واصفا تنظيم النسخ عامل تابع للالرنا الميكروي Transcriptome على

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rozovski, U., Hazan-Halevy, I., Calin, G., Harris, D., Li, P., Liu, Z., Keating, M. J., Estrov, Z. Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome. J. Vis. Exp. (112), e53300, doi:10.3791/53300 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في حين تم دراسة تنظيم النسخ من البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع، لا يعرف إلا القليل عن الكيفية التي تشارك عوامل النسخ في النسخ من الرنا غير الترميز، وتحديدا من microRNAs. هنا، نقترح استراتيجية لدراسة الدور المحتمل للعامل النسخ في تنظيم النسخ من microRNAs باستخدام البيانات المتاحة علنا ​​والموارد الحاسوبية والبيانات إنتاجية عالية. نحن نستخدم التوقيع جينية H3K4me3 لتحديد المروجين الرنا الميكروي والكروماتين مناعي (رقاقة) البيانات -sequencing من مشروع ترميز لتحديد المروجين الرنا الميكروي التي المخصب مع مواقع عامل النسخ ملزمة. قبل transfecting الخلايا في المصالح مع shRNA استهداف عامل النسخ من الفائدة وتعريض الخلايا لالرنا الميكروي مجموعة، ونحن ندرس تأثير هذا العامل النسخ على Transcriptome على الرنا الميكروي. كمثال توضيحي نستخدم دراستنا حول تأثير STAT3 على Transcriptome على الرنا الميكروي من لاي المزمنسرطان الدم mphocytic (CLL) الخلايا.

Introduction

الرنا الميكروية هي الذاتية الرنا التنظيمية غير الترميز الصغيرة التي تعمل عادة المنظمين سلبية التعبير مرنا على مستوى posttranscriptional. ما يقرب من 1000 غير الترميز 20-25 النوكليوتيدات توجد الرنا الميكروية طويلة في الجينوم البشري 1،2. الرنا الميكروية تنظيم التعبير الجيني من خلال قاعدة الاقتران الكنسي بين تسلسل البذور من الرنا الميكروي ومكملة تسلسل مباراة بذوره، والذي يقع عادة في المنطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من من mRNAs الهدف. بشكل جماعي، الرنا الميكروية تنظم أكثر من 30٪ من البروتين ترميز الجينات ولكن لا يعرف سوى القليل عن النسخ من الحمض النووي من microRNAs. فقد قيل أن تنظيم الرنا الميكروي النسخ مماثلة لتلك التي من مرنا 4،5. على وجه الخصوص، على غرار نشاطها في تعزيز نسخ من جينات ترميز البروتين، ويعتقد أن عوامل النسخ لتفعيل النسخ من microRNAs 6. النسخ عامل متم الإبلاغ عن icroRNA التفاعل كعامل المغير في التعبير الجيني ويمكن أن تشكل أيضا تغذية راجعة وحلقات التغذية إلى الأمام. على سبيل المثال، ذكرت Yamakuchi آخرون حلقة التغذية المرتدة التي البروتين p53 الحث على التعبير عن microRNA34a، وهذا بدوره يحول دون ترجمة سرت البروتين p53 كاظمة وبالتالي زيادة نشاط البروتين p53 8.

في حين تم الإبلاغ عن أمثلة محددة من عامل النسخ التعبير يعتمد من microRNAs، وهي طريقة مقبولة الذي يقدم معلومات عن كيف يمكن لعامل النسخ التي تهم ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على غير متوفرة. والغرض من هذا البروتوكول المقترح هنا هو تقديم وصف في عمق النسخ التي تعتمد على عامل تنظيم الرنا الميكروي-Transcriptome على. من خلال الجمع بين البيانات المتاحة علنا، وأدوات المعلوماتية الحيوية واستخدام تكنولوجيا متطورة، فإن الباحثين الذين يتابعون هذه الخوارزمية تكون قادرة على التقاط على نطاق الجينوم كيف يمكن لأيعامل النسخ في أي نوع من الخلايا في المصالح ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على ولاستكشاف مساهمة المفترضة من النسخ عامل مرنا في تنظيم التعبير الرنا الميكروي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد النسخ عامل مواقع الربط في المروج من الجينات الرنا الميكروي عن طريق نهج استخراج البيانات

