Effektiv Isolation Protokol for B og T lymfocytter fra Human Palatine tonsiller

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Protokollen beskriver isoleringen af ​​lymfoide celler fra human patient materiale og kræver derfor en etisk godkendelse. Arbejdet i den foreliggende undersøgelse blev ydet af Uppsala Etiske Review Board (DNR. 2013/387).

1. Isolering af mononukleære celler (MNCs) fra humane ganetonsiller

ADVARSEL: Alle uskærmede materiale af human oprindelse som blod, væv eller kropsvæsker bør betragtes som potentielt inficeret materiale. Derfor bør anbefalede biosikkerhed praksis for håndtering af humane væv skal følges.

Bemærk: For at undgå forurening, skal alle løsninger og cellekultur udstyr være sterile. Alle buffere og opløsninger skal præ-afkølet og opbevares på is. Tonsil væv og isolerede celler skal opbevares og håndteres på is.

  1. Opnå friske mandler fra patienter, der gennemgår tonsillektomi eller tonsillotomy (figur 2). Plunge vævet Clumps i et 50 ml centrifugerør fyldt med iskold steril Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM glutamin, 0,05 mg / ml gentamicin og 1% Antibiotika-antimykotisk mix (Penicillin, streptomycin og amphotericin B).
  2. Hold rørene med de neddykkede tonsil vævsprøver på alle tidspunkter på is. Prøv at behandle mandlerne så hurtigt som muligt, og ikke senere end 3 timer efter kirurgisk fjernelse.
  3. Placer tonsil på en 60 mm plastik cellekultur plade på is og holde vævet fugtet med HBSS. Fjern synlige blodpropper, fede og bindevæv med en ren pincet fra tonsil overflade.
  4. Brug en ny 60 mm cellekultur plade indeholder 5 ml HBSS. Skær tonsil væv klump i 3-10 mm fragmenter under anvendelse af en steril saks og / eller en skalpel.
  5. Forbered en ny 60 mm cellekultur plade indeholdende 10 ml HBSS og placere en 100 um plastik cellefilter i HBSS løsning.
  6. Overfør dissected tonsil fragmenter ind i cellesigte med en steril pincet. Brug af stemplet enden af ​​en plastsprøjte, glat presse vævsfragmenterne gennem cellesigte. Sørg for, at tonsil fragmenter helt nedsænket i HBSS.
  7. Kassér cellesigte med resterne væv og overføre den resulterende cellesuspension fra 60 mm celledyrkningspladen i en 50 ml centrifugerør af plastic. Efterlad røret på is, mens der fortsættes med trin 1.8 og 1.9.
  8. I tilfælde af store mandler, større end 2 cm i størrelse (figur 2), presse tonsil fragmenter i to celle sier for at undgå tilstopning af maskerne i sien.
  9. Opnå den endelige volumen på 35 ml af cellesuspensionen.
    Bemærk: På dette trin er det muligt at forberede celle suspension kryopræservering (se afsnit 2).
  10. Der tilsættes 10 ml densitetsgradient opløsning, såsom Ficoll ind i en ny 50 ml centrifugerør. Forsigtigt overlay cellen suspension (trin 1.9) oven på densitetsgradient løsning. Undgå at blande af cellesuspensionen og densitetsgradient løsning.
    Bemærk: densitetsgradient løsning skal være varmet op til stuetemperatur.
  11. Centrifuger cellesuspensionen i en swing-out-rotor ved 700 xg i 20 minutter ved stuetemperatur. Du må ikke aktivere bremsen funktionen på centrifugen så hurtig bremsning kan forstyrre gradienten. Brug også den laveste acceleration funktionen tilgængelig på centrifugen.
    Bemærk: Efter dette centrifugeringstrin observere MNCs som et fnugget hvidt lag på grænsefladen, og røde blodlegemer (RBC), fibroblaster og cellerester som sedimentet på bunden af røret.
  12. Indsamle forsigtigt MNCs lag ved anvendelse af en 10 ml pipette. Placer cellesuspensionen i en ny 50 ml centrifugerør.
  13. Tilsæt 25 ml iskold PBS til cellesuspensionen og spin røret ved 300 xg i 5 minutter i en swing-out-rotor ved 4 ° C.
  14. Fjern supernatanten under anvendelse af en 25 ml pipetteog gentag cellepelleten vasketrin to gange mere. Endelig resuspender cellepelleten i 15 ml PBS.
    Bemærk: Efter den sidste vask trin, er det muligt at kryopræservere cellesuspensionen (se afsnit 2).
  15. Anvend 10 pi cellesuspension i hæmocytometer celle tællekammer og tælle antallet af celler under et mikroskop. Dispensere en passende mængde af celler (f.eks 2-3 x 10 7) i et 15 ml centrifugerør til efterfølgende separationsteknologi med magnetiske perler. Hold dette portion på is indtil trin 3.2.

2. Kryopræservering af tonsillær Cells

  1. Forbered frysning medium (90% FBS og 10% DMSO) og holde den på is. For langtidsopbevaring holde frysemedium ved -20 ° C.
  2. Bestemme det samlede antal af celler under anvendelse af et hæmocytometer celletælling kammer (trin 1.15). Beregn den nødvendige mængde frysemedium ifølge den ønskede frosne celledensitet (fx 10 7 cellers / ml frysemedium).
  3. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 xg i 5 minutter. Dekanteres uden at forstyrre cellepelleten og resuspender cellepelleten i iskold frysemedium (fra trin 2.1).
  4. Der afpipetteres 1 ml alikvoter af cellesuspensionen i sterile hætteglas er beregnet til langtidsopbevaring i flydende nitrogen. Frys hætteglassene i en isopropanol kammeret og gemme dem ved -80 ° CO / N. Til langsigtet bevaring overføre hætteglassene i en flydende nitrogen indeholder lagertank eller en -140 ° C celle fryser.
  5. At tø hætteglas med frosne celler, varme dem hurtigt i et 37 ° C vandbad. Umiddelbart når optøet, sprede cellesuspensionen i 10 ml forvarmet HBSS (med kosttilskud, trin 1.1) i en 15 ml centrifugerør. Spin røret ved 300 xg i 5 minutter, fjern HBSS og resuspender cellepelleten ved den ønskede celledensitet i HBSS (med kosttilskud, trin 1.1).
    Bemærk: levedygtighed multinationale selskaber AFter optøning er af betydning, idet tilstedeværelsen af ​​døde celler vil falde det endelige udbytte af oprenset B- og T-lymfocytter.
    Bemærk: Ifølge vores erfaring levedygtighed celle mindre end 80% vil reducere celleisolering effektivitet.

3. Positiv Udvælgelse af T lymfocytpopulationen fra tonsillar MNC'er

Note 1: Denne protokol er baseret på positiv selektion af humane CD3 + T-lymfocytter fra mandelekstrakter MNCs anvendelse af magnetiske perler koblet til CD3-antistof. Det er muligt at starte dette afsnit fra frisk (afsnit 1), eller de frosne (afsnit 2) multinationale selskaber.

Note 2: Begynd med 3 x 10 7 MNC'er. Ikke overstige denne celleantal, idet separationskolonnerne kan tilstoppe, og det vil reducere isolation effektivitet. Brug større kolonner, hvis flere celler vil blive behandlet. De i denne protokol mængder er blevet eksperimentelt optimeret til antallet af celler osed i vores forsøgsopstillingen.

  1. Forbered adskillelse buffer [PBS (pH 7,2), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2mM EDTA]. Foretage adskillelse buffer gennem et 0,45 um filter og opbevares ved 4 ° C.
  2. Spin MNC'er suspension (trin 1.14) ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender den resulterende cellepellet i 240 pi (80 pi pr 10 7 celler) iskold puffer separation. Overfør cellesuspensionen i en steril 2 ml rør.
  3. Tilsæt 20 pi CD3 magnetiske antistof til celleopløsningen. Inkuber rørene i 1 time ved 4 ° C med kontinuerlig forsigtig blanding for at holde cellerne i suspension.
  4. Overfør hele af cellesuspensionen i et 15 ml rør indeholdende 5 ml iskold puffer adskillelse for at vaske cellerne.
  5. Centrifugeres røret ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C i en udsvingsrotor.
  6. I mellemtiden oprettet den magnetiske separator og kolonne. Fastgør den magnetiske separator til stativet og placer kolonne i separator. Kolonnen udvaskes ved at anvende 500 pi iskold buffer separation. Kassér gennemstrømningen.
  7. Placere en ny 15 ml opsamlingsrør under kolonnen. Hold opsamlingsrøret på is.
  8. Supernatanten (trin 3.5) med pipette og forsigtigt resuspender cellepelleten i 500 pi adskillelse buffer. Anvend cellesuspensionen oven på forvasket kolonne og lade den køre igennem.
    Bemærk: Celleklumper kan tilstoppe søjlen og dermed reducere strømningshastigheden. For at undgå dette problem ved at placere en 40 um si plast celle på toppen af ​​søjlen. At lade cellerne passere gennem denne maske vil meget forbedre effektiviteten af ​​denne metode.
  9. Kolonnen udvaskes 4 gange med 1,5 ml puffer adskillelse (500 pi for 10 7 celler). Vent på kolonnen reservoiret at være tom (skal observeres ingen væske i kolonnen) før påføring af næste vasketrin.
    Bemærk: Få CD3 umærkede celler, betragtes som B-lymfocyt fraktion, som de erelueret i opsamlingsrøret.
  10. Fjern kolonnen fra separatoren og anbringes i en ny 15 ml opsamlingsrør. Der afpipetteres 2 ml adskillelse buffer på søjlen. Brug af stemplet leveres med søjlen elueres positivt selekterede T-lymfocytter, der betragtes som T-lymfocyt-fraktionen.
  11. Bestemme antallet af oprensede celler (trin 1.15) om nødvendigt. Cellesuspensioner er nu klar til efterfølgende eksperimenter.

4. flowcytometri Analyse af Isoleret Tonsillær B og T-lymfocytter

ADVARSEL: Paraformaldehyd løsning er lokalirriterende og mistænkt kræftfremkaldende. Bær passende beskyttelsesdragt, handsker og øjen- / ansigtsbeskyttelse.

Note 1: Denne protokol beskriver metoden til direkte farvning af isolerede B- og T-celler ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse. Hovedformålet med dette trin er at vurdere renheden af ​​det isolerede cellepopulationer AFter CD3 antistof magnetiske separation. Til dette formål blev B- og T-cellemarkører, fluorofor-konjugerede monoklonale antistoffer CD20-FITC og CD2-APC, anvendes. Anbefales også at medtage isotypekontrolantistoffer at skelne den ikke-specifikke "baggrund" binding af CD2 og CD20 antistoffer (se trin 4.8).

Note 2: Det er muligt at holde de oprensede cellefraktioner i en 1% paraformaldehyd (PFA) opløsning i mørke ved 4 ° C indtil tidspunktet for farvning (f.eks næste dag.). Også den samme procedure anvendes, hvis der er en tidsforskel mellem farvning og FACS-analyse. Husk, at celler i begge tilfælde skal vaskes ordentligt med PBSA (PBS indeholdende 0,2% BSA) buffer, før farvning eller FACS-analyse.

  1. Tag 6 x 10 6 celler af multinationale selskaber fra trin 1,15 (før påføring på søjlen), B-lymfocyt fraktion fra trin 3.9 og T-lymfocyt fraktion fra trin 3.10.
  2. Spin cellensuspensioner ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C under anvendelse af en swing-out-rotor.
  3. Fjern supernatanten med pipette og vaskes cellepelleten gang med 1 ml iskold PBSA. Spin cellesuspensionerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten med pipette og resuspender celler i 600 pi iskold buffer. PBSA
  4. Tilsættes 100 pi af cellesuspensionen til bunden af ​​en FACS rør.
  5. Tilsæt 100 pi PBS indeholdende 10% varmeinaktiveret humant serum til hvert rør, bland godt og inkuber i ~ 1 min ved stuetemperatur eller 20 minutter på is.
    Bemærk: B-lymfocytter bærer Fc-receptorer. For at blokere Fc-receptorer de oprensede cellefraktioner inkuberes med 10% varmeinaktiveret humant serum. Det humane serum varmeinaktiveres ved inkubering ved 56 ° C i 1 time. Opdele varmeinaktiveret serum i små portioner og opbevares nedfrosset ved -20 ° C.
  6. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C i en swing-out rotor.
  7. Fjern supernatanten med pipette og vask cellepelleten med 1 ml PBSA. Gentag centrifugering (300 x g i 5 minutter ved 4 ° C).
  8. Tilsæt 100 pi PBSA i hvert rør på is. Tilsæt en passende mængde fluorofor-konjugeret monoklonalt antistof, ifølge producentens anbefaling (f.eks 20 pi anti-CD20 og / eller 5 pi anti-CD2-antistoffer i 100 pi PBSA). Bemærk: Glem ikke at tildele tilstrækkelig kontrol rør for FACS-analyse. I denne protokol de følgende kontroller skal indgå: 1) celler farvet med anti-CD2 og anti-CD20 antistoffer individuelt, 2) celler farvet med anti-CD2 og anti-CD20 isotypekontrol antistoffer individuelt og, 3) celler uden tillæg af antistoffer.
  9. Kort fortalt vortexes røret og inkuber i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
  10. Vask 2 gange med PBSA. Tilsæt 2 ml 1% PFA løsning på prøverne. Lad cellerne forbliver i PFA opløsning ved 476; C i mørke indtil tidspunktet for FACS-analyse.
  11. Umiddelbart før kører prøverne i FACS-maskine, vaskes cellerne 2 gange med PBSA (300 x g i 5 minutter ved 4 ° C). Resuspender prøver i 1 ml PBS og holde ved 4 ° C (eller på is), beskyttet mod lys, forud for separation på flowcytometeret.
  12. Gør FACS sortering efter protokollen fra flowcytometeret producenten.

5. PCR Påvisning af adenovirus DNA i isolerede Tonsillær B og T-lymfocytter

Note 1: De adenovirus hexon gen primere er AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') og AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Disse primere generere en amplikon af 139 bp. Værten 18S rRNA-genet kan påvises med primere tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') og tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Den forventede amplikonstørrelse er 300 bp.

Note 2: Hver PCRløb omfatter en negativ kontrol (destilleret H2O) og en positiv DNA-kontrol opnået fra human B-cellelinie (BJAB) inficeret med human adenovirus type 5 12.

  1. Uddrag DNA (fra mindst 1 x 10 6 celler, trin 3.11) ved hjælp af silicamembranen baseret kolonne oprensningsmetode. Uddrag RNA under anvendelse af phenol og guanidinisothiocyanat opløsning 13.
  2. Tilføj 100 ng DNA fra B- og T-lymfocytter til en reaktionsblanding indeholdende 1 x HF-buffer, 0,2 mM af deoxynukleotidtriphosphat mix (dNTP), 0,25 uM af hver primer og 1 U af High-Fidelity DNA-polymerase i et totalt volumen på 20 pi.
  3. Udfør PCR-amplifikation under de følgende cyklusbetingelser: 30 sek denaturering ved 98 ° C, efterfulgt af 30 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 67 ° C (hexon) eller 58 ° C (18S rRNA) i 30 sek og 72 ° C i 30 sek. PCR-reaktionen blev afsluttet med en endelig forlængelse trin med 7 min ved 72 ° C.
  4. Adskil resulterende PCR amplifgement produkter på en 1,5% agarosegel i 1 x TBE-buffer og visualisere de forventede båndene visualiseres ved farvning med nukleinsyre pletten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En effektiv separation af tonsillære MNCs resulterer i stærkt oprensede subpopulationer af B og T-lymfocytter. Dette blev bekræftet ved FACS-analyse under anvendelse af anti-CD20 og anti-CD2 antistoffer til påvisning B og T lymfocyt populationer, henholdsvis (figur 3A). I modsætning hertil en ineffektiv adskillelse af MNCs resulterer i cellefraktioner, der er en blanding af celler fra både B- og T-lymfocyt-subpopulationer (figur 3B).

Den isolerede tonsillar B- og T-lymfocytter (figur 3A) er af tilstrækkelig kvalitet til downstream analyser som nukleinsyre isolation. I den nuværende protokol, DNA og RNA ekstraheret fra B- og T-lymfocytter anvendes til påvisning af adenovirus DNA og cellulært RNA. Resultaterne viser specifik påvisning af adenovirus DNA i tonsillære T-lymfocytter (figur 4). Også isoleret RNA fra tonsillar B- og T-lymfocytter er af tilstrækkelig kvalitet og mængde for downstrea m applikationer (figur 5).

Figur 1
Figur 1. Oversigt over tonsillar lymfocytisoleringsmetoder procedure. Palatine tonsil prøver bearbejdes og tonsillære MNCs isoleres fra cellesuspensionen ved densitetsgradientcentrifugering. B- og T-lymfocytter oprenses i subpopulationer af en positiv selektion af T-lymfocyt fraktion med humane CD3 magnetiske antistof. Denne rensning trin gør det muligt yderligere at vurdere de isolerede cellefraktioner; for eksempel at afgøre, om nogle virale arter er beriget under et af de delpopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

jpg "/>
Figur 2. fjernes kirurgisk Palatine mandler. Mandler fjernet ved tonsillektomi (venstre) og tonsillotomy (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsentant FACS resultaterne af de berigede cellefraktioner. (A) Fremad vs. sidespredning plot viser B (CD20) og T (CD2) lymfocytpopulationer i tonsillar multinationale selskaber, T-lymfocyt og spildevand fraktioner. Renheden af ​​T- og B-lymfocytter i berigede cellefraktioner er mere end 90%. Da B-celler omfatter 92% af det totale udløb celler, er denne fraktion navngivet som B-lymfocyt subpopulation. (B) FACS plots viser ineffektiv adskillelse af B- og T-subPopulations, på grund af ikke-optimeret antal MNCs påføres søjlen og utilstrækkelige vasketrin. Bortset fra behovet for magnetisk cellesortering optimering, er der en høj baggrund af CD2 - / CD20 -. Celler, hvilket viser, at FACS-farvning ikke er godt optimeret venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. PCR påvisning af adenovirus DNA i tonsillære lymfocyt fraktioner. Totalt DNA ekstraheres fra B- og T-lymfocytter isoleret fra venstre og højre mandlerne fra en patient, der gennemgår tonsillektomi. Endepunkt PCR udføres med 100 ng af det oprensede DNA. Bane 1: B-lymfocyt fraktion (B) i venstre tonsil; bane 2: T-lymfocyt fraktion (T) af left tonsil; bane 3: B-lymfocyt fraktion (B), i den højre tonsil; bane 4: T-lymfocyt fraktion (T) af retten tonsil. Adenovirus (Ad) DNA er kun påvises i isolerede T-lymfocyt fraktion. Cellular 18S rRNA-genet fungerer som en intern kontrol at vise, at samme mængde DNA anvendes til PCR-reaktionen i alle prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Højkvalitets RNA ekstraheret fra isoleret B og T-celle subpopulationer. Total cytoplasmisk RNA ekstraheret fra den isolerede B- og T-lymfocytter blev separeret på en 1% agarosegel. Bane 1: B-lymfocyt fraktion (B) i venstre tonsil; bane 2: T-lymfocyt fraktion (T) af venstre tonsil; bane 3: B-lymfocyt fraktion (B), i den højre tonsil; bane 4:T-lymfocyt fraktion (T) af retten tonsil. Migration mønster af 28S rRNA, 18S rRNA og små RNA er indikeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En af de vigtigste faktorer, der påvirker resultatet af denne protokol er brugen af ​​friske tonsillar materiale som udgangsmateriale. Derfor bør tonsil prøver behandles inden 3 timer efter operationen. Mandler kunne fås fra både voksne og børn. Det tonsillar materiale fra børnene er normalt mindre på grund af den delvise kirurgisk fjernelse af mandler (tonsillotomy). Derfor er antallet af MNCs opnået fra tonsillotomy prøver (1 x 10 7 -1 x 10 8) er mindre i forhold til tonsillektomi prøver (1 x 10 8 -2 x 10 9). Imidlertid ville cellen isolation processen være den samme uanset typen af ​​kirurgi.

Maksimere renheden af ​​cellesubpopulationer opnået fra magnetisk cellesortering metode kræver en vis optimering. Mængden og inkubationstid med CD3 magnetiske antistof og antallet af MNCs påføres søjlen er de vigtigste faktorer, der bør vælgeimized. Anvendelse for mange celler vil resultere i tilstopning af søjlen og ineffektive berigelse af cellesubpopulationer. Under optimeringen af denne protokol, fandt vi, at anvende mere end 3 x 10 7 MNC'er på delingssøjlen vil forårsage en tilstopning af kolonnen og efterfølgende urene cellefraktioner (figur 3B). Således starter med 3 x 10 7 MNC'er giver godt berigede lymfocyt fraktioner med tilstrækkelig kvalitet og kvantitet for DNA og RNA-ekstraktion (figur 4 og 5). Det endelige antal isolerede B- og T-lymfocytter forventes at være 1-2 x 10 7 og 5-7 x 10 6 hhv. Således synes brugen af 20 pi CD3 magnetiske antistof pr 3 x 10 7 MNCs at være optimal for en vellykket B og T lymfocyt separation (figur 3A).

En tidligere rapport har fastslået, at B og T-lymfocytter omfatter 60-70% og 30-40% af de tonsillar multinationale selskaber henholdsvis mens andrecelletyper som makrofager, naturlige dræberceller og dendritiske celler udgør 1-8% af tonsillar MNCs 14. Lignende celle andele blev opnået med vores isolation protokol som vist ved immunfarvning af B- og T-lymfocytter med FACS-teknikken (figur 3A).

Antallet af vasketrin og vask buffervolumenet er kritiske parametre for et godt resultat. Som følge heraf vil forårsage overdreven vask CD3 magnetiske antistof associeret T-celler til at ende i gennemløbet, medens utilstrækkelig vask vil reducere renheden af ​​T cellefraktionen.

Når de kritiske trin i protokollen er optimeret til den vævstype, og de forventede downstream analyser, denne metode er enkel, effektiv, ligetil og tidsbesparende. Men en begrænsning af denne fremgangsmåde er et relativt høje pris på kommerciel magnetiske-associeret celle sortering reagenser, som kunne begrænse oprensning i stor målestok af tonsillaRb og T-lymfocytter.

Sammenfattende denne protokol giver en strategi for at opnå B- og T-subpopulationer fra Palatine mandler og kan modificeres til at isolere cellefraktioner fra andre væv som milt, thymus, lymfeknuder og blod. Vi yderligere anvende denne metode til at vise, at vi registrerer en adenovirusinfektion specifikt i fraktionen tonsillar T-celle (Figur 4). Således bør denne protokol være nyttig for en wide-area af applikationer, herunder undersøgelser af værtspatogene interaktioner, T-celle-cytotoksicitet, T-celleaktivering, cellesignalering og B og T celleoverflademarkør ekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics