컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
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Bioengineering

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Summary

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

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Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

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Abstract

뼈 이식 절차의 성공을 결정하는 중요한 매개 변수는 그래프트를 둘러싼 영역의 혈관이다. 우리는 풍부한 혈관 형성에 의해 더 많은 골 재생을 유도 할 뼈 이식술의 주입을 가설을 세웠다. 결함 부위에서 신생 혈관에 이식 효과를 조사하기 위해, 우리는 중합 성 조영제와 동물의 조직 관류를 포함 혈관 형성 새롭게 특성화 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 접근 방법을 개발 하였다. 이 방법은 전체 기관의 자세한 혈관 분석을 할 수 있습니다. 또한, 혈액 관류 혈액 유래 형광 제의 형광 이미징 (FLI)를 사용하여 평가 하였다. 골 형성은 수산화 인회석 타겟 프로브 μCT 분석을 사용하여 정량 하였다 FLI. 줄기 세포 모집 오스테오칼신 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제를 발현 트랜스 제닉 마우스의 생물 발광 영상 (BLI)에 의해 모니터링 하였다.다음은 설명과 동종의 제조, 두개골 결함 수술을 보여, 혈관 신생 연구하고 (조영제의 생체 내 관류를 포함) 골 형성 분석 및 데이터 분석을위한 프로토콜 μCT 주사 프로토콜.

맥관 구조의 3D 고해상도 분석 특히 세동맥 포메이션에 대하여,자가 이식으로 이식 동물에서 상당히 큰 혈관을 보여 주었다. 따라서, 혈액 관류는 수술 후 7 일째에 의한자가 이식 군에서 유의하게 높았다. 우리는자가 이식을받은 동물에서 우수한 뼈 광물 및 측정보다 골 형성을 관찰했다. 세포는 7 및 10 사이의 수술후 일 골 형성 세포로 분화 그래프트 호스트 뼈 봉합,자가 이식에 의한 주입 상주 줄기 세포 모집. 이 결과는 강화 된 골 형성이에 기인 할 수 있음을 의미자가 이식 주입의 특징을 증강 혈관 먹이입니다. 방법은 단단히 경계 골 형성 및 신생 혈관의 관점에서 골 재생을 연구하는 최적의 도구로 역할을 할 수있다 묘사했다.

Introduction

외상, 종양 절제, decompressive 개두술 및 선천성 결함에 대한 두개 안면 뼈 손실은 거의 그 자체로 치유하지 않고 명확한 충족되지 임상 필요성을 제시한다. 자가 뼈 이식과 동종 골 이식이 광범위하게 이러한 조건 1을 치료하는 데 사용된다.

널리 혈관 신생 골 형성이 단단히 2,3- 결합되는 것을 허용한다. 따라서, 뼈 재생을위한 제안 치료의 전체 연구는 전체 결함의 위치를​​ 통하여 형성하는 혈관 나무의 포괄적 인 조사를 포함해야한다. 연구 모델에서 혈관의 특성을 몇 가지 가능한 방법이 있습니다. 혈관 나무는 조직 학적 분석을 통해 조사 할 수있다. 조직학은 조직을 절편에 의존하기 때문에, 결과 이​​미지가 왜곡 될 가능성이 높은있다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체 내에 현미경 이미지 본래의 혈관 (4)에 수행 될 수있다; 그러나,이 방법은하나의 평면 영상으로 제한. 조영제로 관류 동물에서 얻은 검체의 μCT 검사는 재생 사이트 (5)를 공급하는 혈관 네트워크의 3D 영상을 수 있습니다. 이 접근법은 전체 기관의 혈관의 매우 상세한 데모뿐만 아니라 혈관 분포의 치밀한 분석을 허용한다. 또한, μCT 혈관의 서로 다른 아형을 특성화 혈관 직경의 변화 사이의 차별화를 가능하게한다.

우리는 동종 이식의 이식보다 큰 혈관 신생을 유도하는 두개골 이식술의 주입을 가정하고, 이것은 우리가 다양한 기술을 사용이 가설을 추구 formation.To 강화 뼈, 차례로, 신생 혈관이 이어질 것 증가했다. 우리 μCT 기반 분석을 수행하여 새로 형성된 혈관의 나무 무늬를 조사 하였다. 우리는 혈액 풀 형광 프로브를 이용하여 혈류를 측정 하였다. 다음으로, 엉덩이하이드 록시 아파타이트 지시 프로브 및 μCT 분석 FLI으로 나오지 뼈 조직 광물. 마지막으로, 우리는 오스테오칼신 루시페라아제 양성 세포에서 발현하는 형질 전환 마우스에서 BLI을 수행하는 줄기 세포의 분화 및 모집을 모니터.

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Protocol

이 프로토콜은 예루살렘, 이스라엘 (요청 번호 MD-12-13524-4), AAALAC 승인 시설,로 삼목 시나이 의료 센터의 히브리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 라인을 다음과 IACUC (신청 번호 3770). 동물 NIH 가이드 라인을 엄격하게 준수에 처리 하였다.

뼈 동종 이식 1. 준비

  1. CO 2 흡입 또는 50 μL 페노바르비탈 (65 ㎎ / ㎖; 100 밀리그램 / kg)의 복강 내 주사의 표준 방법을 이용하여, 수신자는 다른 7- 내지 8 주령의 Balb / C 마우스 또는 변형을 안락사. 하트 비트가 없음을 확인하고 자궁 경부 전위를 수행합니다. 또한, -20 ℃에 보관하고 수확하기 전에 해동 된 시체에서 동종 이식을 수확.
  2. 모발 성장의 방향에 대해 그것을 도포, 헤어 커터를 이용하여 두개골 영역을 면도. 70 %를 적용함으로써 카 커스 헤드 소독 isopropano엘. 11 호 메스를 사용하여 두피의 피부를 잘라 골막을 제거합니다.
  3. 치과 용 드릴 및 4.5 mm 내경을 트레 이용하여 두개골 뼈의 원형 조각을 분리. 멸균 생리 식염수를 함유하는 100-mm 플라스틱 접시에 뼈 조각을 전송. 이 시점에서, 피와 뼈 조각 (그림 1A)에 부착 된 연부 조직을 관찰한다. 22 기증자에서 이러한 방식으로 뼈 조각을 얻습니다.
  4. 곡선 핀셋을 사용하여 한번에 하나의 뼈 조각을 잡아. 철저면 팁 어플리케이터를 사용하여 면봉 및 뇌 조직, 연부 조직, 혈액 (그림 1B)를 제거합니다. 조심스럽게 이식이 완벽하게 둥근 형태를 가질 수 있도록 좋은 가위를 사용하여 이식에 부착 남아있는 뼈 칩을 절단.
  5. 70 % 에탄올 및 에탄올을 씻어 인산염 완충 식염수를 함유하는 15 ml의 두 튜브를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 한번씩 그래프트 담근다.
  6. 에 대한 cryotubes에서 -80 ° C 냉장고에있는 동종 이식을 동결적어도 일주. 이 시점에서, 동종 이식 (그림 1C) 투명하게 표시해야합니다.

2. 두개골 결함 수술

  1. 받는 사람의 오스테오칼신 프로모터 (6)의 제어하에 루시퍼 라제을 표현 형질 전환 마우스를 사용합니다.
  2. 30 초 동안 유리 비드를 사용하여 히터 수술 도구의 팁을 소독. 무균 상태를 유지하기 위해 70 % 이소 프로필 알코올이 포함 된 항아리에 도구를 전송합니다. 멸균 장갑을 사용합니다.
  3. ketamine- 메데 토미 혼합물 (75 ㎎ / ㎏ 1 ㎎ / ㎏, 각각)의 복강 내 주사하여 7- 8 주령의 암컷 마우스를 마취. 이 깊이 마취되어 있는지 확인하기 위해 동물의 사지를 핀치. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 무인 때까지 동물을 두지 마십시오.
  4. 모발 성장의 방향에 대해이를 적용함으로써 헤어 커터를 이용하여 두개골 영역을 면도. 어떤 모피 찌꺼기를 제거하고 afte 닦아 헤어 크림을 적용R 식염수를 적신 거즈 다음 마른 거즈를 사용하여 더 이상보다 2 분. 배려가 눈에 들어 가지 않도록주의해야한다. 대안 적으로, 수의사 안연고는 눈 별도의 보호 층으로서 종래 제모에 적용될 수있다. 이는 제모 크림의 모든 흔적 화학 약품에 노출 가능한 과도한 자극을 방지하기 위해 제거되는 것이 필수적이다. 5 % 클로르헥시딘 (도 1D)을 적용하여 두피 소독.
  5. 피하에 5 ㎎ / ㎏ 카프로 펜 200 μL 식염수에 희석하여 주입. 건조 함을 방지하고 항상 열 패드에 동물을 유지하기 위해 수의사 눈 연고를 적용합니다. 운영 쌍안경에서 동물을 배치합니다.
  6. 미세 가위와 핀셋 (그림 1E)를 사용하여 두피의 피부에 1 cm 길이의 타원형 컷을 확인합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 골막을 잡고 미세 가위를 사용하여 절단.
  7. 치과 용 드릴을 사용하여 봉합 lambdoid 두개골 결함 2mm 전방 드릴ND 5 mm 외경 트레 (도 1F 및 G). 뇌경막의 침투를 방지하기 위해 뼈의 방법으로 3/4 드릴 주걱을 사용하여 뼈 조각을 분리.
  8. 자가 이식을 이식, 뼈 조각을 검색하고 파편을 제거하기 위해 10 ㎖를 멸균 생리 식염수를 포함하는 10mm 플라스틱 접시에 씻는다. 부드러운 조직을 제거하지 마십시오. 사전에 동종 이식을 동종 이식, 해동 이식 및 RT에 정상화 한 다음 씻어.
  9. 그래서 결함 마진 (그림 1H)을 터치하지 않습니다 곡선 핀셋을 사용하여 결함의 골 이식을 놓습니다. 피브린 겔을 사용하는 호스트 뼈 이식 (25 U / ㎖의 트롬빈 5 μL와 혼합 / ㎖ 피브리노겐 46 mg을 5 μL)를 붙인다.
  10. 4-0 vicryl 봉합사 (도 1I)을 사용하여 피부를 봉합. 수술 컷에 포비돈 - 요오드를 적용합니다. 주의 모피 의해 봉합사의 오염을 방지하기 위해주의해야한다. 마크 마우스 귀 주입 0.25 ㎎ / ㎏ Antisedan의 T오 메데 토미의 마취 효과를 반전.
  11. 동물이 10 분에 일어나 않는 경우는 예열 패드에 위치해 있는지 확인하십시오. 멸균 생리 식염수 200 μl를 주입, 0.1 ㎎ / ㎏ Antisedan 주입 필요한 경우. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
  12. 봉합을 열 것을 방지하기 위해 일주일 동안 분리 새장에 동물을 유지합니다. 며칠 후 영업 이익에 대한 케이지 바닥에 페트리 접시에 물에 담가 마우스 우를 놓습니다. 피하에게 수술 - 후 통증을 치료하기 위해 수술 후 3 일 동안 하루에 한번 멸균 식염수에 희석하여 1 ㎎ / ㎖ 카프로 펜 용액 200 μl를 주입한다.

그림 1
그림 1. 두개골 동종 이식 준비 및 두개골 결함은 수술. 뼈 조각은 두개골 영역 (A)에서 격리됩니다. 연조직골수 및 혈액 (B) 채취하고, 이식편은 인산 완충 식염수 (C, AG = 동종) 두 세척 한 다음 70 % 에탄올로 헹구었다. 받는 사람 마우스 두개골 영역 (D)에서 면도와 피부의 소독에 의해 수술을 위해 준비가되어 있습니다. 타원형 컷은 두피의 피부에서 생성되고, 골막은 (E)를 제거한다. 다음으로, 두개골 결함 5 mm 직경의 트레 (F)을 이용하여 천공된다. 뼈 조각이 그대로 우수한 시상 동 (G)를 떠나, 숟가락 모양의 주걱을 사용하여 분리된다. 이식 후 결함에 넣고 피브린 겔 (H)를 사용하여 고정된다. 마지막으로, 피부 (I) 봉합된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

의 특성 3. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영혈관 트리

  1. 헤파린 식염수를 준비합니다. 무게 2,000 U 나트륨 헤파린과 50ML 플라스틱 튜브에 넣습니다. 20 ml의 생리 식염수를 넣고 잘 튜브를 흔들. 15 mL를 20 mL의 루어 잠금 주사기 헤파린 식염수를 따뜻하게 채우고 23-G 두피 정맥 세트에 주사기를 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 붙입니다, / 분 1 ml의 10 ml의 펌프로 설정합니다.
  2. 50μl를 페노바르비탈 (65 ㎎ / ㎖; 100 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사를 사용하여 진정 마우스. 이 깊게 진정되어 있는지 확인하기 위해 동물의 다리를 꼬집어. 흡수성 표면 라이너 (그림 2A)로 감싸 고정 보드의 뒷면에 마우스를 고정합니다. 연기하는 사람 노출을 방지하기 위해 흄 후드에 고정 마우스를 놓습니다.
  3. 미세 가위와 핀셋 (그림 2B)를 사용하여 목 ​​복부의 피부를 잘라. 칼 모양의 과정 (그림 2C)까지 복부 벽을 잘라. 그것의 측면 측면을 따라 흉곽을 잘라. 폐 부상을 피하십시오D 마음과 마음이 완전히 노출되어 있는지 확인하십시오. 흉골 (그림 2D)를 철회 지혈제를 사용합니다.
  4. 나비 바늘을 좌심실 (그림 2E)에 3mm를 삽입합니다. 3 초 접착제 (그림 2 층)를 사용하여 심장과 가슴 벽에 바늘을 접착제.
  5. 즉시 펌프를 활성화합니다. 잠시 후, 혈관 (그림 2G)를 감압하기 위해 하대 정맥을 해부하다. 액체가 떨어져 머리에서 흘러 있도록 보드를 기울입니다. 성공적인 재관류는 간과 혈관을 제거 발생합니다.
  6. 헤파린 염수 관류가 완료되면, 4 % 포름 알데히드를 10 ㎖을 관류. 혈관에 공기 거품의 침투를 피하고 포름 알데히드 가스에 노출을 피하십시오. 성공적인 포름 알데히드 관류는 꼬리의 경직 발생합니다. 식염수를 헤파린 10 mL를 포름 알데히드를 플래시합니다.
  7. manufact의 따른 무선 불투명 조영제를 준비의 urer 지침. 전형적으로, 이는 화합물, 희석제, 및 경화제의 혼합을 필요로한다. 혈청 피펫을 사용하여 15 mL의 플라스틱 튜브의 용액을 혼합한다.
  8. / 분의 1 mL의 속도로 조영제 혼합물로 동물을 관류. 관상 장과 간 혈관을 관찰하고 그들이 2의 재관류 후 노란색 돌리고있다 있는지 확인 - 성공적인 재관류 (그림 2H)를 나타내는 3 ㎖. 재관류 완료하면, 버터 플​​라이 니들의 튜브를 절단 형 카 커스를 구하여 두개골 영역 용액의 누출을 방지하기 위해 휴지로 싸서. 4 ° CO / N의 중합을 허용합니다.
  9. 두개골 지역 (그림 2I)을 해부하다; 우선 관심의 뇌 영역의 손상을 방지, 가능한 한 측면으로 피부를 잘라 메스를 사용합니다. 10mm 떨어진 이식의 두개골 뼈를 잘라 미세 가위를 사용 후 골 이식을 찾아.
  10. 격리 CALV를 스캔μCT 스캐너를 사용하여 굴림 뼈 샘플; 200 밀리 초 360 ° 및 통합 시간 당 1,000 예측을 사용하여, 20.5 mm, 55 kVp의 X 선 에너지, 145 μA의 강도에보기의 필드를 설정합니다. 이미지를 다른 골 결손 모델에 μCT 매개 변수 (7)을 조정합니다.
  11. μCT 소프트웨어에 의해 생성 된 2 차원 재구성 조각을 준수하십시오. 관심 영역이 제대로 스캔 한 후 두개골 결함을 찾을 수 있는지 확인합니다. 관류의 품질을 평가한다. 혈관의 성공적인 식별 (도 2J) 후, 계속해서 증류수 (DDW)에 희석 6 % 트리클로로 아세트산 (TCA)를 사용하여 샘플을 석회.
  12. 3.10 절에 나타낸 파라미터를 이용하여 샘​​플을 재검색. 재구성 된 2D 조각에 Lambdoid 봉합을 찾습니다. 2mm, 8 mm 직경의 높이에 대한 관심 (VOI)의 원통형 볼륨을 정의, 즉, 봉합에 접선 - 이것은 결함의 해부학 사이트입니다.
  13. 세그먼트 일임계 글로벌 절차를 이용하여 연부 조직의 전자 골조직; (130)에 낮은 임계 값을 설정하고, 제약 3D 가우시안 필터 (시그마 [σ = 2.0 및 지원 = 2) 부분적으로 볼륨의 노이즈를 억제을 적용합니다. 3 차원 재구성을 생성하고 VOI가 제대로 (그림 2K)에 위치되어 있는지 확인합니다.
  14. IPL 소프트웨어 및 "dt_object_param"기능 (도 2L)를 사용하여 두께 맵을 생성한다.
    참고 :이 기능은 각각의 혈관 직경의 혈관 볼륨을 설명합니다.

그림 2
심장 접근법을 통해 전파 불투명 제를 사용하여도 2 관류. 마우스 정착 판 (A)에 부착하고, 피부는 목 (B)에 복부쪽으로 따라 절단된다. 복부 벽은 칼 모양의 proce을에 중간 라인업 따라 절단SS (C), 및 흉곽 측 방향 (D) 절단된다. 버터 플라이 니들은 (E는, 우심실이 흰 점선으로 표시된다) 현저 어두운 우심실로 삽입을 방지 좌심실에 삽입되고, 바늘은 심장 및 흉부 벽에 부착된다 (F) . 헤파린 식염수 (2-3 ml)을 마음에 펌핑하고, 하대 정맥을 해부한다 (G, 흰색 화살표는 하대 정맥을 나타냅니다). 포름 알데히드 (4 %) 관류와 세척된다 이 노란색으로 염색 한 라디오 불투명 한 조영제의 관류옵니다. 성공적인 관류 노란색 (H)에 색상을 변경 혈관의 거리만큼 명백 할 것이다. 중합 후, 두개골 영역 (I, AG는 = 동종 이식)을 분리하고 (J가, 관심의 볼륨이 주황색으로 표시됩니다) 적절한 관류를 확인하기 위해 μCT 스캐너를 사용하여 몇 군데 있습니다. 그만큼샘플 (K) 탈회하고 다시 스캔하고, 색깔의 두께지도 (L)이 발생 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

뼈 광물 화란과 혈액 관류 4. 형광 이미징

  1. 1.5 ML 튜브 2 nmol의 / 100 μL PBS의 농도 (혈액 관류를 측정하기 위해 뼈 광물 및 혈액을 매개로 형광 제를 모니터링하는 비스포스포네이트 - 복합 형광 프로브를 사용)에 프로브를 복원합니다. 부드럽게 여러 번 피펫은 프로브의 균일 한 용해를 보장합니다.
  2. 지정된 이미지 세션 전에 24 시간은 시간 제로 이미지를 촬영; 유도 챔버에 3 % 이소 플루 란으로 보충 된 100 %의 의료용 산소를 2 L / 분으로 흡입을 사용하여 마우스를 마취 3. 적절한 마취가 설정된 후, 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 낮출 - 2%.
  3. 건조 함을 방지하고 있는지 열 패드가 항상 켜져 있도록 수의사 눈 연고를 적용합니다. 이 깊이 마취되어 있는지 확인하기 위해 동물의 사지를 핀치. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 무인 때까지 동물을 두지 마십시오.
  4. 모발 성장의 방향에 대해 그것을 적용 헤어 커터를 이용하여 두개골 영역을 면도. 헤어 크림을 사용 모피 잔해를 제거합니다. 모든 모피 남은 광학 영상에 방해가됩니다. 미세 가위와 핀셋을 사용하여 봉합을 제거합니다.
  5. IVIS 무대에서 세 동물을 놓고 각 영상 세션을 37 ℃로 가온. 자동 노출 시간을 설정 C에 필드를 볼 수 있으며, 필터를 조정합니다. 예를 들어, 680 나노 미터의 빛 파장에서 최대 여기에 특징 비스포스포네이트 - 복합 형광 프로브, 675 나노 미터의 여기 필터와 Cy5.5의 발광 필터를 사용 . 이와 유사하게, 빛 파장 750 nm의 피크 여기에 혈액을 매개로 형광 제를 사용하는 경우710 나노 미터의 여기 필터 및 780 나노 미터의 방출 필터를 사용한다.
  6. 화상 "획득"버튼을 누르면 이미지 소프트웨어를 통해 살아있는 쥐. 확인 두개골 영역이 포괄적 인 가이드의 조언 임 등의 알 2009 8 (그림 3B) 완전히 볼 수 있는지 확인합니다.
  7. 마우스는 100 % 산소를 흡입 깨어 있도록 허용합니다.
  8. 정맥 꼬리 주입을 통해 2 nmol의 형광 프로브를 주입한다. 상기와 같이 지정된 영상 회의에서, 촬상을 수행한다.

골 재생 5. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영

  1. 4.3 - 4.2 단계에 도시 된 바와 같이, 골 형성의 정량화를 들어, 3 % 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스를 마취. μCT 스캐너 침대에 마우스를 이동, 스캐너에 넣습니다.
  2. μCT 스캐너의 X 선관 가능성 55 kVp의 에너지와 145 μA 중간 해상도의 강도를 설정합니다. 20.5 mm의 시야를 사용하여 수행스카우트 (단일 X 선)은 스캔과 두개골의 뒷면에 마우스의 눈에서 연장 관심 영역을 정의합니다. 200 밀리 초 360 ° 및 통합 시간 당 1,000 예측을 사용하여, CT 스캔을 수행합니다.
  3. 20 ㎛의 공칭 공간 해상도를 이용하여 2 차원 슬라이스를 재구성. μCT 소프트웨어 (9)를 사용하여 표준화 된 위치로 결함 여백을 맞 춥니 다.
  4. 유사, 3.20 단계 관심의 원통형 볼륨을 정의하고 제약 3D 가우시안 필터를 적용합니다 (σ = 0.8 및 지원 = 1) 부분적으로 볼륨의 노이즈를 억제 할 수 있습니다. 세그먼트 임계 글로벌 절차를 이용하여 연부 조직의 골조직.
  5. 관심의 볼륨 광물 뼈 조​​직의 볼륨을 결정합니다.

줄기 세포 모집 및 차별화 6. 생물 발광 영상

  1. 섹션 4.2-4.4에 묘사 된 100 % 산소를 흡입하여 쥐를 깨어으로 이미징 마우스를 준비합니다.
  2. (1)를 관리26 밀리그램 / 복강 내 주사를 통해 각 마우스 kg의 딱정벌레 루시페린, 그리고 유도 챔버에 동물을 반환합니다. 2 분 후, 3 % 이소 플루 란을 이용하여 동물을 마취. IVIS에 마우스 무대를 따뜻하게 놓습니다.
  3. 이미지 소프트웨어 리빙 통해 노출 시간에 "자동"과 C. 화상에 시야 루시페린 투여 후 생쥐를 5 분으로 설정. 형질 전환 유전자의 발현은 마우스 사이에서 변화 때문에 화상 "생물 발광"양상을 사용하여 단계 4.6에 도시 된 바와 같이 동물은, 관심 영역을 정의한다. 꼬리에 두개골 신호를 정상화.

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Representative Results

신생 혈관은 혈액 관류를 정량화하는 형광 혈액을 매개로 에이전트를 사용 μCT 체적 분석과 FLI에 의해 평가 하였다. 세븐 일 수술 후, μCT 검사는 C57BL / 6 (그림 3A)에서 수확 동종 이식을받은 쥐에 비해자가 이식을받은 생쥐의 중소 직경 혈관의 상당히 높은 볼륨을 보여 주었다. 흥미롭게도, 자가골 그룹에 새로 형성된 혈관 트리 이식 군에서 혈관 외부 에지에서 결함 부위를 관통하도록 나타나 단지 제한된 범위 안으로 연장하는 반면, 전체 결함 영역에 도달하는 것처럼 보였다. FLI는자가 이식 처리 된 동물 (그림 3B)에서 유의하게 더 높은 혈액 관류를 보여주는이 관찰을 지원했다. 14 일째에 의해, 동종 이식 군에서 혈관 트리 그래프트의 근접성 모두에 도달하면서도 용기 부피는 비교 낮았다우리가 조사 대부분의 혈관 직경의자가 이식 그룹 (그림 3C)에. 참고 : 0.08- 0.1 mm의 직경 혈관 비교했을 때 용기 부피의 차이가 가장 눈에 띄는했다. 스물 팔일 수술 후 혈관의 부피는베이스 라인 (그림 3D)로 돌아왔다.

세븐 일 수술 후, FLI는 하이드 록시 아파타이트 지시 프로브가자가 이식 그룹 (그림 4A)에서 유의하게 더 큰 뼈 광물을 입증하여 수행. 그때까지, 뼈 이식술 주입 동물에 이식 근접에 걸쳐 형성했다. 대조적으로, 주입 된 동종 이식 마우스에서 골 결손은 여백에 형성했고, 링 형상에 의해 표시되었다. 골 형성 볼륨 μCT 분석 (도 4B)를 수행하여, 재생 공정의 종료 시점에서, 수술 후 오십육일 정량 하였다. 골 부피는 현저히 (도 4C)과 높은 그래프트 생이었다자가 이식 (그림 4D)를받은 동물에서 유의하게 ckness. BLI는 골아 혈통 (도 4E)쪽으로 줄기 세포의 분화 및 모집을 모니터링 오스테오칼신 루시페라아제 - 형질 전환 마우스에서 사용 하였다. 덮개 뼈에서 측정 된 신호가 꼬리 측정보다 15 배 높았다 때, 수술 후 7 일 - 동종 이식 마우스에서, BLI 신호는 4 정점. 이식술 주입 된 마우스에서, BLI 신호는 잠시 후 고점 7~10일 수술 후 및 도달 높았다 2 배 높은 덮개 뼈 - 꼬리 비율 (도 4F 참조).

그림 3
그림 3.자가 이식 주입이 용이 혈관. 두개골 결함은 쥐에서 만든. 동물의 절반은 동종 이식을받은 나머지 절반은자가 이식을 받았다. 그만큼마우스는 수술 후 7 일째 중합 조영제로 관류 하였다. 두개골 영역은 단리 및 샘플 탈회이었고 μCT 스캐너를 이용하여 이미징. 체적 두께 맵 IPL 소프트웨어를 사용하여 생성 (A를, N = 3, ± SE의 막대를 나타내고, 별표는 p <0.05를 나타낸다) 하였다. 마우스는 육일 수술 후 형광 혈액을 매개로 프로브를 주사 하였다. 24 시간 이상 동물 FLI을 실시 하였다 및 정량 분석을 수행 한 (B, N = 5, 바 ± SE를 대표하고, 별표 P <0.05를 나타냅니다). μCT 기반 혈관 분석을 수행 한 (14) (C)과 28 일 (D) 수술 후. (C와 D, N = 3, 바는 ± SE를 나타내고, 별표 P <0.05를 나타냅니다) 큰 볼하려면 여기를 클릭하십시오 했습니다이 그림의 rsion.

그림 4
자가 이식의 그림 4. 주입은 동종 이식. 마우스의 더 많은 골 형성보다 주입이 두개골자가 이식 또는 동종 이식의 이식을받은 추진하고 있습니다. 생쥐는 나중에 6일 수술 후 IV 주입에 의해 하이드 록시 아파타이트 타겟 프로브 주사 하였다. 24 시간 후 FLI 및 정성 분석은 생체 μCT 분석 오십육일 수술 후에 수행 하였다. (A, N = 5, 바는 ± SE를 나타내는 것으로, 별표는 P <0.05를 나타낸다)을 수행하고, 관심있는 원통형 용적은 표시된 오렌지 (B) 정의 하였다. 뼈 볼륨 (C) 및 이식 두께 (D)는 (8, 바 ± SE들을 나타내는 N = 및 별표 P <0.05 표시) 정량화 된 루시 페라 제 DRI을 표현 .Transgenic 마우스를오스테오칼신 프로모터에 의해 벤은 동종 이식이나자가 이식 받았다. BLI 10 일 수술 (E)뿐 아니라 이후 추가 지정 시간 지점에서 수행 하였다. 발현 수준은 (N = 8, 바 ± SE의를 나타내며, 별표는 P <0.05를 표시, F) 마우스 가운데 다르기 때문에 두개골 지역에서 측정 된 신호는. 표준화했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 조영 방법의 목적은 뇌신경 골 이식의 맥락에서 혈관 신생 골 형성의 축 세심한 조사를 가능하게하는 것이다. 신생 혈관은 뇌 전체 결함 공급 혈관 트리의 정확한 고해상도 3D 데모 허용 μCT 프로토콜을 사용하여 영상화 하였다. μCT 데이터 용이 IPL 같은 소프트웨어와 같은 고급 툴을 사용하여 분석 될 수있다. 예를 들어,도 3c에 도시 된 두께 분석 뇌 자가골 이식과의 주요 차이점은 0.1 내지 혈액 세동맥 10 특징 직경 0.08 mm로까지 용기에 있다고 밝혔다. 이 결과는 긴 뼈 (11)에서 수행되는 모델 연구와 일치한다. 이 0.02mm의 직경의 검출 가능한 좁은 용기가 완전히 인해 무선 - 불투명 화제의 점도로 주조되지 않도록 유의해야한다. 이 방법의 주요 단점은 수반한다는 사실동물을 안락사, 따라서 길이 이미징은 불가능하다. 여러 라디오 불투명 한 프로브는 생체 내 혈관 μCT 이미징 사용할 수 있습니다; 그러나, 이들은 무선 불투명 고밀도 중합 프로브뿐만 아니며, 화상 해상도는 여기서 도시 12 생체 외 방법에 의해 제공되는 것을 만족하지 않는다. μCT 해상도에 제한이 있으며, 예를 들어, 모세 혈관을 연구하는 것이 유용 할 수 없습니다. 숙련 된 손의 도움을, 그 외에는이 방법은 구체적으로 뼈의 혈관을 연구하는 재현 기술을 제공합니다.

도시 된 프로토콜에서의 하나의 중요한 단계는 결함 위치 (단계 2.7)의 결정이다. lambdoid 봉합에 부상 대량 출혈로 이어질 것입니다. 두개골 결함을 드릴 때,주의가 부하 뇌경막과 우수한 시상 동을 방해하지 않도록주의해야한다. 좌심실에 나비 바늘의 마지막, 삽입은 섬세한 절차 (단계 3.4)입니다. 바늘이 삽입 인 경우발기 부전은 우심실로, 조영제는 폐 관류하고 덮개 뼈의 가난한 관류로 이어지는 정맥로 이동합니다. 바늘이 너무 깊이 삽입 될 경우, 후방 심장 벽을 관통하는 것; 바늘이 충분히 삽입되지 않은 경우, 쉽게 떨어져 마음에서 눈물 수 있습니다. 당신이 관류를 방해 할 수 있으므로 바늘 위치를 다시 조정하지 마십시오. 방법은 가능한 형광 프로브 세트를 이용하여 변형 될 수있다; 인테그린 α-β의 3 V -targeted 프로브 카 텝신 K-타겟 프로브는 파골 세포 활성을 정량하는 데 사용될 수 있지만, 새롭게 형성된 혈관을 강조하는 데 사용될 수있다.

우리의 가설에 따라, 우리는 두 개관자가 이식은 동종 골 형성보다 높은 가능성을 가지고 있음을 관찰 하였다. 이뿐만 아니라 긴 뼈 (13) 사실과 여러 가지 요인에 기인 할 수있다. 먼저, 이식술은 그래프트 걸쳐 골 기질을 제조 골 형성 세포를 포함표면, 광물 지시 FLI (그림 4A)에서 알 수 있듯이, 반면 동종 만 결함 여백 부족한 골 형성을 유도한다. 둘째, 오스테오칼신 뤽 마우스 BLI는 동종 준비 처리 (도 4F)에서 제거 된 성장 인자의 존재에 의해 설명 될 수 자가골 기, 더 많은 골 형성 활성을 밝혔다. 흥미롭게도, 골 광화는 수산화 인회석 타겟 프로브를 투여 한 날 (6, 7)에서 유의하게 높았다 및 BLI 활성으로 표시되는 세포 분화 우리가이 추론 할 수있는 일 7 일 (10) 사이, 나중에 명백했다 더 광범위한 그 골 광화 적어도 부분적 자가골 이식을 특징 유리한 혈관계에 의해 설명 될 수있다.

우리의 결과는 이식술이 우수한 골 형성 능력을 가지고 있음을 나타냅니다; 그러나, 하나는 자가골 이식은 여러 DRA이 있는지 고려한다wbacks. 뼈 수확은 볼륨 제한하고 공여부 14-16로 이환율을 수반한다. 또한, 골 이식술 흡수의 발생 빈도는 17 ~ 19 무시할 수 없습니다. 동종 이식은 매우 사용할 수 있으며, 임상의를위한 상용 솔루션을 제시한다. 여러 작품 뇌 동종 이식 골관절염 통합 보조제 요법에 BMP2 부호화 아데노 - 관련 바이러스 (20, 21)과 동종 코팅에서 이러한 간헐적 요법 부갑상선 22 레인 징, 다른 수단에 의해 강화 될 수있는 방법을 증명하고있다. 뼈와 병합 할 수있는 동종의 능력이 완성되면 결국, 동종 이식이 선호 이식 재료가 될 것이다.

이러한 결과에 비추어, 특히 관심이 골 재생의 사이트에서 혈관 신생을 조절하는 방법을 질문에있다. 혈관 형성은 누설 방지 동작하고을 형성하지 않는 과발현 VEGF의 직접적인 접근 방식은 비효율적 발견23, 24 순 ONAL. 흥미롭게도,이 BMP 신호 전달은 혈관 (25), (26)의 타겟 형성을 유도 한 것으로 나타났습니다. 또한, 약제 (11)와 전지 (27)는 뼈 치료 그래프트 근방에서 혈관 패턴을 변경하기 위해 도시되었다; 두 두개골 뼈 결함 치유를 향상시키기 위해 본 유망한 전략에 접근한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

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References

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