Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Протокол описывает выделение лимфоидных клеток из человеческого материала пациента и, следовательно, требует этическим нормам. Проделанная работа в данном исследовании был предоставлен Упсалы этического наблюдательного совета (DNR. 2013/387).

1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из небных миндалин человека

ВНИМАНИЕ: Все неэкранированный материалы человеческого происхождения, такие как кровь, ткани или жидкости организма должны рассматриваться как потенциально инфицированным материалом. Таким образом, рекомендуемые практики биобезопасности для обработки тканей человека должны быть соблюдены.

Примечание: Чтобы избежать загрязнения, все решения и оборудование для культивирования клеток, должны быть стерильными. Все буферы и растворы должны быть предварительно охлаждены, и хранили на льду. Миндалины тканей и изолированных клеток должны храниться и обрабатываться на льду.

  1. Получить свежие миндалины из пациентов тонзиллэктомии или удаление миндалин (рисунок 2). Окунитесь в ткани ClumPS в 50 мл центрифужную пробирку, наполненную ледяной стерильной сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ глутамина, 0,05 мг / мл гентамицина и 1% антибиотиков-противогрибковое смеси (пенициллин, стрептомицина и амфотерицин).
  2. Держите трубки с погруженными образцами тканей миндалин во все времена на льду. Попробуйте обрабатывать миндалины, как только возможно, и не позднее, чем 3 часа после хирургического удаления.
  3. Поместите миндалину на 60 мм пластик клеток культуры пластины на льду и держать ткань, смоченную HBSS. Удалить видимые сгустки крови, жировой и соединительной ткани с чистыми щипцами с поверхности миндалин.
  4. Использование нового 60 мм культуральный планшет, содержащий 5 мл HBSS. Вырезать ткани миндалин комок в 3-10 мм фрагментов с использованием стерильного ножницы и / или скальпель.
  5. Подготовьте новый 60 мм культуральный планшет, содержащий 10 мл HBSS и поместить пластиковый клеточный фильтр 100 мкм в растворе HBSS.
  6. Передача DISSected миндалин фрагментов в ячейки фильтра стерильной щипцами. Использование конец плунжера пластиковый шприц, плавно сжать фрагментов ткани через ячейки сетчатого фильтра. Убедитесь, что фрагменты миндалины полностью погружены в HBSS.
  7. Отменить клеточный фильтр с тканью остатки и передавать полученную клеточную суспензию из 60 мм культуральный планшет в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки. Оставьте пробирку на льду, а исходя с шагом 1,8 и 1,9.
  8. В случае больших миндалин, больше, чем 2 см в диаметре (Рисунок 2), выжать фрагменты миндалин в двух сотовых сетчатых, чтобы избежать засорения сетки в сито.
  9. Получение конечного объема 35 мл клеточной суспензии.
    Примечание: На этом этапе можно приготовить суспензию клеток для криоконсервации (см раздел 2).
  10. Добавьте 10 мл в градиенте плотности раствором, таким как Ficoll в новую 50 мл центрифужную пробирку. Аккуратно наложить клеточных suspensион (шаг 1,9) в верхней части градиента плотности раствора. Избегать смешивания клеточной суспензии и в градиенте плотности раствора.
    Примечание: градиент плотности раствора должен быть разогрет до комнатной температуры.
  11. Центрифуга клеточной суспензии в поворотно-откидной ротор 700 мкг на 20 мин при комнатной температуре. Не активируйте функцию тормоза на центрифуге в быстрого торможения может нарушить градиент. Кроме того, использовать низкие функцию ускорения доступной на центрифуге.
    Примечание: После этого стадии центрифугирования, наблюдается МНК в виде пушистого белого слоя на границе, и эритроцитов (эритроцитов), фибробласты и клеточного дебриса в качестве осадка на дне пробирки.
  12. Осторожно собрать слой МНК с помощью 10 мл пипетки. Поместите клеточной суспензии в новый 50 мл центрифужную пробирку.
  13. Добавить 25 мл охлажденной льдом PBS к клеточной суспензии, и спина трубки при 300 х г в течение 5 мин в поворотно-откидной ротор при 4 ° С.
  14. Удалить супернатант, используя 25 мл пипеткии повторить осадок клеток стиральной шаг два раза больше. Наконец ресуспендируют осадок клеток в 15 мл PBS.
    Примечание: После окончательного этапа промывки, можно криоконсервируют клеточной суспензии (см раздел 2).
  15. Применить 10 мкл клеточной суспензии в гемоцитометр клеток Счетной палаты и подсчитать количество клеток под микроскопом. Не включать соответствующее количество клеток (например, 2-3 х 10 7) в 15 мл центрифужную пробирку для последующего разделения борта магнитного. Держите эту аликвоту на льду до шага 3.2.