  1. استخدام جامعة كاليفورنيا سانتا كروز (UCSC) متصفح الجينوم لاستخراج لونين البيانات مناعي (رقاقة) تسلسل ولدت كجزء من موسوعة مشروع عنصر الحمض النووي (ترميز).
    1. فتح متصفح الجدول في متصفح الجينوم UCSC.
    2. استخدام المواصفات التالية لاستخراج الجدول: كليد: (الثدييات)، الجينوم: (الإنسان)، الجمعية: (Feb2009 (GRch37 / hg18))، مجموعة: (التنظيم)، المسار (TxnFactorChIP)، الجدول: (weEncoderesTFbsCo7steredv3)، والمنطقة : (الجينوم)، تنسيق الإخراج (كل الجينات من الجدول المحدد).
    3. حفظ الإخراج من 1.1.2 كملف .txt وفي جدول بيانات.
    4. ترتيب وتصفية للعامل النسخ من الفائدة (على سبيل المثال، STAT2).
  2. استخدام قائمة المروجين الرنا الميكروي على أساس H3K4me3 علم التخلق التوقيع متاحة في Baeer وآخرون. 9
  3. لمطابقة وفقا للإحداثيات على الجينوم البشري، خريطة البيانات من 1.1 و 1.2 (على سبيل المثال، STAT3 ملزمة على المروجين الرنا الميكروي المفترض) وتحديد متوسط ​​ملزمة تقارب باستخدام قانون مكتوب في C حاد على النحو المبين في تكميلية ملف 1 الترميز.

2. استخدام shRNA إلى أسفل تنظيم التعبير من النسخ عامل الاهتمام

  1. لوحة 1.5 × 10 6 خلايا من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية في 10 سم لوحة في حوالي 50٪ التقاء (DMEM مع FBS 10٪).
  2. خلايا Transfect من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية مع 5 ميكروغرام من الخضراء الفيروسة البطيئة البروتين مضان (GFP) التي تحتوي على shRNA موجهة إلى عامل النسخ من الفائدة ومع 5 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف باستخدام كاشف ترنسفكأيشن لخلايا ملتصقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. كعنصر تحكم، transfect الخلايا من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية معتدافعت shRNA وناقلات التعبئة والتغليف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. حافظ على مزيج ترنسفكأيشن على الخلايا لمدة 16 ساعة (عند 37 درجة مئوية، CO 2 حاضنة)، ثم تغيير وسائل الإعلام إلى 10 مل الطازجة 10٪ DMEM وسائل الاعلام مع FBS 10٪.
  5. الانتظار لمدة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، الطرد المركزي ثقافة خلية (300 x ج، 5 دقائق) وجمع طاف المعدية. تصفية طاف من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون (25 ملم السطحي السليلوز الحرة خلات غشاء) لإزالة أي خلايا العائمة.
  6. تركيز طاف وجمع الفيروسة البطيئة باستخدام جهاز فلتر ultracentrifugal مع عتبة 100 كيلو دالتون. وكان 60 دقيقة حتى حجم التركيز إلى أقل من 250 ميكرولتر - تدور في 950 x ج لمدة 30 عاما. تخزين الفيروس تتركز في -80 درجة مئوية.
  7. Transfect الخلايا مع الفيروسة البطيئة. إزالة الفيروسة البطيئة المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. نقل 100 ميكرولتر من طاف الفيروسي إلى الطازجة 1.5 مل microfuge أنبوب.
    1. برينز يصل حجم في أنبوب إلى 1 مل مع انخفاض المتوسطة المصل. إضافة بروميد hexadimethrine إلى 1 مل تعليق الفيروس لتركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل، المزيج بلطف والسماح للخليط الوقوف لمدة 5 دقائق.
  8. الطرد المركزي 5 × 10 6 خلايا لكل التنبيغ وبلطف resuspend الكرية خلية في 0.5 مل من وسائل الاعلام التي تحتوي على الفيروس. السماح للخلايا البقاء في الحاضنة لمدة 4-24 ساعة، ثم يضاف 0.5 مل من المتوسط ​​مع 20٪ FBS إلى تركيز النهائي من 10٪ FBS.
  9. الانتظار لمدة 48 إلى 72 ساعة وصمة عار على الخلايا مع يوديد propidium (PI) وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حماية الخلايا من الضوء واستخدام فارز FACS لقياس معدلات GFP + / PI - الخلايا. منذ البقع PI الخلايا الميتة فقط، هذا المعدل هو تقدير الكفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا الحية.
  10. فرز السكان الخلية إيجابي في التعبير GFP (GFP +) من قبل FACS فارز كما هو موضح سابقا (10).
  11. استخدام نمط غربي آسيالنشاف المناعة آكانيوز كما هو موضح سابقا 10 لتحديد مستويات عامل النسخ من الفائدة قبل وبعد اصابة الخلايا من الفائدة (على سبيل المثال، خلايا CLL) مع shRNA المعينة.

3. تحديد مستوى التعبير من الرنا الميكروي Transcriptome على في خلايا Transfected مع النسخ عامل-shRNA

  1. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تسمية الحمض النووي الريبي وهجن إلى الرنا الميكروي ميكروأري 11.
  3. تحديد الرنا الميكروي وأعرب تفاضلي في الخلايا transfected مع النسخ عامل shRNA أو مع وجود ضوابط ناقلات الفارغة 5.
  4. تحقق من صحة النتائج ميكروأري لالرنا الميكروية أكثر أعرب تفاضلي في الوقت الحقيقي باستخدام PCR 5.

4. تحديد التداخل بين المعلومات البيولوجية والنهج shRNA في وصف Transcriptome على المعالين النسخ عامل

  1. لديتفرو القاقم النسب المتوقعة والمرصودة للجينات الرنا الميكروي التي تأوي عامل النسخ المواقع في المروجين تجليدها وكانت downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected، قم بما يلي:
    1. الحصول على نسبة من الجينات التي تأوي عامل النسخ من الفائدة في المروج / مجموع الرنا الميكروي الخاصة بهم من قائمة التي تم إنشاؤها في 1.3. هذه القائمة هي النسبة المتوقعة (على سبيل المثال، جينات الرنا الميكروي مع مواقع STAT3 ملزمة / مجموع جينات الرنا الميكروي اختبار = 0.25).
    2. تحديد عدد من الجينات التي تم downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected من قائمة التي تم إنشاؤها في 3.3 ويوجد عامل النسخ من مواقع مصلحة ملزمة من قائمة التي تم إنشاؤها في 1.3. هذا الرقم / العدد الكلي للجينات downregulated هو النسبة المرصودة (على سبيل المثال، جينات الرنا الميكروي مع STAT3 مواقع الربط / عدد من microRNAs downregulated = 0.6).
    استخدام χ2 إحصاءات مقارنة نسب احظ ويتوقع التي تم إنشاؤها أعلاه وتحديد ما إذا كان يتم إثراء قائمة من الجينات التي تم downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected مع مواقع عامل النسخ ملزمة في المروج لها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

STAT3 هو عامل النسخ الذي يدفع عادة نسخ من الجينات التي لديها لمكافحة أفكارك والآثار التكاثري 12. سواء STAT3 تؤثر أيضا على غير الترميز Transcriptome على RNA غير معروف حاليا. في جميع الخلايا CLL STAT3 غير فسفرته جوهري على سيرين 707 بقايا 10،13. المكوكات Phosphoserine STAT3 إلى النواة، يربط الحمض النووي، وينشط الجينات المعروف أن تفعيلها من خلال التيروزين pSTAT3 في أنواع الخلايا الأخرى 10. لأنه يتميز CLL من رفع القيود العالمي لشبكة الرنا الميكروي 14، ونحن افترضنا أن وجود سيرين pSTAT3 يؤثر على التعبير من microRNAs في الخلايا CLL.

لاختبار هذه الفرضية المروجين من microRNAs التي تأوي كانت مواقع الربط STAT3 الكشف عن هويته. عن طريق عبور البيانات التي تم إنشاؤها من قبل باير وآخرون. 9 من المناطق مع هيستون modifi H2K4me3الموجبة التي تميز مواقع المروج، مع STAT3 المواقع التي تم تحديدها من قبل رقاقة وما يليها تجربة 15 ملزمة، وقد تم تحديد مواقع الربط STAT3 المفترضة. باستخدام هذا النهج تم الكشف عن 160 المروجين المفترض في ما يقرب من 25٪ من الجينات الرنا الميكروي فحص (N = 200) مع عشرات ملزمة تتراوح بين 100 (أقل درجة) إلى 1000 (أعلى درجة) (الجدول 1).

و transfected الخلايا في وقت لاحق CLL مع STAT3-shRNA أو مع ناقلات فارغة واستخدام الرنا الميكروي مجموعة وحددت 63 الرنا الميكروية التي تم أسفل ينظم بعد ترنسفكأيشن (الشكل 1) مما يشير إلى أن STAT3 تشجع على نسخ من هذه الرنا الميكروية. 60٪ من الجينات الرنا الميكروي downregulated 63 (ن = 38) البيانات الشذرة وما يليها أكد STAT3 ملزمة في المروج المفترض المنبع من موقع الجين، أكثر بكثير مما كان متوقعا بالصدفة (ع <0.0001). تسعة الرنا الميكروية التي تم تنظيمها لأسفل بعد ترنسفكأيشن،مما يشير إلى أن STAT3 تنظيم سلبا مستوياته من النسخ.

شكل 1
الشكل 1. ترنسفكأيشن من خلايا CLL مع STAT3-shRNA يقلل من مستويات التعبير عن بروتين STAT3 وSTAT3 مرنا. ج: بعد ترنسفكأيشن من خلايا CLL مع مستويات STAT3-shRNA من STAT3 مرنا (اللوحة اليسرى، الكشف عنها بواسطة الكمي RT-PCR) ومستويات البروتين STAT3 (اللوحة اليمنى، الكشف عنها بواسطة immunoblotting الغربي) انخفضت بشكل ملحوظ ب: الرنا الميكروي مجموعة من CLL خلايا صورت 23 الرنا الميكروية التي تختلف بشكل كبير بين الخلايا CLL transfected مع STAT3-shRNA والخلايا CLL transfected مع ناقلات فارغة التعبير. واعتبرت قيمة P أقل من 0.01 إحصائيا كبيرا C: متوسط ​​كمية من التعبير RT-PCR من 7 الرنا الميكروية الذي كان التعبير التفاضلي بعد العلاج STAT3-shRNA باستخدامالرنا الميكروي مجموعة. الحانات تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التكميلي ملف الترميز 1. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

مير 1537
الجينات الحمض النووي الريبي الصغيرة كروموسوم إحداثيات المروج بداية إحداثيات نهاية المروج متوسط ​​(المدى) STAT3 النتيجة ملزمة *
مير 1205، مير 1206، مير 1207 8 q24.21 128961454 128962791 1000 (1000-1000)
1 q42.3 236045425 236047415 1000 (1000-1000)
مير-21 17 q23.1 57901872 57921277 1000 (112-1000)
مير 3124 1 Q44 249115404 249123965 1000 (1000-1000)
مير-451 17q11.2 27222251 27224114 1000 (1000-1000)
مير 92B 1 Q22 155162340 155168439 1000 (1000-1000)
مير 3197 21 q22.2 42537544 42543023 943 (943-943)
مير-646 20 q13.33 58712550 58715320 789 (789-789)
مير 629 15 Q23 70383751 70394586 773 (661-885)
مير 30E، مير 30C-1 1 p34.2 41173077 41177703 759 (759-759)
مير 3125 2 p24.3 12855381 12862915 756 (756-756)
مير 3145 6 q23.3 138776942 138779365 743 (487-1000)
مير-645 20 q13.13 49199911 49201187 743 (743-743)
مير 1256 1 p36.12 21346830 21350211 725 (725-725)
مير-619 12 q24.11 109248263 109253306 719 (719-719)
مير 181a-2، مير 181b-2 9 q33.3 127418928 127426139 710 (710-710)
مير-29A، 29B مير-1 7 q32.3 130583383 130597803 697 (482-1000)
مير-202 10 q26.3 135069499 135077337 696 (393-1000)
مير 3142، مير 146A 5 Q34 159890882 159899475 671 (671-671)
مير 548c 12 q14.2 65000968 65011503 660 (660-660)
مير-630 15 q24.1 72764289 72769197 627 (255-1000)
مير 135B 1 q32.1 205416952 205452990 622 (245-1000)
مير 29C، مير 29B-2 1 q32.2 207991044 208002382 608 (608-608)
مير 1825 20 q11.21 30791020 30798310 604 (209-1000)
مير 548h-1 14 q23.2 64578834 64581657 587 (174-1000)
مير 612 11 q13.1 65183633 65198528 581 (157-1000)
مير 148b 12 q13.13 54717640 54721204 578 (578-578)
مير 3174 15 q26.1 90543381 90549092 576 (152-1000)
let7a-3، let7b 22 46480680 46481826 573 (146-1000)
مير 1255a 4 Q24 102263848 102272541 557 (557-557)

الجدول 1. المروجين المزعومين الرنا الميكروي مع مواقع الربط STAT3. وينص البروتوكول طريقة لتحديد عامل النسخ ملزمة على المروجين المفترض من microRNAs باستخدام استخراج البيانات من البيانات المنشورة. وكمثال على ذلك، فإننا نقدم هنا الجدول الذي يصور الربط من STAT3 لمروجي الرنا الميكروي المفترضة. وتعطى النتيجة ملزمة في 0 إلى 1000 نطاق من البيانات يليها الجينوم الشذرة كلها نشرت كجزء من مشروع ترميز 15. يتم تحديد المروجين من خلال وجود توقيع جينية H3K4me3 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تمت دراسة الآلية الكامنة وراء RNA البلمرة ثانيا: النسخ يعتمد على البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع. في حين أن هذه العناصر تشكل سوى 1٪ - 2٪ من الجينوم البشري، والأدلة من مشروع ترميز تشير إلى أن أكثر من 80٪ من الجينوم البشري قد تخضع النسخ 17 وما ينظم النسخ من عناصر الحمض النووي غير الترميز لا يزال غير معروف إلى حد كبير 6 .

العديد من الدراسات، التي أشارت إلى أن بول الثاني هو مسؤول أيضا عن نسخ من بعض الجينات الترميز غير البروتين، بما في ذلك الرنا الميكروية أدت بنا إلى وضع استراتيجية تجمع البيانات من الموارد المتاحة علنا، الخوارزميات الحسابية وفي الدراسات المختبرية إلى فك القدرة وظيفة عامل النسخ من الاهتمام في تنظيم النسخ من microRNAs. الاستراتيجية المقترحة في هذه الوثيقة تتضمن 2 الخطوات الحاسمة. لأول مرة نستخدم البيانات المتاحة علنا ​​لتحديد عامل النسخ بinding في المروجين الرنا الميكروي. تحقيقا لهذه الغاية نستخدم البيانات رقاقة وما يليها نشرت من قبل اتحاد ترميز لتحديد عامل النسخ ملزمة وتوقيع جينية أن يجسد المروج باعتباره علامة غير مباشرة من الرنا الميكروي-المروجين. عبور الإحداثيات الوراثية من هذه المجموعات يوفر تقدير الإجمالي لكيفية متكررة عامل النسخ من الاهتمام بربط الرنا الميكروي-المروج. الثانية باستخدام التكنولوجيا shRNA لإسكات التعبير عن عامل النسخ وتعريض الخلايا لالرنا الميكروي مصفوفة، فمن الممكن لاستكشاف أهمية وظيفية من عامل النسخ على الرنا الميكروي-Transcriptome على.

ويفسر التباين في التعبير الرنا الميكروي جزئيا فقط عن طريق التنظيم يعتمد عامل النسخ. تقلب القياس المتكافئ وغيرها من العوامل الخلوية أو خارج الخلية تلعب دورا هاما ولم يتم محاكاة في الخوارزمية المقترحة. وتشمل القيود الأخرى ما يلي: تحليل المروج على أساس H3K4me3وقد تم التوقيع على 939 الرنا الميكروية المشروح. ومنذ ذلك الحين تم تحديد المواقع الجينومية من العديد من الرنا الميكروية. ومع ذلك لعلمنا قائمة أشمل يقوم على قاعدة بيانات محدثة لم تنشر بعد. من الجينات الرنا الميكروي 939، تم التعرف على H3K4me3 الذي يعتبر نموذجا للمنطقة المروج في 781 جينات الرنا الميكروي (83٪). وبالتالي، في حين يستند هذا التحليل بشكل واضح على بيانات ناقصة أنه يجسد جزءا كبيرا من الرنا الميكروي-Transcriptome على.

وعلاوة على ذلك، وعلم التخلق توقيع في جزء مطبوع وفي جزء الخلية محددة. لذلك، قد يتم التشكيك في generability من المروجين المفترضة التي تم تعريفها من قبل علامات علم التخلق. لأن H3K4me3 استمرت مستقلة عن النسخ 18 ويعتبر عموما علامة من المروجين مطبوع. وبالتالي فإن خوارزمية التحليلية التي نقترحها هنا قد يغيب المروجين الرنا الميكروي خلية محددة إذا تم تحديد هذه المروجين في الخلوي مختلفةاكتب. وأخيرا، يجب أن يتم اختبار أي استنتاج، وأكد تجريبيا. ومن الجدير بالذكر أن العلاقة بين تنظيم أسفل من عامل النسخ (باستخدام نهج shRNA) والرنا الميكروي التعبير (التي حددها الرنا الميكروي مجموعة) يمكن أن توحي سوى دور النسخي المباشر الذي يتعين أن يقر المقايسات مقبولة مثل مناعي لونين (رقاقة) أو التنقل الكهربي فحص التحول (EMSA). تعديلات على الأسلوب المقترح في هذه الوثيقة تتضمن طرق مختلفة لتحديد الرنا الميكروي المروج وطرق مختلفة لهدمت التعبير عن عامل النسخ، على سبيل المثال، صغيرة الحمض النووي الريبي التدخل بدلا من shRNA. تنظيم النسخ من microRNAs قد تكون مختلفة بشكل جوهري عن الرنا الميكروية الموجودة داخل جينات ترميز البروتين (الرنا الميكروية داخل الجين)، وتلك التي لا (الرنا الميكروية بين الجينات). لأن الرنا الميكروية داخل الجين يتم نسخه عادة بالتزامن مع الجينات التي تستضيفهم 19 المروج وعادة ما وجدت على الفور upstreaم الموقع بداية النسخ. ولكن بالنسبة لكثير من الرنا الميكروية بين الجينات والمشروح سيئة الموقع بداية النسخ، وأدوات التنبؤ التي تستخدم عادة للبروتين الجينات الترميز أداء ضعيف 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من مؤسسة الأبحاث العالمية CLL. ويدعم إم دي أندرسون في جزء من المعاهد الوطنية للصحة من خلال سرطان مركز دعم جرانت (P30CA16672).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamin 2000 Life Technologies 11668027
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific (Nalgene) 190-2545
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa Merck Millipore
Polybrene Merck Millipore TR-1003-G
TRIzol reagent Life Tachnologies (Invitrogen) 15596-026
293 Cell line human Sigma-Aldrich 85120602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics