인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Immunology and Infection

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Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

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Abstract

Protocol

이 프로토콜은 인간의 환자 물질로부터 림프 세포의 분리를 설명하고, 따라서 윤리적 승인을 필요로한다. 본 연구에서 수행 된 작업은 웁살라 윤리 심의위원회 (DNR. 387분의 2,013)에 의해 부여했다.

인간 팔라티노 편도선에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 분리

주의 : 혈액, 조직 또는 체액과 같은 인간 기원의 모든 차폐 재료는 잠재적 감염 물질로 간주되어야한다. 따라서, 인간의 조직을 처리하기위한 권장 바이오 안전성 관행에 따라야한다.

참고 : 오염을 방지하기 위해 모든 솔루션 및 세포 배양 장비는 멸균해야합니다. 모든 버퍼와 솔루션은 사전 냉각 얼음에 보관해야합니다. 편도 조직과 분리 된 세포는 보관하고 얼음에 처리되어야한다.

  1. 편도 또는 tonsillotomy (그림 2)을받은 환자에서 신선한 편도선을 얻습니다. 조직 clum 플 런지5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 글루타민, 0.05 밀리그램 / 젠타 마이신 및 1 % 항생제 - 안티 곰팡이 믹스 ㎖ (페니실린 빙냉 멸균 된 행크스 평형 염 용액 (HBSS)으로 가득 50 ㎖ 원심 분리 관에 추신 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B).
  2. 얼음에 항상 잠겨 편도 조직 샘플 튜브를 유지한다. 가능한 빨리 편도선을 처리하려고없고 나중에 제거 수술 후 3 시간 이상.
  3. 얼음에 60mm 플라스틱 세포 배양 접시에 편도선을 놓고 HBSS에 적신 조직을 유지. 편도선 표면에서 깨끗한 집게로 볼 혈전, 지방과 결합 조직을 제거합니다.
  4. 5 ㎖의 HBSS를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 사용한다. 가위 및 / 또는 메스의 멸균 쌍을 사용하여 3~10mm의 조각으로 편도선 조직 덩어리를 잘라.
  5. HBSS 10 ㎖를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 준비하고, HBSS 용액에 100㎛의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다.
  6. DISS 이동멸균 집게와 셀 스트레이너에 반사된다 편도 조각. 플라스틱 주사기의 플런저의 단부를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통하여 상기 조직 절편을 짠다. 편도 조각이 완전히 HBSS에 몰입되어 있는지 확인합니다.
  7. 티슈 남아있는 셀 스트레이너를 폐기하고 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 세포를 60mm 배양 접시에서 얻어진 세포 현탁액을 전송. 단계 1.8 및 1.9를 진행하는 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
  8. 편도선 큰 경우, 크기가보다 큰 2cm (도 2), 스트레이너 메쉬에서의 막힘을 방지하기 위해 두 개의 셀 스트레이너에 편도선 단편을 짠다.
  9. 세포 현탁액 35 ml를 최종 부피를 얻었다.
    :이 단계에서 그것은 동결 보존 (섹션 2 참조) 세포 현탁액을 제조 할 수있다.
  10. 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 피콜 같은 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 suspens 오버레이이온 밀도 구배 용액의 상단에 (단계 1.9). 세포 현탁액 및 밀도 구배 용액의 혼합을 피한다.
    : 밀도 구배 용액을 RT로 가온되어야한다.
  11. 실온에서 20 분 동안 700 XG에서 스윙 아웃 로터의 세포 현탁액을 원심 분리기. 그라데이션을 방해 할 수 있습니다 빠른 제동과 원심 분리기에 브레이크 기능을 활성화하지 마십시오. 또한, 원심 분리기에서 사용할 수있는 가장 낮은 가속 기능을 사용합니다.
    :이 원심 분리 단계 이후에, 상기 튜브의 하단에 퇴적물로서 계면에서 무성 백색 층, 및 적혈구, 섬유 아세포와 같은 세포 파편 다국적 관찰.
  12. 조심스럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 다국적 층을 수집한다. 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 놓습니다.
  13. 세포 현탁액에 얼음처럼 차가운 PBS의 25 ML을 추가하고 4 ℃에서 스윙 아웃 회에서 5 분 동안 300 XG에 튜브를 회전.
  14. 25 ML의 피펫을 이용하여 상층 액을 제거세포 펠렛 세척 단계를 두 번 더 반복한다. 마지막으로 15 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.
    : 최종 세척 단계 후에, 세포 현탁액을 (섹션 2 참조) cryopreserve하는 것이 가능하다.
  15. 혈구 세포 계수 챔버에 세포 현탁액 10 μL를 적용하고 현미경으로 세포 수를 계산. 세포의 적절한 양을 분배 (예, 2-3 X 107) 이후의 자성 비드의 분리를 위해 15 ml의 원심 분리 튜브에. 단계 3.2까지 얼음이 나누어 보관하십시오.

편도 세포의 2. 냉동 보존

  1. 냉동 매체 (90 % FBS 10 % DMSO)를 준비하고 얼음에 보관하십시오. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 냉동 보관 매체.
  2. 혈구 세포 계수 챔버 (단계 1.15)를 이용하여 세포의 수를 결정한다. 냉동 원하는 세포 밀도에 따른 동결 배지의 요구량을 계산한다 (예를 들어, 107 셀S 동결 배지 / ㎖).
  3. 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 경사 분리하고 (단계 2.1) 빙냉 동결 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
  4. 액체 질소에 장기 저장을 위해 설계 멸균 바이알에 세포 현탁액을 1 ml의 분취 량을 분배. 이소프로판올 실에서 튜브를 동결 및 -80 ° CO / N에 저장합니다. 장기 보존을위한 저장 탱크 또는 -140 ° C 세포를 함유하는 냉동 액체 질소로 튜브를 옮긴다.
  5. 냉동 세포와 튜브를 해동, 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 그들을 따뜻하게. 해동시 바로, (보충제 단계 1.1) 예열 된 HBSS 10 ㎖에 균체 현탁액을 분산 15ml를 원심 분리 관에. (단계 1.1, 보충제), 5 분 동안 300 XG에 스핀 HBSS 튜브를 제거하고 HBSS에서 원하는 세포 밀도에서 세포 펠렛을 재현 탁.
    참고 : 다국적 기업의 AF의 가능성을터 해동은 사균의 존재 정제 된 B 및 T 림프구의 최종 수율이 감소하기 때문에, 중요하다.
    : 세포 분리 효율을 감소시킬 것이다 세포 생존율이 80 % 이하 후 경험하는 방법.

편도 다국적 기업에서 T 림프구 인구 3. 긍정적 인 선택

주 1 :이 프로토콜은 CD3 항체에 결합 된 자성 비드를 이용하여 편도 다국적로부터 인간 CD3 + T 림프구의 포지티브 선택에 기초한다. 그것은 신선한 (1 절) 또는 냉동 (제 2) 다국적 기업에서이 부분을 시작하는 것이 가능하다.

주 2 : 3 × 10 7 다국적 기업과 함께 시작합니다. 분리 컬럼은 막힐 수 있고, 이는 분리 효율을 줄일 수 있기 때문에,이 세포의 수를 초과하지 않는다. 이상의 셀이 처리 될 경우 더 큰 열을 사용합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 양을 실험적 우리 세포의 수에 대해 최적화 된우리의 실험 설정에서 에드.

  1. 분리 완충액 [PBS (PH 7.2), 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM EDTA]를 준비한다. 4 ° C에서 0.45 μm의 필터와 저장소를 통해 분리 버퍼를 필터링합니다.
  2. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 다국적 기업 서스펜션 (단계 1.14)를 스핀. 빙냉 분리 완충액 240 μL로 얻어진 세포 펠렛 (107 세포 당 80 μL)을 재현 탁. 멸균 2 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
  3. 셀 솔루션 CD3 자기 항체의 20 μl를 추가합니다. 서스펜션에 세포를 유지하기 위해 지속적으로 부드러운 혼합하여 4 ℃에서 1 시간 동안 튜브를 품어.
  4. 세포를 세척하기 위해 5 ㎖ 빙냉 분리 완충액을 함유하는 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 모두 전송할.
  5. 스윙 아웃 회에서 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 튜브를 원심 분리기.
  6. 한편 자기 분리기 및 열을 설정합니다. 스탠드에 자기 분리기를 부착하고 separ에 열을 배치ATOR. 빙냉 분리 완충액 500 μL를 적용하여 컬럼을 세척 하였다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
  7. 열 아래에 새 15 ml의 수집 튜브를 놓습니다. 얼음에 포집 관을 유지합니다.
  8. 피펫으로 상층 액 (단계 3.5)을 폐기하고 부드럽게 500 μL 분리 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁. 사전 세척 칼럼의 상단에있는 세포 현탁액을 적용하고 그것을 통해 실행하자.
    : 세포 덩어리가 열을 막히게함으로써 유량을 감소시킬 수있다. 이 문제를 방지하기 위하여, 컬럼의 상단에 40 μm의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다. 이 메쉬를 통해 셀을 통과하는 고도로이 방법의 효율성을 향상시킬 것이다.
  9. 분리 버퍼의 1.5 ㎖ (10 7 세포 500 μL)으로 열을 4 회 반복한다. 다음 세척 단계를 적용하기 전에 (어떤 액체가 열에서 관찰 될 수 없습니다) 비어있는 열 저장 기다립니다.
    주 : B 림프구 분획으로서 간주 CD3 표지 된 세포를 얻는, 그들이 그대로포집 관에 용출.
  10. 새로운 15 ml의 수집 관에 분리 및 장소에서 열을 제거합니다. 피펫 컬럼 상 분리 완충액 2 ㎖. T 림프구의 비율로 간주된다 긍정적 선택된 T 림프구를 용출 컬럼 공급 플런저 사용.
  11. 정제 세포 (단계 1.15) 필요한 경우의 수를 결정합니다. 세포 현탁액은 지금 하류 실험에 대한 준비가되어 있습니다.

절연 4. 유동 세포 계측법 분석 편도 B와 T 림프구

주의 : 파라 포름 알데히드 용액을 자극 의심되는 발암 물질이다. 적절한 보호 복, 보호 장갑과 눈 / 안면 보호구를 착용 할 것.

주 1 :이 프로토콜은 (FACS) 분석 정리 형광 활성화 된 세포에 의해 격리 된 B 및 T 세포의 염색을위한 직접적인 방법을 설명한다. 이 단계의 주요 목적은 인구 AF를 격리 세포의 순도를 평가하는 것이다터 CD3 자기 항체 분리. 이 목적을 확립 B 및 T 세포 마커에 대해 형광 공역 모노클로 날 항체 및 CD20-FITC CD2-APC가 사용된다. 또한 이소 제어 항체 포함 높게 CD2 및 CD20 항체 (단계 4.8 참조)의 결합 비특이적 "배경"을 구별 할 것을 권장한다.

2 주 : 염색 할 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드에 어둠 속에서 (PFA) 솔루션을 정제 된 세포 분획을 유지할 수있다 (예를 들면, 다음 날.). 염색 및 FACS 분석 간의 시간 간격이있는 경우에도 동일한 방법을 적용한다. 두 경우 모두에서 세포가 PBSA 염색 또는 FACS 분석하기 전에 버퍼 (PBS가 0.2 % BSA를 포함) 제대로 세척해야 함을 기억하십시오.

  1. 단계 3.10에서 단계 3.9와 T 림프구 분획에서, B 림프구 분율 (이전 컬럼에 적용하기) 단계 1.15에서 다국적 기업의 6 × 10 6 세포를 꺼내.
  2. 세포를 스핀스윙 아웃 로터를 사용하여 4 ℃에서 5 분 300 XG에 현탁액.
  3. 피펫으로 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 PBSA 1 ㎖로 한번 세포 펠렛을 세척 하였다. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고를 재현 탁 얼음처럼 차가운 PBSA 버퍼 600 μL 세포.
  4. FACS 튜브의 바닥에 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다.
  5. PBS는 각 튜브에 10 %의 열 불 활성화 된 인간 혈청을 포함하는 100 μl를 추가, 잘 섞어 ~ 실온에서 1 분 또는 얼음에 20 분 동안 품어.
    참고 : B 림프구가 된 Fc 수용체를 실시한다. 된 Fc를 차단하기 위해 정제 된 세포 분획을 10 % 열 불 활성화 인간 혈청과 함께 인큐베이션 수용체. 인간 혈청을 1 시간 동안 56 ℃에서 배양함으로써 열 불 활성화이다. -20 ℃에서 냉동 작은 분량 씩 저장에 열 불 활성화 혈청을 나눈다.
  6. 자상 한 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기보내고 아웃 로터.
  7. 피펫으로 상층 액을 제거하고 1 ml의 PBSA와 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리 (4 ℃에서 5 분 300 XG)를 반복합니다.
  8. 얼음에 각각의 튜브에 100 μL PBSA를 추가합니다. 제조자의 권고에 따라, 형광 공역 단클론 항체의 적절한 양을 추가 (예컨대, 항 -CD20 20 μL 및 / 또는 PBSA 100 ㎕의 항 - CD2 항체의 5 μL). 참고 : FACS 분석을위한 충분한 제어 튜브를 할당하는 것을 잊지 마십시오. 이 프로토콜에서 다음 컨트롤 포함한다 : 개별적 안티 CD2 및 항 CD20 항체로 염색 1) 세포를 첨가하지 않은 개별 안티 CD2 및 항 CD20 아이소 타입 컨트롤 항체 및, 3) 세포 염색 2) 세포 항체.
  9. 간단히 튜브 와동과 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
  10. PBSA와 함께하는 과정을 2 회 반복한다. 샘플 1 % PFA 용액 2 ㎖를 추가합니다. 셀 4에서 PFA 용액에 남아 있도록76; FACS 분석시까지 어두운 C.
  11. 즉시 외과 기계에서 샘플을 실행하기 전에, (4 ℃에서 5 분 동안 300 XG)를 PBSA와 셀을 2 회 반복한다. 1 ㎖의 PBS와에 재현 탁 샘플은 이전의 흐름 cytometer의 분리, 빛으로부터 보호, 4 ° C (또는 얼음)하시오.
  12. 제조업체 흐름 cytometer에서 프로토콜 다음 FACS 정렬 작업을 수행합니다.

고립 된 편도 B와 T 림프구에서 아데노 바이러스의 DNA 5. PCR 검출

주 1 : 아데노 hexon 유전자 AdRJC1 프라이머 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ')이고 AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. 이 프라이머는 139 BP의 증폭 물을 생성한다. 호스트 18S rRNA 유전자는 프라이머 tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') 및 tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3')로 검출 할 수있다. 예상 amplicon의 크기는 300 BP이다.

주 2 : 모든 PCR실행은 음성 대조군 (증류수 H 2 O) 및 인간 아데노 바이러스 5 형 (12)에 감염된 인간 B 세포주 (BJAB)로부터 얻어지는 포지티브 컨트롤 DNA를 포함한다.

  1. 실리카 막 기반 열 정화 방법을 사용하여 (최소 1 × 10 6 세포 단계 3.11에서) DNA를 추출합니다. 페놀 및 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 솔루션 (13)를 사용하여 RNA를 추출합니다.
  2. 1X HF 완충액, 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트 믹스 0.2 밀리미터 (의 dNTP), 0.25 각 프라이머 μM 및 20 ㎕의 총 부피에서 고성능 DNA 중합 효소 1 U를 함유하는 반응 혼합물 B 및 T 림프구로부터 100ng의 DNA를 추가한다.
  3. 다음 사이클의 조건에서 PCR 증폭을 수행 10 초, 67 ° C (hexon) 또는 58 ° C (18S rRNA의) 30 초 72 ° C 98 ° C의 30주기 다음 98 ℃에서 30 초 변성, 30 초 동안. PCR 반응은 72 ℃에서 7 분의 최종 신장 단계를 종료 하였다.
  4. 결과의 PCR 충전 앰프를 분리1X TBE에서 1.5 % 아가 로스 겔상에서 주시죠 제품 버퍼 핵산 염색으로 염색하여 예상 밴드를 시각화.

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Representative Results

B와 T 림프구의 고순도 소집단에서 편도 다국적 결과의 효율적인 분리. 이는 B 및 T 림프구 집단 각각 (도 3a)을 검출하기 위해 항 -CD20 및 항 CD2 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인 하였다. 한편, B 및 T 림프구 아 집단 (도 3b) 모두에서 세포의 혼합물이다 세포 분획 다국적 결과 비효율적 분리.

절연 편도의 B 및 T 림프구 (도 3A) 핵산 분리 등 하류 분석을위한 충분한 품질의이다. 현재 프로토콜에서 DNA와 RNA는 B로부터 추출 및 T 림프구 아데노 바이러스 DNA 및 세포 RN​​A의 검출에 이용된다. 결과는 편도 T 림프구에서 아데노 바이러스 DNA의 특정 검출을 (그림 4)를 보여줍니다. 편도 B와 T 림프구에서 또한 고립 된 RNA를 downstrea 충분한 질과 양입니다 M 응용 프로그램 (그림 5).

그림 1
도 편도 림프구 분리 절차 1. 개관. 팔라티노 편도선 샘플 처리되고 편도 다국적는 밀도 구배 원심 분리에 의해 세포 현탁액으로부터 분리된다. B와 T 림프구는 인간 CD3 자기 항체와 T 림프구 분획의 긍정적 인 선택에 의해 소집단으로 정제된다. 이 정제 단계는 상기 격리 된 세포 분획을 평가하는 것을 가능하게한다; 일부 바이러스 종 개체군의 내 농축하는 경우 예를 들어, 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 수술 구개 편도를 제거했습니다. 편도 (왼쪽)와 tonsillotomy (오른쪽)에 의해 제거 편도선을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
풍부한 세포 분획의 그림 3. 대표 외과 결과. (A) 앞으로 편도 다국적 기업, T 림프구 및 유출 물 분수에서 측면 산점도 보여주는 B (CD20)와 T (CD2) 림프구 인구 대. 농축 된 세포 분획에서 T 및 B 림프구의 순도는 90 % 이상이다. B 세포는 총 유출 세포의 92 %를 포함 할 수 있기 때문에,이 부분은 B 림프구의 하위 집단으로 지정됩니다. (B) FACS 플롯 B 및 T 세포의 비효율적 SUBP 분리를 도시때문에 열 불충분 한 세척 단계에 적용 다국적 기업의 최적화되지 않은 번호로 opulations. / CD20 - -을 제외하고 자기 활성화 된 셀이 최적화를 정렬의 필요성에서, CD2의 높은 배경이있다. 세포, 외과 염색이 잘 최적화되지 않았 음을 보여줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
편도 림프구 분획에서 아데노 바이러스 DNA의 PCR도 4 검출. 총 DNA는 B로부터 추출되고, T 림프구는 환자 확관 편도선에서 왼쪽과 오른쪽 편도선으로부터 분리. 엔드 포인트 PCR을 정제 된 DNA 100 ng를 수행한다. 레인 1 : 왼쪽 편도선 B 림프구의 분획 (B); 레인 2 : LEF의 T 림프구 분획 (T)T 편도; 레인 3 : 편도선 오른쪽의 B 림프구 분획 (B); 레인 4 : 오른쪽 편도선의 T 림프구의 비율 (T). 아데노 바이러스 (AD) DNA 격리 T 림프구 분획에서만 검출 가능하다. 내부 통제와 같은 셀룰러 18S rRNA 유전자의 역할은 DNA의 같은 양의 모든 샘플에서 PCR 반응에 사용되는 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
절연 B 및 T 세포 아 집단으로부터 추출도 5 고품질 RNA. 절연 B 및 T 림프구로부터 추출한 총 세포질 RNA는 1 % 아가 로스 겔상에서 분리 하였다. 레인 1 : 왼쪽 편도선 B 림프구의 분획 (B); 레인 2 : 좌측 편도선의 T 림프구 분획 (T); 레인 3 : 편도선 오른쪽의 B 림프구 분획 (B); 레인 4 :오른쪽 편도선의 T 림프구의 비율 (T). 28S rRNA의 마이그레이션 패턴, 18S rRNA의 작은 RNA가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜의 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 출발 물질로서 신선한 편도 물질의 사용이다. 따라서, 편도선 샘플은 수술 후 3 시간 이내에 처리해야한다. 편도선은 어른과 어린이 모두에서 얻을 수있다. 어린이에서 편도 물질로 인해 편도선 (tonsillotomy)의 부분 제거 수술에 일반적으로 작다. 따라서, 다국적의 수가 적은 편도선 샘플 (1 × 10 8 -2 × 109)과 비교된다 tonsillotomy 샘플 (1 × 10 7 × 10 -1 8)로부터 획득. 그러나, 세포 분리 과정없이 수술의 종류와 동일한 것이다.

방법을 정렬 자기 활성화 된 세포에서 얻은 세포 개체군의 순도를 극대화 약간의 최적화가 필요합니다. 자기 CD3 항체 량 및 인큐베이션 시간과 열에 적용 다국적의 수는 선택되어야 주요 요인imized. 너무 많은 셀을 적용하면 열 및 세포 개체군의 비효율적 인 농축의 막힘 발생합니다. 이 프로토콜의 최적화 동안, 우리는 분리 컬럼에 이상 3 × 10 7 다국적 기업을 적용하는 열 이후의 불순한 세포 분수 (그림 3B)의 막힘의 원인이됩니다 것을 발견했다. 따라서, 3 × 10 7 다국적 기업으로 시작하여 DNA와 RNA 추출을위한 충분한 품질과 수량도 풍부한 림프구 분획 제공합니다 (그림 4, 5). 절연 B와 T 림프구의 수는 최종 각각 1-2 X 107 및 5-7 × 106이 될 것으로 예상된다. 따라서, 3 × 10 7 다국적 기업 당 CD3 자기 항체의 20 μL의 사용은 성공적으로 B와 T 림프구 분리 (그림 3A)에 대한 최적의 것으로 보인다.

이전 보고서는 B와 T 림프구가 다른 동안, 각각 60~70% 및 편도 다국적 기업 30 ~ 40 %로 포함하는 것을 설립대 식세포와 같은 종류의 세포, 자연 살해 세포와 수지상 세포는 편도 다국적 기업 (14) 1-8 %를 차지. FACS 기술 (도 3a)와 B와 T 림프구의 면역 염색에 의해 도시 된 바와 같이, 유사한 세포가 우리의 비율 분리 프로토콜에 의해 달성 하였다.

세척 단계의 수와 세척 완충액 용적은 좋은 결과에 대한 중요한 파라미터이다. 따라서, 과잉 세척이 불충분 세척 T 세포 분획의 순도를 감소하는 반면 자기 CD3 항체 관련 T 세포가 관류에서 종료 될 것이다.

프로토콜의 중요한 단계는 조직 유형 및 기대 하류 분석에 대해 최적화되면,이 방법은 간단하고 효율적이고 간단하고 시간이 절약된다. 그러나이 방법의 하나의 제한은 tonsilla 대규모 정제를 제한 할 수있는 상용 자기 - 정렬 연관된 셀 시약의 상대적으로 높은 비용은이며R B와 T 림프구.

요약하면이 프로토콜은 구개 편도선에서 B와 T의 소집단을 얻기위한 전략을 제공하고, 비장, 흉선, 림프절 및 혈액과 같은 다른 조직에서 세포 분획을 분리하도록 수정 될 수 있습니다. 우리는 또한 우리는 편도 T 세포 부분에서 구체적으로 (그림 4) 아데노 바이러스 감염을 감지 것을 보여주기 위해이 방법을 적용 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 호스트 병원체 상호 작용, T 세포의 세포 독성 T 세포 활성화, 세포 신호와 B 및 T 세포 표면 마커의 발현에 관한 연구를 포함하여 애플리케이션의 광역에 유용해야한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

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References

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