2. Криоконсервация клеток миндалин

  1. Подготовьте среду замораживания (90% FBS и 10% ДМСО) и держать его на льду. Для долговременного хранения держать замораживания средств массовой информации при -20 ° С.
  2. Определить общее количество клеток с использованием подсчета клеток гемоцитометр камеру (этап 1.15). Рассчитать необходимое количество замерзания среды в соответствии с требуемой плотностью замороженной клеточной (например, 10 7 клетокс / мл морозильной среде).
  3. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин. Слейте супернатант, не нарушая клеточный осадок и ресуспендируют осадок клеток в ледяной замерзания среды (со стадии 2.1).
  4. Разливают по 1 мл аликвоты клеточной суспензии в стерильные флаконы, предназначенных для длительного хранения в жидком азоте. Замораживание ампул в изопропанол камеры и хранить их при температуре -80 ° CO / N. Для долгосрочного хранения передать флаконов в жидком азоте, содержащей резервуар или -140 ° C морозильник клеток.
  5. Для таять флаконы с замороженных клеток, согреть их быстро в С на водяной бане 37 °. Сразу при оттаивании, разогнать клеточной суспензии в 10 мл подогретого HBSS (с добавками, шаг 1.1) в 15 мл центрифужную пробирку. Спин трубку при 300 х г в течение 5 мин, удалить HBSS и ресуспендируют осадок клеток в желаемой плотности клеток в HBSS (с добавками, шаг 1.1).
    Примечание: жизнеспособность AF МНКтер оттаивания имеет значение, так как присутствие мертвых клеток снизится окончательный выход очищенного В и Т-лимфоцитов.
    Примечание: В соответствии с нашим опытом жизнеспособность клеток менее 80% снизит эффективность изоляции клеток.

3. Положительный Выбор Т-лимфоцитов из миндалин населения МНК

Примечание 1: Этот протокол основан на позитивной селекции человеческих CD3 + Т-лимфоцитов из миндалин МНК с использованием магнитных шариков, соединенных с антителом CD3. Можно начать этот раздел из свежих (раздел 1) или замороженных (раздел 2) МНК.

Примечание 2: Начните с 3 х 10 7 МНК. Не превышать это число клеток, так как разделительные колонны могут засорить и это приведет к снижению эффективности изоляции. Используйте большие колонки, если больше клеток будут обработаны. Объемы, используемые в этом протоколе были экспериментально оптимизирована для количества клеток насред в нашей экспериментальной установки.

  1. Подготовка буфера разделения [PBS (рН 7,2), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА]. Фильтр буфер разделения через фильтр и хранят 0,45 мкм при 4 ° С.
  2. Спин подвеску МНК (шаг 1,14) при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Ресуспендируют полученный осадок клеток в 240 мкл (80 мкл на 10 7 клеток) охлажденного льдом буфера разделения. Передача клеточной суспензии в стерильную пробирку 2 мл.
  3. Добавьте 20 мкл антител CD3 магнитного к раствору клеток. Инкубировать пробирки в течение 1 часа при 4 ° С при непрерывном осторожном перемешивании, чтобы клетки в суспензии.
  4. Передача всех клеточной суспензии в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл охлажденного льдом буфера разделения мыть клетки.
  5. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С в поворотно-откидной ротор.
  6. Между тем создание магнитного сепаратора и колонны. Прикрепите магнитный сепаратор к подставке, и поместите колонку в SEPARАТОР. Промыть колонку с применением 500 мкл охлажденного льдом буфера разделения. Откажитесь от потока через.
  7. Поместите новую пробирку 15 мл колонке ниже. Держите пробирку на льду.
  8. Удалите супернатант (этап 3.5) по пипетки и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера разделения. Применение клеточной суспензии в верхней части предварительно промытой колонке и пусть это проходит через.
    Примечание: скопления клеток может засорить колонку и тем самым уменьшить расход. Чтобы избежать этой проблемы, место 40 мкм пластиковый клеточный фильтр в верхней части колонны. Прохождение клеток через этот сетки будет весьма повысить эффективность этого метода.
  9. Промыть колонку 4 раза с 1,5 мл буфера для разделения (500 мкл в течение 10 7 клеток). Подождите водохранилища столбца, чтобы быть пустым (жидкость не должна наблюдаться в колонке) перед нанесением следующего стиральной шаг.
    Примечание: Получите немеченые клетки CD3, считаются лимфоцитов фракции, так как ониэлюировали в пробирки.
  10. Удалить столбец из сепаратора и места в новой 15 мл пробирку. Пипетка 2 мл буфера для разделения на колонку. Использование поршень, прилагаемый к колонке элюирования положительно выбранные Т-лимфоциты, которые рассматриваются в качестве фракции лимфоцитов Т.
  11. Определить количество очищенных клеток (шаг 1,15), если это необходимо. Клеточные суспензии теперь готовы для последующих экспериментов.

4. проточной цитометрии изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид решение раздражителем и канцероген. Носить соответствующую защитную одежду, перчатки и средства защиты глаз / лица.

Примечание 1: Этот протокол описывает способ прямого окрашивания изолированной В- и Т-клеток с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS анализ). Основная цель этого этапа является оценка чистоты изолированной камере населения AFтер CD3 разделение магнитного антитела. Для этого, установленном В- и Т-клеточных маркеров, флуорофорные-сопряженных моноклональных антител CD20-FITC и CD2, APC-используются. Также включение управления изотипу антител рекомендуется различать неспецифический «фон» связывания антител CD2 и CD20 (см шаг 4,8).

Примечание 2: Можно не держать очищенные фракции клеточных в 1% параформальдегидом (PFA) раствор в темноте при 4 ° С до момента окрашивания (например, на следующий день.). Также же процедура применяется, если есть промежуток времени между окрашиванием и анализа FACS. Следует помнить, что в обоих случаях клетки должны быть вымыты должным образом с PBSA (PBS, содержащий 0,2% BSA) буфер перед окрашиванием или анализа FACS.

  1. Выньте 6 х 10 6 клеток МНК шагом 1,15 (перед нанесением на колонку), B-лимфоцитов фракции из стадии 3.9 и Т-лимфоцитов фракции со стадии 3.10.
  2. Спин ячейкиСуспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С с использованием откидную ротора.
  3. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток один раз 1 мл ледяного PBSA. Спин клеточные суспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант с пипетки и ресуспендируют Клетки в 600 мкл охлажденного льдом буфера. PBSA
  4. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в нижней части трубки FACS.
  5. Добавить 100 мкл PBS, содержащего 10% инактивированной нагреванием человеческую сыворотку в каждую пробирку, хорошо перемешать и инкубировать в течение ~ 1 мин при комнатной температуре или 20 минут на льду.
    Примечание: B-лимфоциты несут рецепторы Fc. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы очищенные фракции клеток инкубируют с 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека. Сыворотки человека является инактивированной нагреванием инкубированием при 56 ° С в течение 1 часа. Разделите термоинактивированной сыворотку в малых аликвоты и хранить замороженные при -20 ° С.
  6. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С в SWИн-из ротора.
  7. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток с 1 мл PBSA. Повторите центрифугирования (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С).
  8. Добавить 100 мкл PBSA в каждую пробирку на льду. Добавить соответствующее количество флуорофора-сопряженных моноклональных антител, в соответствии с рекомендациями производителя (например, 20 мкл анти-CD20 и / или 5 мкл анти-CD2 антитела в 100 мкл PBSA). Примечание: Не забудьте установить достаточно трубы управления для анализа FACS. В этом протоколе должны быть включены следующие элементы управления: 1) клетки окрашивали антителами к CD2 и анти-CD20-отдельности, 2) клетки, окрашенные анти-CD2 и анти-CD20-контроля изотипа антител в отдельности и, 3) клетки без добавления антител.
  9. Кратко вихрь трубку и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
  10. Вымойте 2 раза PBSA. Добавляют 2 мл 1% раствора PFA с образцами. Пусть клетки остаются в растворе при 4 PFA76; С в темноте до момента анализа FACS.
  11. Непосредственно перед запуском образцов в машине FACS, промыть клетки 2 раза PBSA (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° C). Образцы Ресуспендируйте в 1 мл PBS и держать при 4 ° С (или на льду), защищенном от света месте, до разделения на цитометра.
  12. Сделайте сортировку FACS следующий протокол от цитометра производителя.

5. ПЦР обнаружения аденовируса ДНК в изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

Примечание 1: аденовирусные генные праймеры Hexon являются AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') и AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Эти праймеры генерируют ампликон 139 б.п.. Хост гена рРНК 18S могут быть обнаружены с праймерами tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') и TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Ожидаемый размер ампликона составляет 300 б.п..

Примечание 2: Каждый ПЦРпробег включает в себя отрицательный контроль (дистиллированная H 2 O) и положительный контроль ДНК, полученной из клеточной линии человеческого (BJAB) инфицированного человека типа аденовируса 5 12.

  1. Извлечение ДНК (по крайней мере, 1 × 10 6 клеток, шаг 3.11) с использованием диоксида кремния мембраны способ очистки колонки на основе. Извлечение РНК с помощью фенола и гуанидинизотиоцианата решение 13.
  2. Добавить 100 нг ДНК из В- и Т-лимфоцитов в реакционной смеси, содержащей 1х HF буфер, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов смеси (дНТФ), 0,25 мкМ каждого праймера и 1 ед Высококачественное ДНК-полимеразы в общем объеме 20 мкл.
  3. Выполнение ПЦР-амплификации при следующих условиях велосипедных: 30 сек денатурация при 98 ° С, затем 30 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 67 ° С (Hexon) или 58 ° C (18S рРНК) в течение 30 сек и 72 ° С в течение 30 сек. Реакцию ПЦР закончился конечной стадии расширения 7 мин при 72 ° С.
  4. Отделите полученный ПЦР amplification изделия на 1,5% агарозном геле в 1X TBE буфер и визуализировать ожидаемых диапазонов окрашиванием красителем нуклеиновых кислот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффективный разделение миндалин МНК приводит высокоочищенных субпопуляций В и Т-лимфоцитов. Это было подтверждено с помощью анти-CD20 и анти-CD2 антитела для выявления В- и Т-лимфоцитов популяции соответственно (фиг.3А) с помощью анализа FACS. В противоположность этому, неэффективный отделение МНК результатов в клеточных фракций, которые представляют собой смесь клеток из двух В- и Т-лимфоцитов (субпопуляций Фиг.3В).

Выделенный миндалин В- и Т-лимфоциты (рис 3а) являются достаточно высокого качества для последующих анализов как выделении нуклеиновых кислот. В текущем протоколе, ДНК и РНК экстрагировали из B и Т-лимфоциты используются для обнаружения аденовируса ДНК и клеточной РНК. Результаты показывают, специфического обнаружения аденовируса ДНК миндалин Т-лимфоцитов (рисунок 4). Также изолированы РНК из миндалин В- и Т-лимфоцитов достаточного качества и количества для downstrea м приложений (рисунок 5).

фигура 1
Рисунок 1. Обзор миндалин процедуры выделения лимфоцитов. Палатин образцы миндалин обрабатываются и миндалин МНК выделяют из клеточной суспензии центрифугированием в градиенте плотности. B и Т-лимфоцитов, очищают в субпопуляции положительным выбора фракции лимфоцитов Т с CD3 человека магнитного антитела. Это стадия очистки дает возможность дополнительно оценить изолированной камере фракций; Например, чтобы определить, если некоторые вирусные виды обогащены в любой из подгрупп населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

JPG "/>
Рисунок 2. удалены хирургическим путем небные миндалины. Миндалины удалены от тонзиллэктомии (слева) и удаление миндалин (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Результаты Рисунок 3. Представитель FACS обогащенного клеточных фракций. (A) вперед против сторона разброс график, показывающий B (CD20) и Т (CD2) популяций лимфоцитов в миндалин МНК, Т-лимфоцитов и сточных фракций. Чистоту Т-лимфоцитов и В обогащенных фракций клеток более чем на 90%. Так как B-клетки содержат 92% от общего объема сточных клеток, эту фракцию назван лимфоцитов субпопуляции. (B) FACS участки показывая неэффективное разделение B и Т-клеток subpopulations, из-за неоптимизированного числа МНК, применяемых к колонке и недостаточных шагов стирки. Помимо необходимости для магнитно-активированный сортировки клеток оптимизации, существует высокая фон CD2 - / CD20 -. Клеток, который показывает, что окрашивание FACS не хорошо оптимизирован Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. ПЦР-детекции аденовируса ДНК в миндалин фракций лимфоцитов. Общую ДНК экстрагируют из B и Т-лимфоциты выделяют из левой и правой миндалины от пациента, подвергающегося миндалин. Оконечная ПЦР проводят с 100 нг очищенной ДНК. Дорожка 1: лимфоцит фракцию (Б) левого миндалины; дорожка 2: Т-лимфоцитов фракция (Т) LEFт миндалина; дорожка 3: лимфоцит фракция (В) правой миндалине; дорожка 4: Т-лимфоцитов фракция (Т) правой миндалине. Аденовирус (объявление) ДНК обнаруживается только в изолированных Т-лимфоцитов фракции. Сотовый рРНК 18S ген действует в качестве внутреннего контроля, чтобы показать, что то же самое количество ДНК используется для ПЦР-реакции во всех пробах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 5
Рисунок 5. Высокое качество РНК, выделенной из изолированного В- и Т-клеточных субпопуляций. Общее цитоплазматической РНК экстрагировали из изолированного В- и Т-лимфоцитов был отделен на 1% агарозном геле. Дорожка 1: лимфоцит фракцию (Б) левого миндалины; дорожка 2: Т-лимфоцитов фракции (Т) левого миндалины; дорожка 3: лимфоцит фракция (В) правой миндалине; дорожка 4:Т-лимфоцитов фракция (Т) правой миндалине. Миграция модель 28S рРНК, 18S рРНК и малых РНК указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Один из самых важных факторов, влияющих на исход этого протокола является использование свежего материала миндалин в качестве исходного материала. Таким образом, образцы миндалины должны быть обработаны в течение 3 ч после операции. Миндалины могут быть получены из взрослых, так и детей. Миндалин материал от детей, как правило, меньше, из-за частичного хирургического удаления миндалин (тонзиллэктомия). Таким образом, количество МНК получены из образцов удаление миндалин (1 х 10 7 -1 × 10 8) меньше по сравнению с образцами Тонзиллэктомия (1 х 10 8 -2 · 10 9). Тем не менее, процесс изолятор будет такой же, независимо от типа операции.

Максимальное чистоту клеточных субпопуляций, полученных из магнитного-активированных клеток метод сортировки требует оптимизации. Количество и инкубацию раз с CD3 антителом магнитного и количество МНК наносили на колонку являются основными факторами, которые должны быть выбираютimized. Применение слишком много клеток приведет к засорению колонны и неэффективному обогащения клеток субпопуляций. При оптимизации этого протокола, мы обнаружили, что применение более 3 х 10 7 МНК на разделительную колонну вызовет закупорку колонки и последующих неочищенных фракций клеток (фигура 3В). Таким образом, начиная с 3 х 10 7 МНК дает также обогащенные фракции лимфоцитов с достаточным качеством и количеством для ДНК и РНК добычи (цифры 4 и 5). Окончательное количество изолированных В- и Т-лимфоцитов как ожидается, будет 1-2 х 10 7 и 5-7 × 10 6, соответственно. Таким образом, использование 20 мкл CD3 антитела на магнитной 3 х 10 7 МНК по-видимому, оптимальным для успешного В- и Т-лимфоцитов разделения (фиг.3А).

В предыдущем докладе было установлено, что B-лимфоциты и Т-60-70% составляют и 30-40% соответственно миндалин МНК, в то время как другиетипы клеток, такие как макрофаги, естественных клеток-киллеров и дендритные клетки составляют 1-8% от миндалин МНК 14. Подобные клеточные пропорции были достигнуты с нашим протоколом изоляции, как показано иммунным окрашиванием В и Т-лимфоцитов методом FACS (фиг.3А).

Количество стадий промывки и объем промывочного буфера являются критическими параметрами для хорошего результата. Соответственно, чрезмерное мытье вызовет CD3 магнитного антител, связанные Т-клетки в конечном итоге в проточной, а недостаточная промывка снизить чистоту фракции Т-клеток.

После того, как критические шаги в протоколе оптимизированы для типа ткани и ожидаемых последующих анализов, этот метод прост, эффективен, прост и летнее время. Однако одним из ограничений данного метода является относительно высокая стоимость коммерческих сортировки клеток реагентов магнитных ассоциированных, которые могли бы ограничить масштабную очистку TonsillaR B и Т-лимфоциты.

В целом этот протокол обеспечивает стратегию для получения В- и Т-субпопуляции с небных миндалин и может быть изменен, чтобы изолировать клетки фракции из других тканей, таких как селезенка, тимус, лимфатические узлы и кровь. Мы также применять этот метод, чтобы показать, что мы обнаружить аденовирусной инфекции, специально во фракции Т-клеток миндалин (рисунок 4). Таким образом, этот протокол должен быть полезным для широкого области применения, в том числе исследований по хозяин-патоген взаимодействий, Т-клеток цитотоксичность, активацию Т-клеток, клеточной сигнализации и В и экспрессии маркера клеточной поверхности Т.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics