Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Immunology and Infection

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Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

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Abstract

Protocol

Il protocollo descrive l'isolamento di cellule linfoidi dal materiale umano paziente e richiede quindi l'approvazione etica. Il lavoro svolto in questo studio è stata concessa dalla Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387).

1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da umani Palatine Tonsille

ATTENZIONE: Tutto il materiale non schermati di origine umana come sangue, tessuti o fluidi corporei dovrebbe essere considerato come materiale potenzialmente infetto. Pertanto, pratiche di biosicurezza consigliate per la manipolazione dei tessuti umani devono essere seguite.

Nota: Per evitare contaminazioni, tutte le soluzioni e le attrezzature colture cellulari devono essere sterili. Tutti i tamponi e le soluzioni devono essere pre-raffreddati e tenuti in ghiaccio. Tessuti di tonsille e cellule isolate dovrebbero essere tenuti e gestiti su ghiaccio.

  1. Ottenere tonsille fresche da pazienti sottoposti a tonsillectomia o tonsillotomia (Figura 2). Tuffatevi la Clum tessutips in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una soluzione sterile Hanks equilibrata sale ghiacciata (HBSS) supplementato con siero fetale bovino al 5% (FBS), glutammina 10 mM, 0,05 mg / ml di gentamicina e 1% mix antibiotici contro funghi (Penicillina, streptomicina e amfotericina B).
  2. Tenere le provette con i campioni di tessuto tonsille sommersi in ogni momento sul ghiaccio. Provare per elaborare le tonsille nel più breve tempo possibile, e comunque entro 3 ore dopo la rimozione chirurgica.
  3. Posizionare la tonsilla su una cella di plastica piastra di coltura 60 millimetri su ghiaccio e mantenere il tessuto inumidito con HBSS. Rimuovere coaguli di sangue visibili, adiposo e tessuto connettivo con una pinza pulita dalla superficie tonsille.
  4. Utilizzare una nuova piastra di coltura cellulare 60 millimetri contenente 5 ml di HBSS. Tagliare il ciuffo tessuto tonsillare in 3-10 frammenti mm utilizzando un paio di forbici sterili e / o un bisturi.
  5. Preparare una nuova piastra di coltura cellulare 60 mm contenente 10 ml di HBSS e posizionare un colino plastica cella 100 micron nella soluzione HBSS.
  6. Trasferire i dissframmenti tonsillari rifletteva nel colino cella con una pinza sterile. Usando l'estremità stantuffo di una siringa di plastica, uniformemente spremere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cella. Assicurarsi che i frammenti tonsillari sono totalmente immersi nel HBSS.
  7. Eliminare il filtro cella con i resti di tessuto e trasferire la sospensione cellulare risultante dalla piastra di coltura cellulare 60 mm in un tubo di plastica da 50 ml centrifuga. Lasciare la provetta in ghiaccio mentre si procede con passo 1.8 e 1.9.
  8. Nel caso di grandi tonsille, più grande di 2 cm (Figura 2), spremere i frammenti tonsille in due filtri cellulari per evitare l'intasamento della rete nel filtro.
  9. Ottenere il volume finale di 35 ml di sospensione cellulare.
    Nota: A questo punto è possibile preparare la sospensione di cellule per la crioconservazione (vedere la sezione 2).
  10. Aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità Ficoll come in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Sovrapporre delicatamente i suspens cellulariion (passo 1.9) sulla parte superiore della soluzione gradiente di densità. Evitare la miscelazione della sospensione cellulare e la soluzione gradiente di densità.
    Nota: La soluzione di gradiente di densità deve essere riscaldato a temperatura ambiente.
  11. Centrifugare la sospensione cellulare in un rotore incernierato a 700 xg per 20 minuti a RT. Non attivare la funzione di freno alla centrifuga come frenata veloce può interrompere il gradiente. Inoltre, utilizzare la funzione di accelerazione più basso sul centrifuga.
    Nota: Dopo questo passo centrifugazione, osservare multinazionali come uno strato bianco soffice all'interfaccia, e globuli rossi (RBC), fibroblasti e detriti cellulari come il sedimento sul fondo della provetta.
  12. Raccogliere accuratamente lo strato multinazionali utilizzando una pipetta da 10 ml. Posizionare la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml.
  13. Aggiungere 25 ml di PBS ghiacciato alla sospensione cellulare e girare il tubo a 300 xg per 5 minuti in un rotore incernierato a 4 ° C.
  14. Rimuovere il surnatante con una pipetta 25 mle ripetere pellet cellulare lavaggio passo altre due volte. Infine risospendere il pellet cellulare in 15 ml di PBS.
    Nota: Dopo la fase di lavaggio finale, è possibile crioconservare la sospensione cellulare (vedi capitolo 2).
  15. Applicare 10 ml di sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule emocitometro e contare il numero di cellule al microscopio. Distribuire la quantità appropriata di cellule (ad esempio, 2-3 x 10 7) in una provetta da 15 ml per centrifuga successiva separazione magnetica tallone. Tenere questo aliquota in ghiaccio fino al punto 3.2.

2. La crioconservazione delle cellule tonsillare

  1. Preparare medio di congelamento (90% FBS e il 10% DMSO) e tenerlo in ghiaccio. Per la conservazione a lungo termine mantenere i mezzi di comunicazione di congelamento a -20 ° C.
  2. Determinare il numero totale di cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare emocitometro (passo 1.15). Calcolare la quantità di terreno necessaria congelamento secondo la densità cellulare congelato desiderata (ad esempio, 10 7 cellules / ml di media di congelamento).
  3. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in mezzo congelamento ghiacciato (dal punto 2.1).
  4. Dispensare 1 ml aliquote della sospensione cellulare in fiale sterili progettati per lo stoccaggio a lungo termine in azoto liquido. Congelare le fiale in una camera isopropanolo e conservarli a -80 ° CO / N. Per la conservazione a lungo termine trasferire le fiale in azoto liquido contenente serbatoio o di una cella freezer -140 ° C.
  5. Per scongelare fiale con cellule congelate, li riscaldare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Immediatamente quando scongelato, disperdere la sospensione cellulare in 10 ml di pre-riscaldato HBSS (con supplementi, punto 1.1) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin il tubo a 300 xg per 5 min, rimuovere HBSS e risospendere il pellet cellulare alla densità cellulare desiderato in HBSS (con supplementi, punto 1.1).
    Nota: La vitalità della multinazionali after scongelamento è di importanza, in quanto la presenza di cellule morte diminuisce la resa finale purificata B e T linfociti.
    Nota: Secondo la nostra esperienza la vitalità cellulare meno 80% ridurrà l'efficienza isolamento delle cellule.

3. selezione positiva di T linfociti Popolazione da tonsillare multinazionali

Nota 1: Questo protocollo si basa sulla selezione positiva di umani linfociti T CD3 + da multinazionali tonsillari utilizzando sfere magnetiche accoppiate per l'anticorpo CD3. E 'possibile iniziare questa sezione dal fresco (sezione 1) o congelati (sezione 2) multinazionali.

Nota 2: Iniziare con 3 x 10 7 multinazionali. Non superare questo numero di cellulare, dal momento che le colonne di separazione possono intasare e questo ridurrà l'efficienza di isolamento. Utilizzare le colonne più grandi se verranno trattati più celle. I volumi utilizzati in questo protocollo sono state sperimentalmente ottimizzati per il numero di cellule uscato nel nostro setup sperimentale.

  1. Preparare il tampone di separazione [PBS (pH 7,2), lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA]. Filtrare il tampone di separazione attraverso un filtro da 0,45 micron e conservare a 4 ° C.
  2. Spin sospensione PTM (passo 1.14) a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet risultante cellule in 240 microlitri (80 microlitri per 10 7 cellule) di tampone di separazione ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 2 ml.
  3. Aggiungere 20 ml di anticorpo CD3 magnetica alla soluzione cellulare. Incubare le provette per 1 ora a 4 ° C con continua miscelazione delicata per mantenere le cellule in sospensione.
  4. Trasferire tutto di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di tampone di separazione ghiacciata per lavare le cellule.
  5. Centrifugare la provetta a 300 xg per 10 min a 4 ° C in un rotore incernierato.
  6. Nel frattempo, impostare il separatore magnetico e di colonna. Fissare il separatore magnetico per il supporto e posizionare la colonna nel SEPARator. Lavare la colonna applicando 500 ml di buffer di separazione ghiacciato. Gettare il flusso attraverso.
  7. Inserire un nuovo tubo di raccolta 15 ml sotto la colonna. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio.
  8. Eliminare il surnatante (passo 3,5) di pipetta e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 microlitri tampone di separazione. Applicare la sospensione cellulare sulla sommità della colonna pre-lavata e farlo funzionare attraverso.
    Nota: grumi di cellule possono ostruire la colonna e ridurre la portata così. Per evitare questo problema, inserire un filtro cella 40 micron plastica sulla parte superiore della colonna. Passando le cellule attraverso la maglia sarà altamente migliorare l'efficienza di questo metodo.
  9. Lavare la colonna 4 volte con 1,5 ml di tampone di separazione (500 microlitri per 10 7 cellule). Attendere il serbatoio colonna vuota (nessun liquido dovrebbe essere osservato nella colonna) prima di applicare il lavaggio successivo passo.
    Nota: Ottenere le cellule CD3 non marcati, considerati come frazione di linfociti B, in quanto sonoeluito nel tubo di raccolta.
  10. Rimuovere la colonna dal separatore e posto in un nuovo tubo di raccolta da 15 ml. Pipettare 2 ml di tampone di separazione nella colonna. Utilizzando il pistone in dotazione con la colonna eluire i linfociti T selezionati positivamente, che sono considerati come la frazione di linfociti T.
  11. Determinare il numero di cellule purificate (passo 1.15) se necessario. Sospensioni cellulari sono ora pronti per esperimenti a valle.

4. Citometria a flusso Analisi dei isolata tonsillare linfociti B e T

ATTENZIONE: soluzione Paraformaldeide è irritante e sospetto cancerogeno. Indossare indumenti protettivi, guanti e proteggersi gli occhi / la faccia.

Nota 1: Questo protocollo descrive il metodo per la colorazione diretta del B isolata e le cellule T per fluorescenza cellulare Attivato Ordinamento (FACS) analisi. Lo scopo principale di questa fase è quello di valutare la purezza della cella isolata popolazioni after CD3 anticorpo separazione magnetica. A tal fine stabilito B e marcatori di cellule T, si utilizzano anticorpi monoclonali fluoroforo coniugato CD20-FITC e CD2-APC. Anche l'inserimento di anticorpi di controllo isotipo è altamente raccomandato per distinguere la non specifico "sfondo" legame di anticorpi CD2 e CD20 (vedi punto 4.8).

Nota 2: E 'possibile mantenere le frazioni cellulari purificate in paraformaldeide 1% di soluzione (PFA) al buio a 4 ° C fino al momento della colorazione (ad esempio, il giorno dopo.). Anche la stessa procedura è applicabile se esiste un intervallo di tempo tra la colorazione e l'analisi FACS. Ricorda che in entrambi i casi le cellule devono essere lavati correttamente con PBSA (PBS contenente 0,2% di BSA) tampone, prima della colorazione o l'analisi FACS.

  1. Estrarre 6 x 10 6 cellule delle multinazionali dal punto 1.15 (prima di applicare alla colonna), frazione di linfociti B dal punto 3.9 e la frazione di linfociti T a partire dal punto 3.10.
  2. Spin la cellasospensioni a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C con un rotore swing-out.
  3. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare una volta con 1 ml di ghiacciata PBSA. Spin le sospensioni cellulari a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con pipetta e risospendere il cellule in 600 ml di tampone PBSA ghiacciato.
  4. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare al fondo di un tubo FACS.
  5. Aggiungere 100 ml di PBS contenente il 10% di calore siero umano inattivato a ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per ~ 1 minuti a temperatura ambiente oppure 20 minuti in ghiaccio.
    Nota: i linfociti B trasportano recettori Fc. Per bloccare il recettori Fc frazioni cellulari purificate sono incubati con 10% di siero umano inattivato al calore. Il siero umano inattivato al calore è da incubazione a 56 ° C per 1 ora. Dividete il calore siero inattivato in piccole aliquote e conservare congelati a -20 ° C.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C in un swing-out rotore.
  7. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare con 1 ml PBSA. Ripetere la centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C).
  8. Aggiungere 100 microlitri PBSA in ciascun tubo in ghiaccio. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale coniugato fluoroforo, secondo la raccomandazione del costruttore (ad esempio, 20 ml di anti-CD20 e / o 5 ml di anticorpi anti-CD2 in 100 ml di PBSA). Nota: Non dimenticare di assegnare provette di controllo sufficienti per l'analisi FACS. In questo protocollo dovrebbero essere inclusi i seguenti controlli: 1) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 controllo isotipico singolarmente e, 3) celle senza aggiunta di anticorpi.
  9. Brevemente vortice la provetta e incubare per 30 min a 4 ° C al buio.
  10. Lavare 2 volte con PBSA. Aggiungere 2 ml di soluzione all'1% PFA ai campioni. Lasciare le cellule rimangono nella soluzione PFA al 476; C al buio fino al momento dell'analisi FACS.
  11. Immediatamente prima di eseguire i campioni nella macchina FACS, lavare le cellule 2 volte con PBSA (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Campioni risospendere in 1 ml di PBS e mantenere a 4 ° C (o su ghiaccio), protetto dalla luce, prima della separazione sul citometro a flusso.
  12. Fare l'ordinamento FACS secondo il protocollo del citofluorimetro produttore.

5. PCR individuazione del DNA Adenovirus in isolati tonsillare linfociti B e T

Nota 1: Le adenovirus hexon primer gene sono AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') e AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Questi primer generano un amplicone di 139 bp. Il padrone di casa gene 18S rRNA può essere rilevato con primer tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') e TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). La dimensione prevista amplicone è di 300 bp.

Nota 2: Ogni PCRcorsa comprende un controllo negativo (distillata H 2 O) e un controllo DNA positivo ottenuto da linea di cellule B umane (BJAB) infettate con il tipo di adenovirus umano 5 12.

  1. Estrarre il DNA (da almeno 1 x 10 6 cellule, passo 3.11) con membrana silicea metodo di purificazione basato su colonne. Estrarre RNA utilizzando fenolo e guanidina isotiocianato soluzione 13.
  2. Aggiungere 100 ng di DNA da linfociti B e T di una miscela di reazione contenente tampone 1x HF, 0,2 mM di mix trifosfato di deossinucleotide (dNTP), 0,25 mM di ciascun primer e 1 U di alta fedeltà polimerasi DNA in un volume totale di 20 microlitri.
  3. Eseguire amplificazione PCR con le seguenti condizioni di ciclo: 30 sec di denaturazione a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 10 sec, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) per 30 sec e 72 ° C per 30 sec. La reazione di PCR è stata conclusa con un passo estensione finale di 7 min a 72 ° C.
  4. Separare il conseguente amplif PCRprodotti icazione su un gel di agarosio 1,5% in TBE 1x tampone e visualizzare le bande previsti dalla colorazione con colorante acido nucleico.

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Representative Results

Una separazione efficace dei tonsillari MNC risultati in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti B e T. Ciò è stato confermato mediante analisi FACS utilizzando anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare B T linfociti popolazioni, rispettivamente (Figura 3A). Al contrario, una separazione efficiente di MNC risultati in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule di entrambe le sottopopolazioni di linfociti B e T (Figura 3B).

Il linfociti T (Figura 3A) isolato tonsillare B e sono di qualità sufficiente per le analisi a valle, quali l'isolamento degli acidi nucleici. Nel protocollo corrente, DNA e RNA estratti dal linfociti B e T sono utilizzati per la rilevazione del DNA adenovirus e RNA cellulare. I risultati mostrano rilevamento specifico di DNA adenovirus in linfociti T tonsillare (Figura 4). RNA anche isolato da linfociti T tonsillare B ed è di qualità e quantità sufficienti per downstrea applicazioni m (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Panoramica della procedura di isolamento dei linfociti tonsillare. Campioni tonsille Palatine vengono elaborati e multinazionali tonsillari sono isolati da sospensione cellulare per centrifugazione in gradiente di densità. Linfociti B e T sono purificati in sottopopolazioni da una selezione positiva della frazione linfociti T con anticorpo magnetica CD3 umana. Questa fase di purificazione consente di valutare ulteriormente le frazioni cellulari isolate; per esempio, per determinare se alcune specie virali sono arricchiti in alcuna delle sottopopolazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. chirurgicamente rimosso tonsille palatine. Tonsille rimossi da tonsillectomia (a sinistra) e tonsillotomia (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Risultati Figura 3. Rappresentante FACS delle frazioni cellulari arricchito. (A) in avanti contro side scatter plot che mostra B (CD20) e T (CD2) popolazioni di linfociti in multinazionali tonsillari, linfociti T e le frazioni degli effluenti. La purezza dei linfociti T e B in frazioni cellulari arricchito è superiore al 90%. Poiché le cellule B costituiscono il 92% del totale delle cellule degli effluenti, questa frazione è chiamato come la sottopopolazione di linfociti B. (B) trame FACS che mostra la separazione inefficiente di B e SUBP cellule Topulations, a causa di numero non ottimale delle multinazionali applicati alla colonna e fasi di lavaggio insufficienti. A parte la necessità di una cella magnetica attivata l'ordinamento ottimizzazione, c'è un fondo di alto CD2 - / CD20 -. Le cellule, il che dimostra che la colorazione FACS non è ben ottimizzato Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. PCR rilevamento di DNA adenovirus in frazioni linfociti tonsillari. DNA totale è estratta dalla B e T linfociti isolati dal tonsille sinistra e destra da un paziente sottoposto tonsillectomia. End-point PCR viene eseguita con 100 ng di DNA purificato. Corsia 1: B frazione di linfociti (B) della tonsilla sinistra; corsia 2: frazione di linfociti T (T) del left tonsille; corsia 3: B frazione di linfociti (B) della tonsilla destra; corsia 4: frazione di linfociti T (T) della tonsilla destra. Adenovirus (Ad) del DNA è solo rilevabile in isolato frazione di linfociti T. Cellular 18S rRNA gene agisce come un controllo interno a mostrare la stessa quantità di DNA viene utilizzato per la reazione di PCR in tutti i campioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. alta qualità RNA estratto da isolato B e sottopopolazioni di linfociti T. Total RNA citoplasmatico estratto dal B isolata e linfociti T è stato separato su gel di agarosio 1%. Corsia 1: B frazione di linfociti (B) della tonsilla sinistra; corsia 2: frazione di linfociti T (T) della tonsilla sinistra; corsia 3: B frazione di linfociti (B) della tonsilla destra; corsia 4:Frazione dei linfociti T (T) della tonsilla destra. Modello migratorio di 28S rRNA, 18S rRNA e piccoli RNA è indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Uno dei fattori più importanti che influenzano il risultato di questo protocollo è l'uso di materiale fresco tonsillare come materiale di partenza. Pertanto, i campioni di tonsille devono essere trattati entro 3 ore dopo l'intervento chirurgico. Tonsille possono essere ottenuti da adulti e bambini. Il materiale tonsillare dai bambini è di solito più piccoli a causa della rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomy). Pertanto, il numero di multinazionali ottenuti da campioni tonsillotomia (1 x 10 7 -1 x 10 8) è inferiore rispetto ai campioni di tonsillectomia (1 x 10 8 -2 x 10 9). Tuttavia, il processo di isolamento cellulare sarebbe lo stesso indipendentemente dal tipo di intervento chirurgico.

Massimizzare la purezza delle sottopopolazioni cellulari ottenute da cellule magnetica attivata metodo di ordinamento richiede qualche ottimizzazione. La quantità e il tempo di incubazione con l'anticorpo CD3 magnetica e il numero di multinazionali applicati alla colonna sono i principali fattori che devono essere optanoimized. Applicando troppe cellule comporta intasamento della colonna e arricchimento inefficiente delle sottopopolazioni di cellule. Durante l'ottimizzazione di questo protocollo, abbiamo scoperto che l'applicazione di più di 3 x 10 7 MNC sulla colonna di separazione causerà un intasamento della colonna e successive frazioni cellulari impuri (Figura 3B). Pertanto, a partire da 3 x 10 7 PTM dà frazioni pure arricchito di linfociti con qualità e quantità sufficiente per l'estrazione del DNA e RNA (figure 4 e 5). Il numero finale di isolati linfociti B e T è prevista per 1-2 x 10 7 e 5-7 x 10 6, rispettivamente. Pertanto, l'utilizzo di 20 microlitri di anticorpo CD3 magnetica per 3 x 10 7 multinazionali sembra essere ottimale per successo B e T linfociti separazione (Figura 3A).

Un rapporto precedente ha dimostrato che linfociti B e T comprendono 60-70% e il 30-40% dei PTM tonsillare rispettivamente, mentre altritipi di cellule, come i macrofagi, le cellule natural killer e le cellule dendritiche costituiscono il 1-8% delle multinazionali tonsillari 14. Proporzioni cellule simili sono stati ottenuti con il nostro protocollo isolamento come mostrato mediante immunocolorazione dei linfociti B e T con la tecnica FACS (Figura 3A).

Il numero di fasi di lavaggio e il volume tampone di lavaggio sono parametri critici per un buon risultato. Pertanto, lavaggio eccessivo causerà cellule T CD3 associati anticorpi magnetico a finire nel flusso continuo, mentre un lavaggio insufficiente ridurrà la purezza della frazione di cellule T.

Una volta che le fasi critiche nel protocollo sono ottimizzati per il tipo di tessuto e le analisi previste a valle, questo metodo è semplice, efficiente, semplice e risparmio di tempo. Tuttavia uno limitazione di questo metodo è un costo relativamente elevato dei reagenti magnetici associati commerciali di separazione delle cellule, che potrebbe limitare la purificazione su larga scala di TonsillaT linfociti B e r.

In sintesi questo protocollo prevede una strategia per ottenere B e T sottopopolazioni da tonsille palatine e potrebbe essere modificato per isolare frazioni cellulari da altri tessuti come la milza, timo, linfonodi e sangue. Applichiamo ulteriormente questo metodo per dimostrare che rileviamo un'infezione adenovirus particolare nella frazione di cellule T tonsillare (Figura 4). Così, questo protocollo dovrebbe essere utile per una vasta area di applicazioni, tra cui studi sulle interazioni ospite-patogeno, citotossicità delle cellule T, attivazione delle cellule T, segnalazione cellulare e B e T di espressione marcatore superficie cellulare.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

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References

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