및 전체 미세 혈관 침대의 기능 교환 특성의 혈관 투과성을 조절하는 분자 및 세포 메커니즘을 조사 사이에 다리를 제공합니다. cannulate 랫트 장간막 세정맥의 미세 혈관을 관류 및 미세 혈관 벽의 수리 전도도를 측정하는 방법을 설명한다. 필요한 주요 장비는 세 가지 다른 microtools의 위치를​​ 미세 조작기를 지원하는 큰 수정 단계와 생체 내에 현미경 포함한다 : (1) 경 사진 유리 마이크로 피펫은 cannulate 및 미세 혈관을 관류하는 단계; (2) 유리 미세 occluder에가 일시적 혈류를 차단하고 측정 정수압에 transvascular 물 흐름 운동의 측정을 가능하게하고, (3) 무딘 유리로드는 삽관의 사이트에있는 장간막 조직을 안정화한다. 수정 된 랜디스 마이크로 클루 techniqUE는 다음과 같은 미세 혈관 걸쳐 실험 조건이 변경되는 흐름과 정압 및 콜로이드 삼투압 차이의 반복 측정이 신중하게 제어 가능하게 또한 transvascular 유체 운동의 마커로서 인공 관류에 현탁 적혈구를 사용하고. 먼저 테스트 관류와 같은 미세 혈관의 재 삽관 한 후, 제어 관류 액을 사용하여 수리 전도도의 측정이 잘 조절 된 조건 하에서 미세 혈관 응답의 비교를 페어링 가능하게한다. 혈관 투과성을 수정할 것으로 예상 유전자 변형 쥐의 장간막에서 미세 혈관에 방법을 확장하는 시도 때문에 마우스 장간막에 긴 직선과 분지 미세 혈관의 부재로 엄격하게 제한했지만, 비슷한 유전 적 변형과 쥐의 최근 가용성은 사용 CRISPR / Cas9 기술은 여기에 설명 된 방법을 적용 할 수있는 새로운 영역의 조사를 열 것으로 예상된다.

Introduction

혈관계에서 Microperfusion 보통 직경 미만 40 μm의 혈관에 마이크로 피펫을 통해 공지 된 조성물의 인공 관류 액의 흐름을 제어 확립하는 것을 수반한다. 관류 용기는 정상 조직 환경 내에서 유지되며 삽관시에 동물의 혈액 관류 업된다. 시츄 microperfusion 비디오 영상 또는 형광 기술 범위와 함께 사용하는 경우 이러한 흐름에 대한 구동력이 공지되어 있으며, 혈관벽의 투과성 특성이 될 수 조건에서 미세 혈관의 벽에 걸쳐 물과 용질 플로우의 측정을 가능하게 직접 평가. 또한, 조직의 미세 혈관 (관류 및 superfusate)을 둘러싸는 유체의 조성물을 제어함으로써, 미세 혈관 투과성과 교환 규제 E 다양한 노출되어 미세 혈관 벽을 형성하는 내피 세포를 활성화하여 조사 할 수있다xperimental 조건 시간을 정확하게 측정 기간 (시간에 초)에 대한 (작용제, 수정 관류 조건, 형광 지표 세포 내 구성과 신호를 측정). 또한, 배리어 조절 키 셀룰러 분자 구조의 미세 구조 또는 세포 화학적 평가는 투자율이 직접 측정되는 동일한 미세 혈관에 조사 될 수있다. 접근시켜 배양 된 내피 세포의 단층을 그대로 미세 혈관 내피 세포에서 조사 장벽 기능을 변경하는 세포와 분자 메커니즘 조사 간의 브릿지를 형성한다. 추가 평가 1-6에 대해 다음 리뷰를 참조하십시오.

microperfusion의 한계는 단지 얇은 투명하고 유리 마이크로 피펫으로 삽관을 활성화하기에 충분한 구조적 완전성을 미세 혈관 베드에서 사용될 수 있다는 것이다. 초기 조사는 장간막 얇은 피부 협심증 분에 개구리 미세 혈관을 사용하는 동안7,8 uscle 단연 포유 동물 모델에서 가장 널리 사용되는 제제는 쥐 장간막 9-15이다. 대부분의 조사는 1-4 시간의 기간 동안 공부 혈관 투과성의 급성 변화에 초점을 맞추고있다, 그러나 최근의 연구는 초기 관류 (12, 16) 이후 개별 선박에 대한 측정에 24 ~ 72 시간을 확장되었습니다. 이 통신에 설명 된 방법을 사용하도록 설정해야 혈관 투과성 조절 (17) 공부에 더 많은 유전자 변형 쥐 모델을 사용할 수 있도록 약속 최근에 개발 된 CRISPR 기술은 이러한 중요한 새로운 쥐 모델에서 장간막의 세정맥 미세 혈관에 적용 할 수 있습니다.

이 방법은 관류 배 가까이 용기와 관류 마이크로 피펫을 정렬 할 위치 microtools에 사용되는 동물의 준비와 적어도 세 개의 미세 조작기를 모두 보관 유지하는데 충분한 크기가 사용자 정의 내장 현미경 단계 장착 거꾸로 현미경이 필요합니다루멘. 예를 들어 XY 현미경 단계 (약 90 × 60cm)에 대한 사용자 지정 플랫폼은 녹 방지 코팅 1cm 두께의 강판으로 제조 할 수있다. 스테이지 엔지니어링 인덱스 테이블 또는 수평면에서 이동을 위해 테프론 기둥 또는 공 전송에 직각으로 장착되고 두지지 도브 - 테일 슬라이드에 부착된다. 전형적인 장비 (도 2 참조) 혈관 매끄러운 단일 혈관 혈류 및 헤마토크리트, 혈액 관류 된 미세 혈관 현지 산소 공급, 규제를 측정하는 등의 것과 같은 생체 내에 미세 실험의 범위에 사용되는 현미경 및 마이크로 위치 장비와 공통점을 갖는다 근육 긴장, 전체 순환 주입 형광 추적자의 미세 혈관 지방 축적. 18-26

기술의 기본 양태는 미세 혈관 벽의 한정된 면적 (S) 전체 유량 (J의 V)의 측정이다. 달성하기 위해이는 본원에 기재된 개질 랜디스 기법을 통해 간단한 거꾸로 현미경은 적절하다. 소형 비디오 카메라가 추가 시간베이스로, 비디오 모니터 상에 표시되고, 컴퓨터에 디지털 형태로 또는 비디오 레코더, 디지털 또는 아날로그 신호로서 어느 기록 화상 포트와 비디오 신호 상에 장착된다. 미세 혈관은 삽관되면 카메라에 가시적 미세 혈관의 부분은 삽관을 방해하지 않고 단위로 스테이지를 이동 및 조종에 의해 변경 될 수있다.

transvascular 플로우의 측정은, 예컨대 용질 투과성, 세포질 칼슘 또는 다른 셀룰러 메커니즘, 및 공 초점 영상 6,12,13 형광 비 모니터링의 측정을 위해 사용되는 유전 적절한 필터 정교한 형광 현미경을 사용하여 더 상세한 조사와 결합 될 수있다 27. 모든 microperfusion 접근법의 주요 장점은 동일한 용기에 반복 측정을 할 수있는 능력이다같은 수압과 oncotic 압력, 또는 염증 상태에 혈관 반응에 의한 변화로 힘을 구동 제어 변화에 따라. 가장 일반적인 디자인은 제 피펫 후, 기준선 투과 상태를 확립하기 위해 제 제어 관류 및 적혈구 현탁액으로 채워진 마이크로 피펫을 통해 관류 용기와 동일한 용기에 측정 수리 전도도 (L의 P)의 한 쌍의 비교이며 테스트 에이전트와 관류에 추가됩니다. 여러 삽관은 제어 피펫 재관류 후에 반복주기 가능하다.

본 프로토콜은 미세 혈관 벽에 걸쳐 물 플럭스를 기록 및 혈관벽의 L p를 그대로 걸쳐 물과 용질에 대한 공통 경로의 투자율의 유용한 지표를 측정하는 래트 장간막에서 세정맥 용기의 삽관과 microperfusion을 보여 내피 장벽. 절차의 변형 랜디스 techniq라고UE 때문에 28 보존 차단 관류 후 transvascular 유체 교환 수단으로 적혈구의 상대 이동을 사용하여 원래 랜디스 원리 있지만 실험 조건의 범위 (예를 들면, 미세 혈관 벽에 걸쳐 정압 알부민 oncotic 압력 차) microperfusion를 사용할 수는 uncannulated 혈액 관류 미세 혈관 8,29에서보다 훨씬 더 크다.

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Protocol

윤리 선언문 : 모든 절차를 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

마이크로 피펫, Restrainers 및 차단제 1. 예비 제작

  1. 인출 할 때, 관의 신장 된 부분은 길이가 약 1 cm이고, 두 반쪽 다소 대칭이며,되도록 조정 전자 풀러를 사용하여 절반의 여러 깨끗한 붕규산 유리 모세관 튜브를 당겨. . 테이퍼는 그림 1의 치수와 일치하는지 확인 가능한 Micropipette, restrainers 및 차단제 모두 절반을 사용합니다.
    1. 경사 물로 목욕을 0.5 μm의 연마 종이 공기 구동 연삭 휠 (30)을 사용하여 마이크로 피펫. 이 수평으로부터 약 30 °가되도록 마이크로 피펫 홀더의 각도를 설정.
    2. 철저하게 세척 및 팁을 통해 샤프트까지 깨끗한 아세톤을 끌어 흡입을 사용하여 마이크로 피펫을 건조. (Micropipette과 검사악어 클립 마이크로 피펫 홀더와 접안 렌즈 십자선 장착 4 × 40 × 목표에 작은 직립 현미경을 사용하여 그림 1A).
    3. 그 길이 / 너비 비율이 3.1 내지 3.5 및 장간막에서 힘든 콜라겐 섬유에 침투하는 데 도움이 급격하게 테이퍼 포인트 인 경사 약 50 μm의 긴 팁 개방과 선택 가능한 Micropipette.
    4. 먼지가없는 상자에 약간 다양한 크기의 15 ~ 20 마이크로 피펫을 저장합니다.
  2. 단계 1.1에서 준비 뽑아 모세관 튜브)를 사용하여 restrainers합니다. 무딘 끝 (그림 1B)를 형성하기 위해 microflame 근처에 간단하게 뽑아 유리 모세관 튜브를 잡고. 먼지가없는 상자에 여러 저장합니다.
  3. 단계 1.1에서 준비 뽑아 모세관 튜브)를 사용하여 microoccluders합니다. 구부리 부드럽게 microflame에서 뽑아 모세관 튜브를 잡고 (튜브 어댑터, 예를 사용하여., 23G) 미세 팁 (끝에서 약 4 mm)를 축으로 120도에 가까운 각도를 만들기 위해 (

2. 동물 준비 및 수술

  1. 펜토 바르 비탈 나트륨 남성 (3백50-4백50g) 또는 여성 흰쥐 (2백-3백그램)를 마취 (80 ~ 100 ㎎ / ㎏, 시그마 - 알드리치, P3761) 피하 주사를 통해; 복강 내 주사를 사용하지 않음으로써 장간막를 보호합니다.
  2. 수술 절차 및 실험 프로토콜을 통해, 필요에 따라 추가 주사 (30 ㎎ / ㎏)으로 마취를 유지한다. 발가락 핀치 또는 각막 반사에 의한 마취의 깊이를 결정합니다. 실험 절차의 종료 후, 펜토 바르 비탈 마취하에 과량 또는 포화 염화칼륨 심장 내 주사를 통해 쥐를 안락사.

3. 흐름 마커로 사용하기 위해 솔루션 및 적혈구 준비

  1. superfusate 및 제어 관류 용액 (일반적으로 포유류의 10 ㎎을 함유 링거액 / ㎖ 지방산에 대한 포유 동물 링거액을 준비자유 소 혈청 알부민, BSA).
    1. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 관류는 마이크로 피펫 팁을 차단할 수 있습니다 작은 입자를 제거하는 단계; 작은 깨끗한 용기에 필터링 할 수 있습니다.
  2. 0.05 ㎖의 헤파린 (1,000 U / ㎖)을 함유하는 작은 주사기에 20G 바늘로 마취 된 쥐의 꼬리 정맥으로부터 약 0.2 ㎖의 혈액을 드로잉하여 적혈구를 제조하고 약 14 mL의 포유류 링거액 용액을 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브로 이전 .
    1. 원심 분리기는 부드럽게 (7 분 동안 최대 200 ×의 G에 대한) 적혈구를 포장한다. 상층 액을 그려 링거액에서 적혈구를 다시 일시 중지합니다.
    2. 및 원심 분리 한 후 상층 액을 세 번 이상 사용되는 튜브의 하단에 충전 적혈구를 떠난다. 이 절차는 정상 수준 (31)의 0.1 % 미만으로 최종 관류 혈소판 감소합니다.

4. 동물의 조직을 정렬쟁반

  1. 칼 모양의 프로세스에 배꼽 아래에서 마취 된 쥐의 복부를 면도. 머리가 잘 조직에서 superfusate을 그릴 심지를 형성하지 않도록 면도 영역 (오른쪽에 배치 쥐에 대한) 오른쪽 주위에 확장되었는지 확인합니다. 젖은 거즈 패드 또는 티슈로 잘라 머리카락을 제거합니다.
    1. 무딘 톱니 모양의 집게로 피부를 잡고 튼튼한 가위를 사용하여 피부를 통해 중심선 절개 (2-3cm 길이)를 확인합니다. 벌금을 사용 (아이리스)가 위 창자 손상을 방지하기 위해 톱니 모양의 집게로 복부 벽을 해제, 원격 교육 알바를 통해 유사한 절개를합니다.
    2. 동물 트레이 옆에있는 동물로, 부드럽게 링거액과 무딘 톱니 모양의 집게에 적신 면봉 어플리케이터 (나무 막대기)를 사용하여 복강의 창자를 잡아 당깁니다. 장간막이 장간막에 손이 닿지 않도록주의하면서 현미경을 통해 (pote을보기 위해 기둥 위에 draped되도록 잘 조직의 장을 마련ntially 집게 또는면 중 하나와) 미세 혈관 손상.
      참고 : 동물 트레이 (그림 2A)는 플렉시 유리로 구성하고 광학적으로 투명 기둥 (약 3mm 깊이) (예를 들면, 광택 석영에게 약 2cm 직경과 5mm 높은.) 잘, 그리고 온난화 패드 조직을 필요로 할 수있다 동물의 체온을 유지하도록 조절. 필러의 두께는 대물 렌즈의 작동 거리를 초과하지 않아야한다.
  2. 장간막이 접안 렌즈를 통해 볼 수 있도록 현미경 무대에 동물 트레이를 배치합니다.
  3. 지속적으로 35-37 ° C에서 유지 포유류 링거액과 장간막을 superfuse하는 중력 공급 드립 라인을 배치합니다. 제자리에 장을 보유 수분을 유지하는 데 도움이, 표면에 묻은 링거액을 심지에 거즈 패드를 사용합니다. 유량을 조정하고 일관된 superfusate 두께를 유지하는 유출 물을 흡인.
  4. 있는 대상 세정맥 미세 혈관을 확인수렴 흐름 참 모세관 말단에 하나 또는 두 가지의 하류 분지 세그먼트. 분지 혈관을 찾기 (이상적으로, 길이 600 ~ 1,000 μm의) 활발한 혈액 순환과 혈관 벽에 부착 백혈구의 무료 데.
  5. 현미경 필드의 중앙에 테스트 미세 혈관을 놓고 선택 삽관 사이트에 가까운 위치로 제한 수단을 이동합니다.

5. 홀더에 마이크로 피펫과 산 채우기

  1. 그냥 cannulating 전에, 관류의 적혈구를 일시 중지합니다. 깨끗한 붕규산 시험관에 0.5 ml의 관류에 포장 적혈구의 7 μl를 추가합니다. 참고 : 1-3 %를 헤마토크릿이 사용될 수 있지만, 일관된 헤마토크리트가 적혈구로부터 방출 어떤 물질의 일관 관류 농도로 이어질 것이다.
  2. 23G 튜브 어댑터와 PE 50 튜브 (5~15cm 길이)와 1 ML의 주사기를 장착한다. 주사기로 관류 / 레드 세포 혼합물을 그립니다. 혼합 튜브에서 모든 거품을 추방하기 위해 주사기 전환 및어댑터. 그리고 실험이 시작되기 전에 몇 주사기에 효율성, 적합성 튜브를 들어 먼지가없는 상자 또는 비닐 봉투에 보관하십시오.
  3. 이 테이퍼 영역을 접촉 할 때까지 마이크로 피펫의 큰 끝으로 튜브를 진행하여 마이크로 피펫을 채 웁니다. 마이크로 피펫 팁을 채우기 위해 주사기 플런저에 부드러운 빠른 푸시을 적용합니다. 참고 : 작은 스트림 또는 물방울이 완료 충전을 증거 끝에서 볼 수 있어야합니다.
  4. 부드럽게 플런저를 미는 마이크로 피펫 샤프트의 넓은 부분을 채우는 동안 튜브를 철회. 조심스럽게 마이크로 피펫 샤프트를 쓸어 넘겨 넓은 축에 작은 기포를 제거합니다. 참고 : 유사한 절차 (32)를 설명하고있다.
  5. 물 압력계에 연속 유체 연결을 허용하는 측 포트와 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 놓습니다. 확인 마이크로 피펫의 매우 미세한 발전을 제어하기 위해 사용 유압 구동에 부착되는 홀더는, 약간의 각도에 있음 (15-25 °)수평에 마이크로 피펫의 테이퍼의 가장자리는 장 또는 트레이에 충돌하지 않도록.
  6. 시험 용기 (도 2)에 가까운 배향을 사용하는 x, y 및 z 드라이브가 이동 가능한 미세 조작기에 유압 구동 마운트.
  7. 약 40 CMH 2 O 상기 장간막에 압력계 물기둥 유체의 높이를 변경하기 위해 주사기 또는 물이 채워진 고무 전구를 이용한 마이크로 피펫 내의 유체에 가해지는 정수압을 조정한다.
  8. 피펫을 작성 후 가능한 빨리 미세 혈관을 Cannulate; 즉, 약 40 분 후 거의 적혈구가 용기에 유입 될 정도로 적혈구, 피펫의 바닥에 침전.

6. Microcannulation과 미세 혈관의 압력 측정

  1. 현미경으로 채워진 마이크로 피펫을 배치하기 전에 부드럽게 그립 조직을 충분한 힘을 가하여 미세 혈관 주변 조직에 제한 수단을 누르십시오. 그리기장간막 콜라겐 섬유의 응력 용기에 정렬되도록 약간 미세 혈관에 맞춰 조직을 스트레칭, 다시 제한 수단.
    1. 선박 마이크로 피펫을 맞추고 접안 렌즈를 통해보기에 내려 놓습니다. 선택 삽관 사이트의 상류 끝을 배치하고 부분적으로 혈관 내에서 흐름을 방해하도록 조직에 그것을 내려하지만 그것을 폐색하지 않습니다.
  2. 유압 구동을 이용하여 혈관 내강 내로 천천히 피펫 팁을 구동하여 용기 Cannulate. 용기의 아래쪽을 밀어하지 않도록주의하십시오.
    주 : 마이크로 피펫이 루멘 들어갈 때, 관류 급속 루멘에서 용기 내의 혈액을 세척 및 관류 자유롭게 하류 혈관 정상적인 혈액 관류의 일부를 변위시키는 시험 미세 혈관에 동물의 순환 말단으로 유입된다.
  3. 나타낸 바와 같이, (혈액까지 차압을 조정하여 관류 압을 낮출관류 세그먼트로 다시 그려집니다) 동물의 적혈구에 의해; 이는 적혈구 부드럽게 혈관 내강으로 진동 및 미세 혈관 세그먼트의 말단에 미세 혈관 정수압 압력 (P의 C)를 측정하는 압력의 균형을 결정한다. 이 균형 압력 위의 모든 압력에서 혈관 관류를 유지한다.

7. Microocclusion 및 데이터의 수집

  1. 선택적 단계 : 팁 반복 마이크로 동안 실험 용기를 보호 조직의 미세 패드가 축적되도록 멀리있는 용기로부터 장간막의 미사용 영역의 조직에 그것을 누르 혈관을 차단하는 미세 occluder에 사용하기 전에 폐색.
  2. 현미경 필드의 아래쪽 가장자리 근처 관류 용기 위의 차단기를 놓습니다.
  3. 비디오 및 오디오와 다음 사항을 기록합니다.
    1. 구두 블록 사이트의 위치와 접안 레티클에 표시되는 화면의 하부 가장자리를 기록한다.
    2. 팁바로 미세 혈관 위에 배치 차단제, 혈관의 흐름이 폐색 될 때까지 조심스럽게 차단을 낮추기 위해 미세 조작기의 미세 Z 컨트롤을 사용합니다. 오디오에 압력계의 압력 (P의 C)를 참고. 3-10 초 동안 일반적으로 폐쇄를 적용하고 무료 관류를 복원 놓습니다. 시간에 기초하여 5 내지 10 μm의 단계 (> 사이트에서 초기 블록 후에, 5 분), 폐색의 숫자 (3-5)에 피펫 팁을 향해 용기까지 블록 위치 이동 블록 부위에서 혈관 벽의 손상을 방지 할 .

데이터 및 L (P)의 측정 8. 분석 (물 침투성)

  1. 동영상 재생 중에 스테이지 마이크로 미터 화상에 공지 된 위치의 화상을 이용하여 폐쇄 부위에 마커 적혈구로부터 초기 거리 (ℓ 0)를 결정한다. 녹화 된 영상의 3-10 초 동안 여러 프레임에서의 위치에서 마커 셀의 초기 속도 (dℓ / DT)를 결정합니다. 저지내 폐색 (그림 3) 동안 촬영 한 이미지에서 용기 반경 (R).
  2. 계산 J의 V / S (dℓ / DT) × (1 / ℓ 0) × (R / 2) 각 폐쇄합니다. 운전 압력으로 나눈 값 (J의 V / S)와 같은 일정한 압력에서 패 P를 계산 (미세 혈관의 압력 - 효과적인 콜로이드 삼투압, 토론 참조).

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Representative Results

도 4는 네 관류로 차례로 삽관 미세 혈관 세정맥 래트에 L의 P의 변화를 시간 경과에 따라 측정의 결과를 도시한다. (33) 정압에서 산출 L (p)의 크기가 미세 혈관 벽의 투과성의 변화의 측정치로 사용하고, 제 용기를 10 nM의 Bk에 함유 초 마이크로 피펫 염증제의 브라 디 키닌 (Bk에)에 노출되었을 때 후 1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 관류 액으로 제어 상태. 브라 디 키닌은 이후 10 ~ 15 분에 걸쳐 제어 값으로 반환 패 P의 일시적인 증가가 발생했습니다. 용기를 안정한 기준선을 재설정하기 위해 30 분 동안 관류 제어 재 관류 하였다. 미세 혈관이 동일한 Bk의 농도뿐만 아니라, 관류 액을 1 μM 스핑 고신 -1- 포스페이트 (S1P)와 네번째 마이크로 피펫 관류 될 때, Bk에 대한 응답이 크게 약화시켰다. 의 정도S1P 및 Bk에 동시에 관류 감쇠 S1P는 Bk에 노출하기 전에 20 분으로 관류 업에 가하고 다른 실험에서 측정 된 것과 유사한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 하나의 용기에 L (p)의 다중 측정을 할 수있는의 위력을 발휘하고, 예컨대 소염제의 존재 혈관벽을 안정화 S1P 같은 약제의 작용은 시간 기간에로 해결 될 수 있음을 보여 몇 초 정도. 별도의 용기에서 대조군 연구는 Bk 개의 응답의 감쇠에 의한 아나필락시스 아니라고 보여 S1P의 부재하에 유사한 프로토콜을 수행 하였다.

일부 실험적인 디자인을 위해 그것은 거대 분자 (σ)와 L p 용 용질 반사 계수를 모두 평가하는 것이 중요하다. 이것은 각각의 미세 혈관에 여러 압력에서 J의 V를 측정하여 가장 좋은 수행 할 수 있습니다. 그림 5 실험을 보여줍니다 난N되는 L (p) 및 관류 5 % 알부민 유효 oncotic 압력 모두 (π 알부민 = 27 CMH, 37 ℃에서 2 O)를 래트 미세 혈관 주변 조직에는 알부민이 없을 때 조건 하에서 추정되었다. 이 실험의 J의 V IN / S는 세 가지 다른 압력에서 측정 하였다. L p를 J의 V / S와 압력 사이의 관계의 기울기이고, 가압 축의 절편이 용기 벽 (σΔπ) 전반 효과적인 oncotic 압력 차이이다.

그림 1
개별 미세 혈관의 관류 그림 1. Microtools. (A) 경 사진 팁 쥐 미세 혈관의 삽관을위한 마이크로 피펫. (B) 삽관의 사이트에 가까운 안정적인 장간막 조직을 유지하는 제한 수단. (C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
microperfusion 2. 생체 내에 장비를 그림. (A) 유리 기둥을 통해 지향 미세 조작기 및 microtools와 동물 트레이의 개요. (B) 큰 금속 단계는 엔지니어링 테이블과 지원 베어링에 장착. 미세 혈관의 microperfusion에 대한 위치 microtools와 (C) 마취 쥐. (D)보기를 닫습니다 실험 기간 동안 장간막의. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 다시.

그림 3
변성 랜디스 기술을 사용하여 단위 면적당 여과 속도의 측정도 3.이 개략도는 마이크로 피펫 및 용기 위에 위치 흡장 막대와 삽관 단일 미세 혈관을 나타낸다. 셀 궤적이 폐쇄 후 5 ~ 10 초 동안 추적 할 수 있도록 즉시 미세 혈관의 폐색 미세 혈관의 중심선 여행 마커 RBC 사이의 거리 (ℓ 0)과 폐쇄 부위를 폐색 후 기록한다. 초기 위치 (ℓ 0)와 셀의 초기 속도 (dℓ / DT)가 마커 셀 및 폐쇄 위치 사이에서 미세 혈관 벽의 단위 면적당 평균 여과 속도를 계산하는 데 사용된다. microoccluder는 상승, 추가 측정이되기 전에 무료 관류 설립.COM / 파일 / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 대표 데이터는 스핑 고신 -1- 포스페이트 (S1P) 억제가 매우 빠르게 작용하는 것을 보여 브라 디 키닌 (Bk에 10 nm의). 미세 혈관 패 P의 일시적인 증가가 발생했습니다. S1P 먼저 Bk에에 급성 Bk에 응답 상대를 억제 번째 브라 디 키닌 (Bk에) 테스트와 동시로 적용. 이러한 데이터는 시험 약제에 대한 노출 시간은 반응의 억제 활성의 동역학을 평가하기 위해 수정 될 수 있음을 보여준다. 특히, S1P는 Bk에 강하게 Bk의 반응을 억제 만에 동시 적용. S1P는 1 ㎛이었고, Bk에는 nm의. 10 살 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


V는 / 여러 압력에서 S는 모두 L (p) 및 유효 oncotic 압력있게 측정 J 그림 5. 측정 할. 여과 플럭스, J이 V / S는, BSA와 관류 (50 중 다양한 미세 혈관 정수압 압력에서이 용기 측정했다 밀리그램 ml의 - 1; 장간막이 단백질이없는 링거액과 함께 목욕을하는 동안 π = 27 CMH 2 O). J의 V / S와 압력 사이의 관계의 기울기 L (P)과 압력 축상의 절편이 혈관벽에 걸쳐 유효 oncotic 압력 차를 나타낸다. 이 실험에서 지단백은 1.2 × 10-7 (CM 초 -1 CMH 2 O를 -1)이고 σΔπ는 CMH 2 O (24)이었다 <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

용기가 자유로이 관류하면서 transvascular 유체 운동이 발생하더라도 L p를 계산의 세부 사항. 이러한 교환은 혈관 관류 속도의 0.01 % 미만이 일반적이기 때문에 프리 재관류 동안 측정하기에는 너무 작다. 관류는 일시적 미세 혈관, transvascular 흐름을 폐색하여 정지시하지만 (즉, 여과)에 도시 짧아 같이 마커 적혈구와 폐쇄 위치 사이의 유체의 열로 루멘 마커 적혈구의 이동으로부터 측정되는 도 3. 실험 프로토콜 길이가 600 내지 1,000 ㎛의 필요 분지 혈관의 복잡성 및 길이에 따라.

혈관 폐색되지 않고, 압력은 압력계 미세 혈관을 통해 흐름을 구동 할 때 자유 재관류 동안 그 미세 혈관 압력이 전형적이다 있도록 피펫 팁 걸친 압력 강하가 크다하류 압력보다 몇 CMH 2 0. 대조적으로, 교합시 피펫 걸친 압력 강하로 인해 유체가 서서히 혈관벽에 걸쳐 여과 액을 대체 혈관 내강을 입력으로 매우 작다. 따라서 폐쇄시 혈관 내강 (P ℃)에서의 수압은 압력계에 의한 세트 같다. 장간막 조직 oncotic 압력은 무시할 수 있으므로 정수압이 알려진 혈관 내강에 oncotic 압력 관류에 해당 세트 같다된다 즉시 폐색 후, 마커 적혈구 transvascular 유체 움직임이 측정된다. L (p)의 연속 측정으로, 용기 길이는 블록 위치가 전진 할 때마다 소실된다. 또한, 연속 recannulation 가능한 선박 길이를 줄일 수 있습니다.

용기 벽 (J의 V / S)의 단위 면적당 transvascular 유체 흐름 속도로부터 추정되는 microv 물의 열의 길이 측정마커 레드 셀과 폐쇄 부위 중 하나 짧아 (NET 여과) 또는도 길어 (그물 재 흡수) 사이 ESSEL 루멘. 가정은 혈관 내강의 중심선을 따라 이동 중성 부력 적혈구 세포 (물의 속도를 의미하는 적혈구 속도의 비율을 둘러싼 물 컬럼의 평균 속도를 추적하는 데 사용 6㎛의 1.8 부근 될 수 있다는 차단으로 μm의 / 초에 마커 셀 ()의 속도가 V의 μm의 / 초 폐쇄 후 처음 2-5 초 이상이며, 경우에 30 μm의 직경 용기에 적혈구). 8, 14 따라서 ​​선박 반경이다 R, 그 적혈구 폐색 (J의 V)의 부위 사이에 미세 혈관 벽에 걸쳐 여과 된 유체의 부피는 미세 혈관 가정 3 / 초 μm의 πr 2 V 원통형이다. ℓ 마커 셀 사이의 초기 거리이고 또한 그 마커 셀 및 폐쇄 부위 사이의 원통형 미세 혈관 (S)의 영역은,이다 2πrℓ및 폐쇄 부위. 따라서 물 압력계 VR / (2ℓ)에 의해 설정된 압력에 단위 면적 (J의 V / S) 당 평균 초기 transvascular 흐름.

관류의 oncotic 압력은 미세 혈관 압력 (전형적으로 3.6 CMH 2 O, 10 ㎎ / ㎖ 및 모세관의 농도로 소 혈청 알부민 oncotic 압력 낮은 대하여 설정되어있는 경우 혈관 L (p)의 간단한 추정이 이루어진다 압력보다 30 CMH 2 O). L (P)는 다음과 같이 계산된다 (J의 V / S) / (P C -3) cm / 초 / ㎠의 H 2 O 제어 상태에서 알부민의 반사 계수 (σ 알부민)이 0.9에 가까운이기 때문이다. 1 분 정도의 시간 해상도를 가진 L P는이 접근법 급속한 변화 / S도 4의 대표적인 결과에 도시 된 바와 같이 정압. 상기 접근 IG J V의 연속 측정 사이의 자유 유동을 형성함으로써 측정 할 수있다반사 계수가 0.5 이하로 떨어지면 CMH 2 O 1 미만으로 떨어질 알부민 oncotic 압력의 작은 변화를 nores하지만 P C가 O CMH 2 이상 30 때 L (p)의 추정 오차는 5 % 미만으로 유지 .

모두 L p와 반사 계수의 정확한 측정이 요구되는 경우, J이 V / S는 시험 고분자의 기대 유효 oncotic 미세 혈관 압력 이하의 압력의 시리즈에서 측정된다. 가압 축에 J의 V / S 및 압력 측정 L p와 절편과의 관계의 기울기는 제로 넷 유동 측정 σπ (도 5) 인 경우. Jv를 선형 압력 관련된 데모 oncotic 압력 차가 정압 프레스에 비해 낮은 경우에도 상술 한 간단한 프로토콜을 사용하여 하나의 압력 측정치의 사용의 중요한 검증 (도 4) 인URE.

오류의 가능한 소스. 정확한 측정을 손상 몇 가지 문제가 있습니다. 제대로 때문에 transvascular 교환 빠르게보다 폐쇄 부위를 향해 유체 폐쇄 부위 지난 누출, 마커 세포의 이동에 폐쇄 부위 결과에서 혈관 벽에 혈관 손상을 폐색하지 않으면. 마커 세포는 정상적으로 폐쇄 부위를 향해 서서히 이동하지만, 도달하지 않는 반면 마커 세포 occluder에 모든 방법을 추적 할 경우, 누수가 표시된다. 반면에, 오류가 삽관 부위에 미세 혈관 내강 내로 피펫을 밀봉하도록 J의 V / S의 과소 평가 결과. superfusate 또는 삽관 부위의 상류에서 혈관 내강을 피펫 유체 누출 피펫 팁을 가로 질러 상당한 압력 강하를 야기한다. 이러한 누출이 검출 될 때 하류 용기 LU에 비해​​ 더 높은 속도에서의 마이크로 피펫 선단 유동 세포폐색 된 혈관의 남자입니다. 마이크로 피펫의주의 재배치는 일반적으로 누출을 밀봉. 용기 벽의 L (P)가, 균일하지 않은 보통 국부적 손상 또는 염증의 하나 이상의 부위로 갖는 경우, 다른 문제가 발생한다. 가장 transvascular 흐름이 집중되는 경우가 마커 셀 사이트 추적. 적혈구 이동은 여전히 transvascular 흐름을 측정하지만, 측정 된 J는 V / S는 시험 세그먼트 내의 벽 면적의 대부분을 대표하지 않다.

기존의 방법에 대한 방법의 중요성. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법은 내피 장벽 투과성 transvascular 교환의 규제를 조사한다 (1) 시험 관내 배양 된 내피 세포 단층 및 트레이서 축적 (2) 측정에 걸쳐 교환 측정 트레이서 후의 조직 샘플은 전체 동물에 정맥 내 주사한다. 배양 된 내피 세포 단층의 실험은 f를하고 있습니다세포 기능을보다 직접적으로 변형 될 수 있고, 혈관 내피 세포에서 분자 사건의 상세한 평가를위한 충분한 세포 물질이 있으므로 avored. 그러나 대부분의 배양 조건하에 내피 세포는 일반적으로 생체 내 혈관 투과성의 배리어 대표를 형성하지 않는다. 상기 개질 랜디스 기술은 그대로 세정맥의 미세 혈관의 내피 세포 장벽 기능의 조절을 조사하기 위해 견고하고 안정적​​인 기술로 입증되었다. 숙련 된 연구자의 ​​손에 세포 배양에 사용되는 방법 중 일부 (예를 들면, 세포 성분의 촬상은, 신호 전달 경로의 변경)이 적용될 수 제어 및 시험 조건에서의 투과율 측정을 페어링. 미세 혈관 손상에 실험의 중요성은 개별적으로 관류 microve 장벽 투과성을 조절 메커니즘 사이에 유의 한 차이를 보임으로써 입증되었다ssels 그 종종 배양 내피 단일 층에 설명. 예를 들면 전단에 대한 응답, 트롬빈 노출, 염증 갭 형성 2-6,9,16에 수축 메커니즘의 기여를 포함한다. 그대로 혈관 침대에서 추적 축적의 측정 또는 증가없이 더 정상적인 생리 기능을하지만 추적 축적이 증가 관류 (교환을위한 증가 된 표면적)의 결과로 증가 할 수 있기 때문에 손상된 혈관 투과성의 실제 변화의 직접 조사를 보존 벽의 투과성. 혈관 확장은 혈관 관류의 수를 증가시킴으로써 전체 용질 축적 형 (34) 혈관 투과성 증가로 인한 것보다 큰 경우에 따라서 투자율의 증가 정도는 과대 평가 될 수있다.

미래의 애플리케이션은. 옵션 범위 INDI의 투과도와 동일한 조건 하에서 세포의 구조와 기능을 수정할microperfusion가 증가 할 것으로 예상된다 개 별 중에 용기가 직접 측정된다. 또한 그것은 유전자 변형 쥐 장간막의 방법의 응용 프로그램이 유전자 변형 쥐를 위해 존재하고 장기적인 문제를 해결할 수 있습니다 것으로 예상된다. 유전자 변형 마우스는 유효하게 될 때 구체적으로는 microperfusion 그들의 장간막 혈관의 미세 혈관을 조사하기 위해 확장 될 수 있다고 예상 하였다. 일부 microperfusion 실험 마우스 장간막 (35)의 미세 혈관 내에 완료되었지만, 마우스는 일반적으로 쥐보다 그들의 장간막 조직에 적은 미세 혈관을 가지고, 더 적합한 이상 (> 500 μm의) 직 혈관을 반대로 이들 혈관은 종종 짧고 고도로 분지되었는지 래트에서 찾을 수있다. 유전자 생쥐는 34 마일 또는 기술적 요구하지만, 더 안정적인 추적 실험 조치로 분석에 의존에 따라서 실험은 transvascular 교환의 변조를 조사하기 위해혈관 및 방사성 동위 원소를 테스트 프로브 (36)의 형광의 혈관 외 축적 모두의 변화.

방법의 수정. 위의 프로토콜에서, 관류 구성의 변화는 마이크로 피펫의 변화를 요구했다. 대체 접근법은 리필 장치를 이용하여 반응계에 마이크로 피펫을 보충하는 것이다. 상세 37에 기재된 바와 같이이 과정을 완성하기에 이르렀다. 제한 피펫 대체함으로써 달성으로 피펫에 관류 액의 조성물을 변경하는 시간이 빠르게는 아니지만, 장시간 미세 혈관을 관류하는 데 필요한 경우 절차에 특히 유용하다.

투과 계수를 측정하기 위해 확장 될 수있는 접근은 동일한 microperfusion 용질 31,38-40 형광 라벨링한다. 이 경우 하나의 마이크로 피펫을 피펫 질주 41 배 총신 (세타)에 의해 교체되고, 상기 용기는 관류교대 시험 형광 용질과 콘텐츠를 루멘 조직 축적 대하여 측정 한 형광 용질없이 동일한 조직 관류는 지워지고 용질의 축적을 반복 측정하도록. transvascular 물 흐름의 측정은 형광 표지 된 테스트 용질을 사용 용질 투과 계수의 측정과 결합 될 때, 세포 조성물, 또는 세포 성분의 공 초점 화상의 형광 표시기는, 더 정교한 컴퓨터 제어 형광 현미경이 필요하다. 이 조사는 일반적으로 높은 배율과 훨씬 짧은 작동 거리와 렌즈를 필요로하기 때문에, 장간막을 보유하는 데 사용되는 석영 기둥은 조직 잘에 현미경 용지함에 플렉시 글라스 지원에 붙어 유리 커버 슬립으로 대체됩니다. 3 차원 프린터의 증가 가용성, 큰 diamete를 배치하는 데 필요한 좁은 허용 오차를 충족 사용자 정의 트레이, 높은 정밀도 제조를 허용한다선택 미세 혈관에 짧은 작동 거리 상대적으로 R 렌즈.

장간막에서 사용할 수있는 미세 혈관의 가용성은 나이, 성별, 그리고 변형에 따라 달라집니다. 따라서, 쥐의 변형 및 특정 질문에 달려 남성 또는 여성의 사용의 선택은 해결된다. 최근의 많은 연구를 위해 우리는 우리가 일반적으로 사용 가능한 긴 직선 장간막의 미세 혈관을 찾을 수있는 시간에 나이 3 ~ 4 개월에 사용하기 전에 1 주일 이상 우리의 동물 시설에 적응되어 수컷 흰쥐를 사용 하였다. 대조적으로, 우리의 동료가 성공적으로 2~3개월 13 세의 여성 흰쥐를 사용 하였다.

적혈구의 역할. 전술 한 바와 같이, 적혈구의 주요 역할은 셀이 미세 혈관이 폐색 된 후에 물 중성 부력 지표 흐름, 불활성 행동 가정 물의 이동을 추적하기 위해 transvascular이었다. 이 기본적인 역할에 더하여, 그것을지금 적혈구가 존재 31,42,43에서 알부민 때 관류에 S1P를 공급함으로써 장벽의 안정성에 기여하는 것으로 인식되고있다. 이러한 관찰의 여러 가지 중요한 의미가있다. 적혈구 또는 다른 불활성 흐름 마커의 사용에 없을 기준선 투자율 덜 안정한 것으로 예상된다. 그것은 S1P의 측정 microperfusion 실험에 사용 된 모든 관류에 할 것을 권장합니다.

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Acknowledgments

이 작품은 건강 보조금 HL44485과 HL28607의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Olympus CK-40 try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Leica DMIL try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example Nikon Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel welding shop this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides Velmex AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example Pulnix TM-7CN (no longer available) no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3) Prior/Stoelting (no longer available) look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way FHC 50-12-1C need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive  FHC 50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way Siskiyou Corporation MX610 (1-way) or MX630 (3-way) great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders Siskiyou Corporation MXC-2.5, MXB etc.
pin vise Starrett 162C to hold restrainer
pipette holder World Prescision Instruments MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall Quartz Scientific Inc. custom  (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well NuSil MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W Cole Parmer EW-03125-20 heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC Cole Parmer EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out Cole Parmer EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller Sutter Instrument Company P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing Sutter Instrument Company B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II RX Honing Machine Corporation MAC-10700 Rx System II Machine alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
   with ceramic sharpening disc RX Honing Machine Corporation use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um 3M part no. 051144 80827 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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