MicroRNA Transcriptome की एक प्रतिलेखन कारक निर्भर नियमन का वर्णन

Bioengineering

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Rozovski, U., Hazan-Halevy, I., Calin, G., Harris, D., Li, P., Liu, Z., Keating, M. J., Estrov, Z. Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome. J. Vis. Exp. (112), e53300, doi:10.3791/53300 (2016).

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Abstract

प्रोटीन जीन कोडिंग के प्रतिलेखन विनियमन बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया था, थोड़ा microRNAs की विशेष रूप से कैसे प्रतिलेखन कारक गैर-कोडिंग RNAs के प्रतिलेखन में शामिल कर रहे हैं पर जाना जाता है। यहाँ, हम सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा, कम्प्यूटेशनल संसाधनों और उच्च throughput डेटा का उपयोग कर microRNAs की प्रतिलेखन विनियमन में प्रतिलेखन कारक की संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति का प्रस्ताव है। हम H3K4me3 epigenetic हस्ताक्षर का उपयोग microRNA प्रमोटरों और chromatin immunoprecipitation (चिप) microRNA प्रमोटरों कि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों के साथ समृद्ध कर रहे हैं की पहचान सांकेतिक शब्दों में बदलना परियोजना से -sequencing डेटा की पहचान करने के लिए। shRNA ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक को निशाना बनाने और microRNA सरणी के लिए कोशिकाओं को subjecting के साथ ब्याज की कोशिकाओं transfecting करके, हम microRNA transcriptome पर इस प्रतिलेखन कारक के प्रभाव का अध्ययन। एक उदाहरण उदाहरण के रूप में हम पुरानी Ly के microRNA transcriptome पर Stat3 के प्रभाव पर हमारे अध्ययन का उपयोगmphocytic ल्यूकेमिया (CLL) कोशिकाओं।

Introduction

MicroRNAs अंतर्जात छोटे गैर कोडिंग विनियामक RNAs कि आम तौर पर posttranscriptional स्तर पर mRNA अभिव्यक्ति के रूप में नकारात्मक नियामकों समारोह कर रहे हैं। लगभग 1,000 गैर-कोडिंग 20 से 25 न्यूक्लियोटाइड करने के लिए लंबे microRNAs मानव जीनोम 1,2 में पाए जाते हैं। MicroRNAs microRNA और उसके पूरक बीज मैच दृश्य है, जो आमतौर पर 3 'untranslated क्षेत्र लक्ष्य mRNAs का (UTR) पर स्थित है बीज अनुक्रम के बीच विहित आधार बाँधना के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित। सामूहिक रूप से, microRNAs प्रोटीन जीन कोडिंग 3 का 30% से अधिक विनियमित है, लेकिन केवल थोड़ा microRNAs के डीएनए से प्रतिलेखन के बारे में जाना जाता है। यह सुझाव दिया गया है कि microRNA प्रतिलेखन के नियमन के mRNA 4,5 के समान है। विशेष रूप से, प्रोटीन जीन कोडिंग के प्रतिलेखन को बढ़ावा देने में अपनी गतिविधि के समान है, प्रतिलेखन कारक microRNAs 6 का प्रतिलेखन सक्रिय करने के लिए लगा रहे हैं। प्रतिलेखन कारक-एमicroRNA परस्पर क्रिया जीन अभिव्यक्ति 7 की एक न्यूनाधिक कारक के रूप में सूचित किया गया है, और मई भी फीडबैक और फ़ीड आगे छोरों के रूप में। उदाहरण के लिए, Yamakuchi एट अल। एक राय पाश जिसमें P53 microRNA34a की अभिव्यक्ति है जो बदले में P53 repressor SIRT का अनुवाद और इस तरह P53 गतिविधि 8 में वृद्धि को रोकता है लाती की सूचना दी।

जबकि microRNAs की प्रतिलेखन कारक निर्भर अभिव्यक्ति के विशिष्ट उदाहरण सूचित किया गया है, एक स्वीकृत पद्धति है जिसके कैसे ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक microRNA-transcriptome की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है पर जानकारी प्रदान करता है कमी है। प्रोटोकॉल के साथ साथ सुझाव के प्रयोजन के microRNA-transcriptome का प्रतिलेखन कारक पर निर्भर विनियमन के एक में गहराई से विवरण प्रदान करना है। सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा, जैव सूचना विज्ञान उपकरणों के संयोजन और माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने इस एल्गोरिथ्म का पालन एक जीनोमिक पैमाने पर कब्जा करने में सक्षम हो जाएगा कि कैसे किसी भीब्याज की किसी भी प्रकार की कोशिका में प्रतिलेखन कारक microRNA-transcriptome की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है और microRNA अभिव्यक्ति को विनियमित करने में प्रतिलेखन कारक-mRNA की एक ख्यात योगदान का पता लगाने के लिए।

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Protocol

1. डाटा खनन दृष्टिकोण का उपयोग पहचानें MicroRNA जीन के प्रमोटर में प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों

  1. कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के सांताक्रूज (UCSC) जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करें क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) अनुक्रमण डीएनए तत्व (सांकेतिक शब्दों में बदलना) परियोजना के विश्वकोश के हिस्से के रूप में उत्पन्न डेटा निकालने के लिए।
    1. UCSC जीनोम ब्राउज़र में मेज ब्राउज़र खोलें।
    2. तालिका निकालने के लिए निम्नलिखित विनिर्देशों का उपयोग करें: क्लेड: (स्तनधारी), जीनोम: (मानव), विधानसभा: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), समूह: (विनियमन), ट्रैक (TxnFactorChIP), टेबल: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), क्षेत्र : (जीनोम), आउटपुट स्वरूप (चयनित मेज से सभी जीन)।
    3. एक .txt फ़ाइल के रूप में और एक स्प्रेडशीट में 1.1.2 से उत्पादन को बचाने के।
    4. क्रमबद्ध और ब्याज की प्रतिलेखन कारक (जैसे, STAT2) के लिए फिल्टर।
  2. Baeer एट अल में उपलब्ध H3K4me3 एपिजेनेटिक्स हस्ताक्षर के आधार पर microRNA प्रमोटरों की सूची का उपयोग करें। 9
  3. मानव जीनोम पर निर्देशांक के अनुसार मैच के लिए, 1.1 और 1.2 (जैसे, Stat3 ख्यात microRNA प्रमोटरों पर बाध्यकारी) के आंकड़ों नक्शा और फ़ाइल के रूप में 1 कोडिंग पूरक में उल्लिखित सी तेज में लिखे कोड का उपयोग कर मंझला बंधन आत्मीयता का निर्धारण।

2. shRNA के लिए उपयोग ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति नीचे विनियमित

  1. प्लेट में लगभग 50% संगम (DMEM 10% FBS के साथ) 10 सेमी की थाली में 293 मानव भ्रूण गुर्दे सेल लाइन से 1.5 x 10 6 कोशिकाओं।
  2. हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) shRNA युक्त lentivirus के 5 ग्राम के साथ 293 मानव भ्रूण गुर्दे सेल लाइन से Transfect कोशिकाओं हित के प्रतिलेखन कारक के लिए निर्देशित और पैकेजिंग वैक्टर के 5 ग्राम के निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पक्षपाती कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग के साथ।
  3. एक नियंत्रण के रूप में, के साथ 293 मानव भ्रूण गुर्दे सेल लाइन से कोशिकाओं transfectshRNA और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पैकेजिंग वैक्टर तले।
  4. (37 डिग्री सेल्सियस, सीओ 2 इनक्यूबेटर में) 16 घंटे के लिए कोशिकाओं पर अभिकर्मक मिश्रण रखें, तो मीडिया 10 मिलीलीटर के लिए नए सिरे से 10% DMEM मीडिया में 10% FBS के साथ बदल जाते हैं।
  5. 48 घंटा बाद अभिकर्मक रुको, सेल संस्कृति (300 XG, 5 मिनट) अपकेंद्रित्र और संक्रामक सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। एक 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर (25 एमएम surfactant मुक्त सेलूलोज एसीटेट झिल्ली) के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर किसी भी अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए।
  6. सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ और 100 केडीए की सीमा के साथ एक ultracentrifugal फिल्टर डिवाइस का उपयोग lentivirus इकट्ठा। 30 के लिए 950 XG पर स्पिन - मात्रा तक 60 मिनट के लिए कम से कम 250 μl के लिए ध्यान केंद्रित किया गया है। -80 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित वायरस स्टोर।
  7. lentivirus के साथ कोशिकाओं transfect। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए lentivirus निकालें और कमरे के तापमान को पिघलना। एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब वायरल सतह पर तैरनेवाला के 100 μl स्थानांतरण।
    1. ब्रिनजी तक कम सीरम माध्यम के साथ 1 मिलीलीटर ट्यूब में मात्रा। 10 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिलीलीटर वायरस निलंबन के लिए hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ें, धीरे मिश्रण और मिश्रण 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  8. अपकेंद्रित्र प्रत्येक पारगमन के लिए 5 x 10 6 कोशिकाओं और धीरे वायरस युक्त मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। कोशिकाओं 4 के लिए इनक्यूबेटर में रहने - 24 घंटा, तो 10% FBS के अंतिम एकाग्रता के लिए 20% FBS के साथ मध्यम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. 48 से 72 घंटा के रुको और propidium आयोडाइड (पीआई) और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) निर्माता के निर्देशों के अनुसार के साथ कोशिकाओं दाग। प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा और GFP + / पीआई की दर को मापने के लिए एक FACS सॉर्टर का उपयोग करें - कोशिकाओं। पीआई दाग केवल मृत सेल के बाद से, इस दर जीवित कोशिकाओं में अभिकर्मक दक्षता के एक अनुमान है।
  10. GFP अभिव्यक्ति (GFP +) FACS सॉर्टर द्वारा करने के लिए सकारात्मक सेल की आबादी के आधार पर क्रमबद्ध रूप में पहले 10 में वर्णित है।
  11. उपयोग Westeआर.एन. प्रतिरक्षा सोख्ता के रूप में पहले 10 में वर्णित पहले और ब्याज की कोशिकाओं को नामित shRNA के साथ (CLL कोशिकाओं उदाहरण के लिए) को संक्रमित करने के बाद ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक के स्तर को निर्धारित करने के लिए।

3. ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर-shRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में MicroRNA Transcriptome की अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित

  1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर शाही सेना को अलग।
  2. आरएनए लेबल और microRNA माइक्रोएरे 11 को यह संकरण।
  3. प्रतिलेखन कारक-shRNA के साथ या खाली वेक्टर नियंत्रण 5 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में विभिन्न व्यक्त microRNA निर्धारित करते हैं।
  4. सबसे विभिन्न व्यक्त वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग 5 microRNAs के लिए माइक्रोएरे परिणाम को मान्य।

4. ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर निर्भर Transcriptome का वर्णन करने में जैव सूचना विज्ञान और shRNA दृष्टिकोण के बीच ओवरलैप का निर्धारण करते हैं

  1. det करने के लिएmicroRNA जीन की उम्मीद है और कहा है कि अनुपातों प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी उनके प्रमोटरों में साइटों बंदरगाह और प्रतिलेखन कारक-shRNA में downregulated थे ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं एमिन, निम्न कार्य करें:
    1. जीन है कि 1.3 में उत्पन्न सूची से उनके प्रमोटर / कुल microRNA में ब्याज की प्रतिलेखन कारक बंदरगाह के अनुपात से प्राप्त करते हैं। इस सूची की उम्मीद अनुपात (जैसे, Stat3 बाध्यकारी साइटों / कुल microRNA जीन के साथ microRNA जीन = 0.25 परीक्षण) है।
    2. जीन है कि 3.3 में उत्पन्न सूची से प्रतिलेखन कारक-shRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में downregulated और 1.3 में उत्पन्न सूची से ब्याज बाध्यकारी साइटों का प्रतिलेखन कारक है रहे थे की संख्या निर्धारित करते हैं। यह संख्या / downregulated जीन की कुल संख्या मनाया अनुपात है (जैसे, Stat3 बाध्यकारी साइटों / downregulated microRNAs की कुल संख्या = 0.6 के साथ microRNA जीन)।
    मनाया और उम्मीद अनुपात है कि ऊपर उत्पन्न किया गया तुलना और तय है कि जीन की सूची है कि प्रतिलेखन कारक-shRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में downregulated थे उनके प्रमोटर में प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों के साथ समृद्ध कर रहे हैं करने के लिए सांख्यिकी χ2 का प्रयोग करें।

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Representative Results

Stat3 एक प्रतिलेखन कारक है जो आम तौर पर जीन है कि विरोधी apoptotic और proliferative प्रभाव 12 के प्रतिलेखन लाती है। चाहे Stat3 भी प्रभावित गैर-कोडिंग आरएनए transcriptome वर्तमान में अज्ञात है। सभी CLL कोशिकाओं में Stat3 सेरीन 707 अवशेषों 10,13 पर अनिवार्यता से फॉस्फोरिलेटेड है। नाभिक को Phosphoserine Stat3 शटल, डीएनए को बांधता है, और अन्य प्रकार की कोशिकाओं में 10 tyrosine pSTAT3 से सक्रिय होने के लिए जाना जीनों को सक्रिय करता है। क्योंकि CLL microRNA नेटवर्क 14 के वैश्विक ढील के द्वारा होती है, हम धारणा है कि सेरीन pSTAT3 की उपस्थिति CLL कोशिकाओं में microRNAs की अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है।

इस microRNAs कि बंदरगाह Stat3 बाध्यकारी साइटों की पहचान किया जाना था के प्रमोटरों परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए। द्वारा बेयर एट अल H2K4me3 हिस्टोन modifi के साथ क्षेत्रों के। 9 उत्पन्न डेटा को पार करकेकेशन जो प्रमोटर साइटों की विशेषताएँ, Stat3 बाध्यकारी चिप seq प्रयोग 15 से पहचान साइटों के साथ, ख्यात Stat3 बाध्यकारी साइटों की पहचान की गई। इस दृष्टिकोण 160 ख्यात प्रमोटरों 100 (कम से कम स्कोर) से 1000 (उच्चतम स्कोर) (तालिका 1) को लेकर बाध्यकारी स्कोर के साथ जांच (एन = 200) microRNA जीन का लगभग 25% में पाया गया का उपयोग करना।

इसके बाद CLL कोशिकाओं Stat3-shRNA के साथ या एक खाली वेक्टर और microRNA सरणी का उपयोग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और 63 microRNAs कि नीचे अभिकर्मक (चित्रा 1) सुझाव है कि Stat3 इन microRNAs की प्रतिलेखन को बढ़ावा देता है निम्न विनियमित रहे थे पहचान की गई। 63 downregulated microRNA जीन का 60% के लिए चिप-सेक Stat3 पुष्टि की जीन स्थान के ऊपर एक ख्यात प्रमोटर में डेटा बाइंडिंग, काफी मौका (पी <0.0001) द्वारा उम्मीद से ज्यादा (एन 38 =)। नौ microRNAs कि अभिकर्मक के बाद नीचे विनियमित रहे थे,सुझाव है कि Stat3 नकारात्मक प्रतिलेखन के अपने स्तर को विनियमित।

आकृति 1
चित्रा 1. Stat3-shRNA साथ CLL कोशिकाओं के अभिकर्मक Stat3 प्रोटीन और Stat3 mRNA की अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर देता। एक:। Stat3 mRNA (बाएं पैनल, मात्रात्मक आरटी पीसीआर से पता चला) के Stat3-shRNA स्तर और Stat3 प्रोटीन के स्तर के साथ CLL कोशिकाओं (सही पैनल, पश्चिमी immunoblotting द्वारा पता चला) के अभिकर्मक के बाद काफी कम बी: CLL के microRNA सरणी कोशिकाओं 23 microRNAs जिनकी अभिव्यक्ति CLL कोशिकाओं Stat3-shRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और CLL कोशिकाओं एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट के बीच काफी मतभेद दर्शाया। । कम से कम 0.01 के पी मूल्य सांख्यिकीय महत्वपूर्ण सी माना जाता था: मतलब अभिव्यक्ति द्वारा मात्रा 7 microRNAs जो Stat3-shRNA उपचार के बाद अंतर अभिव्यक्ति का उपयोग करने का था आरटी पीसीआरmicroRNA सरणी। सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मीर 1537
माइक्रो आरएनए जीन क्रोमोसाम प्रमोटर शुरुआत निर्देशांक प्रमोटर अंत निर्देशांक माध्य (रेंज) Stat3 बाध्यकारी स्कोर *
मीर 1205, मीर-1206, मीर-1207 8 q24.21 128961454 128962791 1000 (1000-1000)
1 q42.3 236045425 236047415 1000 (1000-1000)
मीर 21 17 q23.1 57901872 57921277 1000 (112-1000)
मीर 3124 1 Q44 249115404 249123965 1000 (1000-1000)
मीर 451 17q11.2 27222251 27224114 1000 (1000-1000)
मीर 92B 1 Q22 155162340 155168439 1000 (1000-1000)
मीर 3197 21 q22.2 42537544 42543023 943 (943-943)
मीर 646 20 q13.33 58712550 58715320 789 (789-789)
मीर 629 15 Q23 70383751 70394586 773 (661-885)
मीर 30E, मीर 30C-1 1 p34.2 41173077 41177703 759 (759-759)
मीर 3125 2 p24.3 12855381 12862915 756 (756-756)
मीर 3145 6 q23.3 138776942 138779365 743 (487-1000)
मीर 645 20 q13.13 49199911 49201187 743 (743-743)
मीर-1256 1 p36.12 21346830 21350211 725 (725-725)
मीर 619 12 q24.11 109248263 109253306 719 (719-719)
मीर 181a -2, मीर 181b -2 9 q33.3 127418928 127426139 710 (710-710)
मीर 29A, मीर 29b-1 7 q32.3 130583383 130597803 697 (482-1000)
मीर 202 10 q26.3 135069499 135077337 696 (393-1000)
मीर 3142, मीर 146a 5 Q34 159890882 159899475 671 (671-671)
मीर 548c 12 q14.2 65000968 65011503 660 (660-660)
मीर 630 15 q24.1 72764289 72769197 627 (255-1000)
मीर 135b 1 q32.1 205416952 205452990 622 (245-1000)
मीर 29c, मीर 29b -2 1 q32.2 207991044 208002382 608 (608-608)
मीर-1825 20 q11.21 30791020 30798310 604 (209-1000)
मीर 548h -1 14 q23.2 64578,834 64581657 587 (174-1000)
मीर 612 11 q13.1 65183633 65198528 581 (157-1000)
मीर 148b 12 q13.13 54717640 54721204 578 (578-578)
मीर 3174 15 q26.1 90543381 90549092 576 (152-1000)
let7a -3, let7b 22 46480680 46481826 573 (146-1000)
मीर 1255a 4 Q24 102263848 102272541 557 (557-557)

तालिका 1 ख्यात microRNA के Stat3 बाध्यकारी साइटों के साथ प्रमोटरों। प्रोटोकॉल प्रकाशित आंकड़ों के डेटा खनन का उपयोग कर microRNAs की ख्यात प्रमोटरों पर बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। एक उदाहरण के रूप में, हम यहाँ एक मेज ख्यात microRNA प्रमोटरों को Stat3 के बंधन चित्रण प्रस्तुत करते हैं। बाध्यकारी स्कोर पूरे जीनोम चिप seq सांकेतिक शब्दों में बदलना परियोजना 15 के भाग के रूप में प्रकाशित आंकड़ों से एक 0 से 1000 पैमाने पर दिया जाता है। प्रमोटरों H3K4me3 epigenetic हस्ताक्षर 9 की मौजूदगी से पहचाने जाते हैं।

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Discussion

तंत्र प्रोटीन जीन कोडिंग की शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय निर्भर प्रतिलेखन अंतर्निहित बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इन तत्वों को केवल 1% है जबकि - मानव जीनोम के 2%, सांकेतिक शब्दों में परियोजना से साक्ष्य बताते हैं कि मानव जीनोम के 80% से अधिक प्रतिलेखन 17 गुजरना सकता है और क्या गैर-कोडिंग डीएनए तत्वों का प्रतिलेखन को नियंत्रित काफी हद तक अनजान बनी हुई 6

कई अध्ययनों से पता है, जो संकेत दिया कि पोल द्वितीय भी कुछ microRNAs 6 सहित गैर-प्रोटीन कोडिंग जीन के प्रतिलेखन के लिए जिम्मेदार है, एक रणनीति है कि संभावित समझने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संसाधनों, कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम से और इन विट्रो अध्ययन में डेटा गठबंधन विकसित करने के लिए हमें का नेतृत्व किया microRNAs की प्रतिलेखन विनियमन में ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक का कार्य करते हैं। रणनीति के साथ साथ सुझाव 2 महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है। पहले हम सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा का उपयोग की पहचान करने के प्रतिलेखन कारक खmicroRNA प्रमोटरों में inding। कि अंत करने के लिए हम सांकेतिक शब्दों में बदलना संघ द्वारा प्रकाशित प्रतिलेखन कारक बंधन और epigenetic हस्ताक्षर है कि microRNA-प्रमोटरों की एक अप्रत्यक्ष मार्कर के रूप में प्रमोटर बढ़िया क्वालिटी का प्रतीक पहचान करने के लिए चिप-सेक डेटा का उपयोग करें। इन डेटासेट से आनुवंशिक निर्देशांक पार कैसे लगातार ब्याज की एक प्रतिलेखन कारक microRNA-प्रमोटर को बांध की सकल अनुमान है। दूसरा shRNA प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति को चुप करने के लिए और microRNA-सरणी के लिए कोशिकाओं को subjecting द्वारा, यह microRNA-transcriptome पर एक प्रतिलेखन कारक के कार्यात्मक महत्व का पता लगाने के लिए संभव है।

microRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता केवल आंशिक रूप से प्रतिलेखन कारक निर्भर विनियमन से समझाया है। Stoichiometric परिवर्तनशीलता और अन्य सेलुलर या बाह्य कारकों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और प्रस्तावित एल्गोरिथ्म में नकली नहीं कर रहे हैं। अन्य सीमाओं में निम्न शामिल हैं: प्रमोटर H3K4me3 के आधार पर विश्लेषणहस्ताक्षर 939 एनोटेट microRNAs पर किया गया था। तब से बहुत से अधिक microRNAs की जीनोमिक स्थानों की पहचान की है। हालांकि हमारे ज्ञान के लिए एक अधिक व्यापक सूची का सबसे अच्छा है कि एक अद्यतन डेटाबेस पर आधारित है अभी तक प्रकाशित नहीं किया गया है। 939 microRNA जीन की, H3K4me3 जो प्रमोटर क्षेत्र बढ़िया क्वालिटी का प्रतीक 781 microRNA जीन (83%) में पहचान की थी। इसलिए, जबकि इस विश्लेषण स्पष्ट रूप से एक अधूरी डाटासेट पर आधारित है यह microRNA-transcriptome का एक महत्वपूर्ण अंश कब्जा।

इसके अलावा, एपिजेनेटिक्स हस्ताक्षर भाग में अंकित और भाग सेल विशिष्ट में है। इसलिए, ख्यात प्रमोटरों कि एपिजेनेटिक्स मार्कर द्वारा परिभाषित किया गया की generability पूछताछ की जा सकती है। H3K4me3 प्रतिलेखन 18 के स्वतंत्र बनी रहती है क्योंकि यह आम तौर अंकित प्रवर्तकों में से एक मार्कर माना जाता है। विश्लेषणात्मक एल्गोरिथ्म हम यहाँ का प्रस्ताव इसलिए सेल विशिष्ट microRNA प्रमोटरों याद कर सकते हैं कि अगर इन प्रमोटरों को एक अलग सेल में पहचान की गईप्रकार। अंत में, किसी भी निष्कर्ष पर परीक्षण किया और अनुभव से पुष्टि की जानी चाहिए। सबसे विशेष रूप से, एक प्रतिलेखन कारक के नीचे विनियमन के बीच सहयोग और microRNA अभिव्यक्ति (microRNA सरणी द्वारा की पहचान) (shRNA दृष्टिकोण का उपयोग कर) केवल एक सीधा ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की है कि इस तरह के chromatin immunoprecipitation (चिप) या electrophoretic गतिशीलता के रूप में स्वीकार्य assays के द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए सुझाव कर सकते हैं शिफ्ट परख (EMSA)। विधि के साथ साथ सुझाव के लिए संशोधन microRNA प्रमोटर की पहचान करने के विभिन्न तरीकों और एक प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति के नीचे दस्तक करने के विभिन्न तरीकों, उदाहरण के लिए, shRNA के बजाय छोटे दखल आरएनए शामिल हैं। microRNAs की प्रतिलेखन विनियमन microRNAs कि प्रोटीन जीन कोडिंग (intragenic microRNAs) और उन है कि (intergenic microRNAs) नहीं है के भीतर रहते हैं के लिए काफी हद तक अलग-अलग हो सकता है। क्योंकि intragenic microRNAs आमतौर पर अपने मेजबान जीन 19 के साथ संयोजन के रूप में लिखित रहे हैं प्रमोटर आमतौर पर तुरंत पाया जाता है upstreaप्रतिलेखन शुरू साइट हूँ। हालांकि कई intergenic microRNAs प्रतिलेखन शुरू साइट खराब एनोटेट है, और भविष्यवाणी उपकरण है कि आमतौर पर प्रोटीन जीन कोडिंग के लिए उपयोग किया जाता है के लिए खराब 20 प्रदर्शन करते हैं।

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Acknowledgments

इस अध्ययन CLL ग्लोबल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। टेक्सास एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय में एक कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA16672) के माध्यम से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamin 2000 Life Technologies 11668027
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific (Nalgene) 190-2545
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa Merck Millipore
Polybrene Merck Millipore TR-1003-G
TRIzol reagent Life Tachnologies (Invitrogen) 15596-026
293 Cell line human Sigma-Aldrich 85120602

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References

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
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