Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von lymphatischen Zellen, die aus menschlichen Patienten, Material und erfordert deshalb eine ethische Genehmigung. Die Arbeit in der vorliegenden Studie durchgeführt wurde von der Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387) gewährt.

1. Isolierung von mononukleären Zellen (MNC) aus humanen Gaumenmandeln

ACHTUNG: Alle ungeschirmten Material menschlichen Ursprungs wie Blut, Gewebe oder Körperflüssigkeiten sind als potenziell infiziertem Material betrachtet werden. Daher sollte empfohlen Biosicherheit Praktiken zur Handhabung der menschlichen Geweben folgen.

Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, müssen alle Lösungen und Zellkulturgeräte steril sein. Alle Puffer und Lösungen sollten vorgekühlt werden und auf Eis gehalten. Tonsillen und Geweben isolierten Zellen sollten aufbewahrt und auf Eis behandelt werden.

  1. Erhalten frischen Mandeln von Patienten, die eine Tonsillektomie oder Tonsillotomie (Abbildung 2). Tauchen Sie ein in das Gewebe clumps in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit eiskalter steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gefüllt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / ml Gentamicin und 1% Antibiotika-Antimykotische Mix (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
  2. Halten Sie die Rohre mit den untergetauchten Tonsillen Gewebeproben zu jeder Zeit auf Eis. Versuchen Sie, die Mandeln so schnell wie möglich zu bearbeiten, und nicht später als 3 Stunden nach der operativen Entfernung.
  3. Legen Sie die Mandeln auf einem 60 mm Kunststoff-Zellkulturplatte auf Eis und halten Sie die mit HBSS angefeuchteten Tuch. Entfernen Sie sichtbaren Blutgerinnseln, Fett- und Bindegewebe mit einer sauberen Pinzette aus der Tonsillen Oberfläche.
  4. Verwenden Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte, die 5 ml HBSS. Schneiden Sie das Mandelgewebe Klumpen in 3-10 mm Fragmente mit einer sterilen Schere und / oder einem Skalpell.
  5. Bereiten Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte mit 10 ml HBSS und legen Sie eine 100 & mgr; Kunststoff Zellsieb in der HBSS-Lösung.
  6. Übertragen Sie die dissreflektierte Tonsillen-Fragmente in die Zelle Sieb mit einer sterilen Zange. Mit dem Kolbenende einer Plastikspritze, reibungslos den Gewebefragmenten zu quetschen durch die Zelle Sieb. Stellen Sie sicher, dass die Tonsillen Fragmente werden völlig in der HBSS eingetaucht.
  7. Entsorgen Sie die Zellsieb mit den Geweberesten und übertragen Sie die erhaltene Zellsuspension aus dem 60 mm-Zellkulturplatte in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis, während Sie fortfahren mit den Schritten 1.8 und 1.9.
  8. Im Fall von großen Tonsillen, die größer als 2 cm groß (Figur 2), quetschen die Tonsillen-Fragmente in zwei Zellsiebe, um ein Verstopfen des Siebs in das Sieb zu vermeiden.
  9. Besorgen Sie sich die endgültigen Volumen von 35 ml der Zellsuspension.
    Anmerkung: In diesem Schritt ist es möglich, die Zellsuspension zur Kryokonservierung (siehe Abschnitt 2) herzustellen.
  10. 10 ml der Dichtegradientenlösung wie Ficoll in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig überlagern die Zell suspensIon (Schritt 1.9) auf der Oberseite der Dichtegradient-Lösung. Sollte das Mischen der Zellsuspension und der Dichtegradient-Lösung.
    Anmerkung: Der Dichtegradient Lösung auf RT erwärmen.
  11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem Ausschwingrotor bei 700 × g für 20 min bei RT. Den Bremsfunktion an der Zentrifuge so schnell Bremsen kann die Steigung stören nicht zu aktivieren. Verwenden Sie außerdem die niedrigste Beschleunigungsfunktion an der Zentrifuge zur Verfügung.
    Anmerkung: Nach diesem Zentrifugationsschritt beobachten MNCs als flockigen weißen Schicht an der Grenzfläche, und die roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Fibroblasten und Zelltrümmer als Sediment am Boden des Röhrchens.
  12. Sorgfältig sammeln MNCs Schicht unter Verwendung eines 10 ml-Pipette. Legen Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen.
  13. 25 ml eiskaltem PBS zu der Zellsuspension und drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min in einem Ausschwingrotor bei 4 ° C.
  14. Entfernen Sie den Überstand mit einer 25 ml Pipetteund Zellpellet Waschstufe zwei weitere Male wiederholen. Schließlich Zellpellet in 15 ml PBS.
    Hinweis: Nach dem letzten Waschschritt ist es möglich, die Zellsuspension (siehe Abschnitt 2) Kryokonservierung.
  15. Übernehmen 10 ul der Zellsuspension in Hämocytometer Zell Zählkammer und zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop. Abgeben der geeigneten Menge der Zellen (beispielsweise 2-3 x 10 7) in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen für eine nachfolgende magnetische Perle Trennung. Bewahren Sie dieses aliquoten auf Eis, bis der Schritt 3.2.

2. Kryokonservierung von Tonsilläre Cells

  1. Bereiten Gefriermedium (90% FBS und 10% DMSO) und bewahren Sie es auf Eis. Für langfristige Lagerung halten die gefrierenden Medien bei -20 ° C.
  2. Bestimmung der Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Zelle Zählkammer (Schritt 1.15). Berechnung der erforderlichen Menge an Gefriermedium nach dem gewünschten gefrorenen Zelldichte (beispielsweise 10 7 Zellens / ml Gefriermedium).
  3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min. Den Überstand umfüllen, ohne das Zellpellet zu stören und Zellpellet in eiskaltem Einfriermedium (aus Schritt 2.1).
  4. Verzichtet werden 1 ml Aliquots der Zellsuspension in sterilen Ampullen zur langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff ausgelegt. Frieren Sie die Fläschchen in einem Isopropanol Kammer und lagern Sie sie bei -80 ° CO / N. Für die Langzeitarchivierung übertragen Sie die Vials in einen flüssigen Stickstoff enthaltenden Speicherbehälter oder ein 140 ° C Zell Gefrierschrank.
  5. Um Durchstechflaschen mit eingefrorenen Zellen auftauen, erwärmen sie sich schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Unmittelbar nach dem Auftauen, Dispergieren der Zellsuspension in 10 ml vorgewärmtem HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1) in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min, zu entfernen HBSS und Zellpellet bei der gewünschten Zelldichte in HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1).
    Hinweis: Die Funktionsfähigkeit des MNU after Auftauen von Bedeutung ist, da das Vorhandensein von toten Zellen, die die endgültige Ausbeute an gereinigtem B und T-Lymphozyten zu verringern.
    Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80% wird die Zellisolationseffizienz zu reduzieren.

3. Positive Selektion von T-Lymphozyten-Population aus Tonsilläre MNCs

Hinweis 1: Dieses Protokoll wird auf positive Selektion von menschlichen CD3 + T-Lymphozyten von Tonsillen MNCs mit magnetischen Kügelchen an den CD3-Antikörper gekoppelt basiert. Es ist möglich, diesen Abschnitt aus frischen (Abschnitt 1) ​​oder den gefrorenen (Abschnitt 2) MNU starten.

Anmerkung 2: Beginnen Sie mit 3 x 10 7 MNCs. Nehmen Sie dieses Zellzahl nicht überschreiten, da die Trennsäulen können verstopfen, und dies wird die Isolationseffizienz zu reduzieren. Verwenden größere Spalten, wenn mehr Zellen behandelt werden. Die in diesem Protokoll verwendeten Mengen sind experimentell für die Anzahl der Zellen, wir optimiertin unserem Versuchsaufbau ed.

  1. Vorbereitung der Trennpuffer [PBS (pH 7,2), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA]. Filtern Sie die Trennungspuffer durch ein 0,45 um-Filter und bei 4 ° C.
  2. Spin der MNC-Suspension (Schritt 1.14) bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren der resultierenden Zellpellets in 240 & mgr; l (80 & mgr; l pro 10 7 Zellen) eiskaltem Trennpuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 2 ml-Tube.
  3. Mit 20 ul magnetischen CD3-Antikörper zu der Zelllösung. Die Röhrchen für 1 h bei 4 ° C inkubieren unter kontinuierlichem leichtem Mischen mit Zellen in Suspension zu halten.
  4. Übertragen Sie alle der Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml eiskaltem Trennpuffer, um die Zellen zu waschen.
  5. Zentrifugieren der Röhre bei 300 g 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor.
  6. In der Zwischenzeit die Magnetscheider und Spalte. Befestigen Sie den Magnetscheider in den Stand und legen Sie die Spalte in der separator. Indem 500 ul eiskaltem Trennpuffer Die Säule. Die Durchströmung zu verwerfen.
  7. Legen Sie ein neues 15 ml Sammelröhrchen unter der Spalte. Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis.
  8. Überstand verwerfen (Schritt 3.5) mit einer Pipette und sanft Zellpellet in 500 ul Trennpuffer. Übernehmen Sie die Zellsuspension auf der Oberseite des vorgewaschen Spalte und lassen Sie es durchlaufen.
    Hinweis: Zellklumpen können die Spalte verstopfen und damit die Durchflussrate zu reduzieren. Um dieses Problem zu vermeiden, legen Sie einen 40 & mgr; Kunststoff Zellsieb am oberen Ende der Säule. Vorbei an den Zellen durch diese Masche wird in hohem Grade verbessern die Effizienz dieser Methode.
  9. 4-mal mit 1,5 ml Trennpuffer (500 & mgr; l für 10 & sup7; Zellen) Waschen der Säule. Warten Sie auf den Spalten Reservoir leer sein (keine Flüssigkeit in der Spalte eingehalten werden), bevor die nächste Waschschritt.
    Anmerkung: Beziehen Sie die CD3 unmarkierten Zellen, wie B-Lymphozyten-Fraktion betrachtet, wie sie sind,in den Sammelröhrchen eluiert.
  10. Entfernen Sie die Säule aus dem Abscheider und Ort in eine neue 15 ml Sammelröhrchen. Pipette 2 ml Trennpuffer auf die Säule. Unter Verwendung der mit der Säule zugeführt Stößel eluieren die positiv ausgewählten T-Lymphozyten, die als die T-Lymphozyten-Anteil gelten.
  11. Bestimmen die Anzahl der gereinigten Zellen (Schritt 1.15), falls erforderlich. Zellsuspensionen sind nun bereit für nachgeschaltete Experimente.

4. Durchflusszytometrie Analyse von isolierten Tonsilläre B- und T-Lymphozyten

ACHTUNG: Paraformaldehydlösung ist reizend und vermutetes Karzinogen. Geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille / Gesichtsschutz tragen.

Anmerkung 1: Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur direkten Färbung der isolierten B-und T-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Der Hauptzweck dieses Schrittes ist es, die Reinheit des isolierten Zellpopulationen af ​​beurteilenter CD3-Antikörper magnetische Trennung. Zu diesem Zweck gegründet B- und T-Zell-Marker, fluorophorkonjugierten monoklonale Antikörper CD20-FITC und CD2-APC, verwendet. Auch die Einbeziehung der Isotypkontrolle Antikörper ist sehr zu empfehlen, um die nicht-spezifische "Hintergrund" Bindung der CD2 und CD20-Antikörper (siehe Schritt 4.8) zu unterscheiden.

Anmerkung 2: Es ist möglich, die gereinigten Zellfraktionen in eine 1% Paraformaldehyd (PFA) Lösung im Dunkeln bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Färbung zu halten (beispielsweise am nächsten Tag.). Auch die gleiche Vorgehensweise gilt, wenn es eine Zeitlücke zwischen Anfärbung und FACS-Analyse. Erinnern, dass in beiden Fällen Zellen sollten richtig mit PBSA (PBS enthaltend 0,2% BSA), vor der Färbung oder FACS-Analyse gewaschen werden.

  1. Nehmen 6 x 10 6 Zellen der MNCs aus Schritt 1.15 (vor dem Aufbringen auf die Säule), B-Lymphozyten-Fraktion aus Schritt 3.9 und T-Lymphozyten-Fraktion von Schritt 3.10.
  2. Drehen Sie das HandySuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C unter Verwendung eines ausschwenkbaren Rotors.
  3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 1 ml eiskaltem PBSA. Dreh die Zellsuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die Zellen in 600 & mgr; l eiskaltem PBSA Puffer.
  4. Zugabe von 100 ul der Zellsuspension auf den Boden eines FACS-Röhrchen.
  5. Geben Sie 100 ul PBS, das 10% hitzeinaktiviertem Humanserum in jedes Röhrchen, gut mischen und Inkubation für ca. 1 min bei RT oder 20 Minuten auf Eis.
    Hinweis: B-Lymphozyten tragen Fc-Rezeptoren. Um die Fc-Rezeptoren blockieren die gereinigten Zellfraktionen werden mit 10% hitzeinaktiviertem Humanserum inkubiert. Das Humanserum wird Wärme durch Inkubation bei 56 ° C für 1 Stunde inaktiviert. Teilen Sie die Hitze inaktiviert Serum in kleinen Portionen und bei -20 ° C eingefroren.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C in einem swing-out-Rotor.
  7. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml PBSA. Wiederholen der Zentrifugation (300 · g für 5 min bei 4 ° C).
  8. 100 l PBSA in jedes Röhrchen auf Eis. Die geeignete Menge von fluorophorkonjugierten monoklonalen Antikörper gemäß den Empfehlungen des Herstellers (beispielsweise 20 & mgr; l Anti-CD20-und / oder 5 & mgr; l anti-CD2-Antikörper in 100 ul PBSA). Hinweis: Vergessen Sie nicht, genügend Kontrollröhrchen für die FACS-Analyse zuweisen. In diesem Protokoll sind die folgenden Kontrollen eingeschlossen: 1) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20-Antikörper einzeln gefärbten, 2) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20 Isotypkontrolle Antikörper einzeln und, 3) Zellen, die ohne Zugabe gefärbten von Antikörpern.
  9. Vortexen Sie das Röhrchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  10. Mit PBSA waschen 2 mal. 2 ml 1% PFA-Lösung zu den Proben. Lassen Sie die Zellen bleiben in der PFA-Lösung bei 476; C im Dunkeln bis zur Zeit des FACS-Analyse.
  11. Unmittelbar bevor Sie die Proben in der FACS-Maschine, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBSA (300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C). Resuspendieren Proben in 1 ml PBS und Halten bei 4 ° C (oder auf Eis), vor Licht geschützt, vor der Trennung auf dem Durchflußzytometer.
  12. Haben die FACS-Sortierung nach dem Protokoll vom Durchflusszytometer Hersteller.

5. PCR-Nachweis von Adenovirus DNA in getrennter Tonsilläre B und T-Lymphozyten

Anmerkung 1: Die Adenovirus-Hexon-Gen-Primer AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') und AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Diese Primer erzeugen ein Amplikon von 139 bp. Der Host 18S rRNA-Gen kann mit Primern tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') und TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') detektiert werden. Der Erwartete Fragmentlänge von 300 bp.

Anmerkung 2: Jeder PCRLauf umfasst eine negative Kontrolle (destilliertes H 2 O) und einer aus menschlichen B-Zelllinie (BJAB) erhaltenen positiven DNA-Steuerung mit menschlichen Adenovirus Typ 5 12 infiziert.

  1. Extrahieren DNA (mindestens 1 x 10 6 Zellen, Stufe 3.11) unter Verwendung von Silica-Membran anhand Säulenreinigungsverfahren. Auszug RNA mit Phenol und Guanidinisothiocyanat Lösung 13.
  2. Werden 100 ng DNA von B- und T-Lymphozyten zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 1x HF-Puffer, 0,2 mM Desoxynukleotidtriphosphat-Mix (dNTP), 0,25 & mgr; M von jedem Primer und 1 U der High-Fidelity-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
  3. Zuführen PCR-Amplifikation unter folgenden Zyklusbedingungen: 30 sec Denaturierung bei 98 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 67 ° C (Hexon) bzw. 58 ° C (18S rRNA) für 30 sec und 72 ° C für 30 sek. Die PCR-Reaktion wurde mit einem letzten Verlängerungsschritt von 7 min bei 72 ° C beendet.
  4. Trennen Sie die resultierende PCR Amplification Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel in 1x TBE-Puffer und visualisieren die erwarteten Banden durch Färbung mit Nukleinsäurefärbung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eine effiziente Trennung von Tonsillen MNCs zu hochgradig gereinigten Subpopulationen von B und T-Lymphozyten. Dies wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung von anti-CD20 und anti-CD2-Antikörper an B und T-Lymphozyten-Populationen, bzw. (3A) zu detektieren bestätigt. Im Gegensatz dazu eine ineffiziente Abscheidung von MNCs Ergebnisse in Zellfraktionen, die eine Mischung von Zellen von sowohl B als auch T-Lymphozyten-Subpopulationen (3B) sind.

Die isolierte tonsillar B- und T-Lymphozyten (3A) von ausreichender Qualität für die Downstream-Analysen wie Nukleinsäureisolierung. Im aktuellen Protokoll, DNA und RNA aus den B extrahiert und T-Lymphozyten werden für den Nachweis von Adenovirus DNA und zellulärer RNA verwendet. Die Ergebnisse zeigen den spezifischen Nachweis von Adenovirus DNA in Tonsillen-T-Lymphozyten (Abbildung 4). Ebenfalls isoliert RNA aus Tonsillen B- und T-Lymphozyten in ausreichender Qualität und Quantität für downstrea m-Anwendungen (Abbildung 5).

Abbildung 1
Abbildung 1. Übersicht über die Tonsillen Lymphozytenisolationsverfahren. Gaumenmandel Proben verarbeitet und Tonsillen MNCs werden aus Zellsuspension durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. B und T-Lymphozyten werden durch eine positive Selektion der T-Lymphozytenfraktion mit menschlichen CD3 magnetischen Antikörper in Subpopulationen gereinigt. Dieser Reinigungsschritt ermöglicht es, eine weitere Bewertung der isolierten Zellfraktionen; zum Beispiel, um festzustellen, ob einige Virusarten innerhalb einer der Subpopulationen bereichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

jpg "/>
Abbildung 2. chirurgisch entfernt Gaumenmandeln. Tonsillen durch Tonsillektomie (links) und Tonsillotomie (rechts) entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative FACS Ergebnisse der angereicherten Zellfraktionen. (A) nach vorne vs. Seitenstreudiagramm zeigt, B (CD20) und T (CD2) Lymphozyten-Populationen in Tonsillen MNCs, T-Lymphozyten und Abwasserfraktionen. Die Reinheit der T und B-Lymphozyten in angereicherte Zellfraktionen mehr als 90%. Da B-Zellen umfassen 92% der gesamten Abwasser Zellen wird diese Fraktion als B-Lymphozyten-Subpopulation gestattet. (B) Diagramme, die FACS ineffizient Trennung von B und T-Zell subpopulations aufgrund nicht optimierten Anzahl von MNCs an der Säule und eine unzureichende Waschschritte angewendet. Abgesehen von der Notwendigkeit, magnetic cell separation Optimierung, gibt es eine hohe Hintergrund der CD2 - / CD20 -. Zellen, die zeigt, dass FACS-Färbung ist nicht gut optimiert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. PCR-Nachweis von Adenovirus DNA in Tonsillen Lymphozytenfraktionen. Die Gesamt-DNA wird aus dem B extrahiert und T-Lymphozyten aus dem linken und dem rechten Tonsillen isoliert von einem Patienten, der Mandelentfernung. Endpunkt-PCR wird mit 100 ng der gereinigten DNA durchgeführt. Spur 1: B-Lymphozyten-Fraktion (B) der linken Mandel; Spur 2: T-Lymphozyten-Fraktion (T) des left Tonsillen; Spur 3: B-Lymphozyten-Fraktion (B) der rechten Mandel; Spur 4: T-Lymphozyten-Fraktion (T) des rechten Mandel. Adenovirus (Ad) DNA ist nur in Einzel T Lymphozytenfraktion nachweisbar. Cellular 18S rRNA-Gen wirkt als interne Kontrolle, um zu zeigen, dass dieselbe Menge an DNA für die PCR-Reaktion in allen Proben verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Figur 5. Qualität RNA aus isolierten B- und T-Zell-Subpopulationen extrahiert. Insgesamt cytoplasmatische RNA aus der isolierten B-und T-Lymphozyten extrahiert wurde auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Spur 1: B-Lymphozyten-Fraktion (B) der linken Mandel; Spur 2: T-Lymphozyten-Fraktion (T) des linken Mandel; Spur 3: B-Lymphozyten-Fraktion (B) der rechten Mandel; Spur 4:T-Lymphozyten-Fraktion (T) des rechten Mandel. Migration Muster der 28S rRNA, 18S rRNA und kleine RNA angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Einer der wichtigsten Faktoren, die die Ergebnisse dieses Protokolls ist die Verwendung von frischen tonsillar Material wie das Ausgangsmaterial. Daher sollten die Tonsillenproben innerhalb von 3 h nach der Operation verarbeitet werden. Mandeln können von Erwachsenen und Kindern erhalten werden. Rachen Materials von den Kindern der Regel kleiner ist durch die teilweise operative Entfernung der Mandeln (Tonsillotomie). Daher ist die Anzahl der MNCs aus Tonsillotomie Proben (1 x 10 7 -1 x 10 8) erhalten wird, kleiner im Vergleich zu tonsillektomie Proben (1 x 10 8 -2 x 10 9). Jedoch würde die Zellisolierungsverfahren die gleichen, unabhängig von der Art der Operation.

Maximierung der Reinheit der Zellsubpopulationen von Magnetvermittelte Zellsortierung Verfahren erhalten erfordert eine Optimierung. Die Menge und die Inkubationszeit mit CD3 magnetischen Antikörper und die Anzahl von MNCs an die Säule angelegt sind die wichtigsten Faktoren, die entscheiden werden sollimierte. Wenn zu viele Zellen zu einem Verstopfen der Kolonne und ineffizient Anreicherung von Zell-Subpopulationen führen. Bei der Optimierung dieses Protokolls haben wir festgestellt, dass die Anwendung von mehr als 3 x 10 7 MNCs an der Trennkolonne wird ein Verstopfen der Säule und anschließende unreinen Zellfraktionen (3B) verursachen. Somit ausgehend von 3 x 10 7 MNCs gibt auch angereicherte Lymphozytenfraktionen mit ausreichender Qualität und Quantität für die DNA- und RNA-Extraktion (4 und 5). Die endgültige Anzahl der isolierten B-und T-Lymphozyten wird erwartet, 1-2 x 10 7 und 5-7 x 10 6 betragen. Somit scheint Nutzung 20 ul magnetischen CD3 Antikörper pro 3 x 10 7 MNCs Optimum für erfolgreiche B- und T-Lymphozyten-Trenn (3A) sein.

Ein früherer Bericht wurde festgestellt, dass B und T-Lymphozyten umfassen 60-70% und 30-40% der Tonsillen MNCs bzw., während andereZelltypen wie Makrophagen, natürliche Killerzellen und dendritischen Zellen machen 1-8% der Tonsillen MNU 14. Ähnliche Zell Anteile wurden mit unserem Isolierungsprotokolls erreicht, wie durch Immunfärbung der B und T-Lymphozyten mit der FACS-Technik (3A) dargestellt.

Der Anzahl der Waschschritte und die Waschpuffervolumen sind kritische Parameter für ein gutes Ergebnis. Dementsprechend wird übermäßiges Waschen bewirken, dass die CD3-Antikörper zugeordneten magnetischen T-Zellen, um am Ende in der Durchfluss, während unzureichendes Waschen wird die Reinheit des T-Zell-Anteil zu verringern.

Sobald die kritischen Schritte in dem Protokoll für den Gewebetyp und der erwarteten Downstream-Analysen optimiert ist dieses Verfahren einfach, effizient, einfach und zeitsparend. Jedoch eine Beschränkung dieses Verfahrens ist eine relativ hohe Kosten für die kommerzielle Magnetassoziierte Zellsortierung Reagenzien, die großtechnische Reinigung von tonsilla einschränken könntenR B und T-Lymphozyten.

Zusammenfassend Dieses Protokoll sieht eine Strategie für den Erhalt von B- und T-Subpopulationen von Gaumenmandeln und könnte modifiziert werden, um Zellfraktionen aus anderen Geweben wie Milz, Thymus, Lymphknoten und Blut zu isolieren. Wir dieses Verfahren weiterhin gelten, um zu zeigen, dass wir erkennen, ein Adenovirus-Infektion spezifisch in der Tonsillen T-Zell-Fraktion (Abbildung 4). Daher sollte dieses Protokoll nützlich für eine großflächige Anwendungen, einschließlich Studien zur Wirt-Pathogen-Interaktionen, T-Zell-Zytotoxizität, T-Zell-Aktivierung, Zellsignalisierung und B- und T-Zelloberflächenmarker-Ausdruck sein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics