טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

השרשה של שתלי עצם אוטולוגית ואלוגנאית מהווה קיבלה גישות לטיפול באובדן עצם craniofacial גדול. עם זאת, ההשפעה של הרכב שתל על יחסי הגומלין בין neovascularization, התמיינות תאים והיווצרות עצם לא ברורה. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multimodal נועד על מנת להבהיר את התלות ההדדית אנגיוגנזה-Osteogenesis בקרבת השתל.

Cite this Article

Copy Citation

Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרמטר עיקרי קביעת ההצלחה של הליך השתלת עצם הוא כלי דם באזור המקיף את השתל. חוקרים שערנו כי השתלה של autograft עצם יגרום התחדשות עצם גדולה יותר על ידי היווצרות כלי דם בשפע. כדי לחקור את ההשפעה של השתל על neovascularization באתר הפגם, שפיתחנו טומוגרפיה גישה מחושב מיקרו (μCT) לאפיין חדש יוצרים כלי דם, הכולל זלוף המערכתי של בעלי החיים עם חומר ניגוד polymerizing. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של כלי דם איברים בשלמותו. בנוסף, זלוף הדם הוערך באמצעות הדמיה הקרינה (FLI) של סוכן ניאון שמקורן בדם. היווצרות עצם הייתה לכמת ידי FLI באמצעות בדיקה-ממוקד hydroxyapatite וניתוח μCT. גיוס תאי גזע היה פיקוח על ידי הדמיה פליטת אור (BLI) של עכברים הטרנסגניים המבטאות לוציפראז תחת השליטה של ​​אמרגן osteocalcin.כאן אנו מתארים ומדגימים הכנת השתל, ניתוח פגם calvarial, פרוטוקולי סריקת μCT למחקר neovascularization וניתוח היווצרות עצם (כולל זלוף vivo של חומר ניגוד), והפרוטוקול לניתוח נתונים.

הניתוח ברזולוציה גבוהה 3D של כלי דם הפגין אנגיוגנזה הגדולה יותר באופן משמעותי בבעלי חיים עם autografts המושתל, במיוחד ביחס להיווצרות עורקיק. בהתאם לכך, זלוף הדם היה גבוה יותר משמעותי בקבוצת autograft מהיום ליום 7 בלאחר ניתוח. אנו נצפו מינרליזציה עצם מעולה ויצירת עצם גדולה יותר נמדדה בבעלי חיים שקיבלו autografts. השתלת autograft גיוס תאי גזע תושב מושרה לתפר עצם שתל-מארח, שבו התאים מובחנים לתאי יוצרי עצם בין ה -7 ל -10 היום לאחר ניתוח ה. ממצא זה אומר שיצירת עצם משופרת ניתן לייחס להאכלת כלי הדם המוגברת המאפיינת את השתלת autograft. השיטות מתוארות יכולות לשמש ככלי אופטימלי ללמוד התחדשות עצם במונחים של יצירת עצם מתוחמת בחוזקה וניאו-וסקולריזציה.

Introduction

איבוד עצם Craniofacial עקב טראומה, כריתת גידול, craniotomy decompressive, ופגם מולד נדיר מרפא בעצמו ומציג צורך קליני מסופק ברור. שתלי עצם אוטולוגית ושתלי עצם אלוגנאית נמצאים בשימוש נרחב לטיפול במצבים אלה 1.

זה מקובל שOsteogenesis מצמיד באופן הדוק עם אנגיוגנזה 2,3. כך, המחקר של טיפול מוצע להתחדשות עצם המלא צריך לכלול חקירה מקיפה של עץ כלי הדם ויוצר בכל אתר המום כולו. ישנן מספר שיטות זמינות כדי לאפיין כלי דם במודלי מחקר. עץ כלי הדם יכול להיחקר על ידי ניתוח היסטולוגית. מאז היסטולוגיה מסתמכת על חתך רקמה, קיים סבירות גבוהה שהתמונה המתקבלת תהיה מעוותת. כדי לטפל בבעיה זו, מיקרוסקופיה intravital יכולה להתבצע לכלי דם בשלמות תמונה 4; עם זאת, שיטה זו היאמוגבל להדמיה אחד-מטוס. סריקת μCT של דגימות שהתקבלו מבעלי חי perfused עם חומר ניגוד מאפשרת הדמיה 3D של רשת כלי דם המזינה את אתר ההתחדשות 5. גישה זו מאפשרת להפגנה מפורטת מאוד של כלי הדם של איבר בכללותו, כמו גם ניתוח קפדני של הפצת כלי דם. יתר על כן, μCT מאפשר בידול בין קטרים ​​המגוונים של כלי דם, המאפיינים את תת-הסוגים השונים של כלי דם.

חוקרים שערנו כי השתלה של autograft calvarial יגרום neovascularization גדול יותר מהשתלה של שתל, וזה עלה neovascularization יוביל, בתורו, לעצם משופר formation.To להמשיך השערה זו אנו מועסקים במגוון טכניקות. חקרנו דפוסים של עץ כלי דם החדש שנוצר על ידי ביצוע ניתוח מבוסס μCT. מדדנו זלוף דם באמצעות בדיקה דם ניאון-בריכה. , אנו ישבנים הבאמינרליזציה רקמת עצם SED ידי FLI של בדיקה מכוונת hydroxyapatite וניתוח μCT. לבסוף, אנו פיקוח גיוס תאי גזע ובידול, ביצוע BLI בעכברים מהונדסים שבי לוציפראז מתבטא בתאי osteocalcin-חיובי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת עברית ירושלים, ישראל (בקשת מס 'MD-12-13524-4), מתקן AAALAC אושר, ועל ידי מרכז רפואי Cedars-Sinai IACUC (בקשת מס '3770). טופלו בעלי החיים בהקפדה על הנחיות NIH.

1. הכנת Allografts העצם

  1. להרדים עכברי 7- 8 שבועות בן BALB / C, או כל זן שונים מהנמען, תוך שימוש בשיטה סטנדרטית של CO 2 שאיפה או הזרקת intraperitoneal של 50 phenobarbital μl (65 מ"ג / מיליליטר .; 100 מ"ג / קילוגרם). לאשר את ההיעדרות של פעימות לב ולבצע נקע בצוואר הרחם. לחלופין, לקצור allografts מפגרים שנשמרו ב-20 ° C והפשירו לפני הקציר.
  2. לגלח את אזור calvarial באמצעות גוזז שיער, ליישם אותו נגד כיוון צמיחת שיער. לחטא את ראש הפגר על ידי יישום 70% isopropanol. חותך את עור הקרקפת באמצעות אזמל מס '11 ולהסיר את קרום העצם.
  3. באמצעות מקדח שיניים ומקדחה פנימי בקוטר 4.5 מ"מ, לנתק את קטע מעגלי של עצם calvarial. העבר את בר העצם לצלחת פלסטיק 100 מ"מ המכילה תמיסת מלח סטרילית. בשלב זה, להתבונן דם ורקמות רכות שצורפו לבר עצם (איור 1 א). להשיג שברי עצמות בצורה זו מ -22 תורמים.
  4. החזק בר עצם אחת בכל פעם באמצעות פינצטה המעוקלת. ספוגיתו באמצעות מוליך כותנה הטתה באופן יסודי ולהסיר את כל רקמת מוח, רקמות רכות, ודם (איור 1). לחתוך בעדינות כל שבבי עצם שנשארים צמוד לשתל באמצעות מספריים בסדר, כך שהשתל יהיה צורה מעוגלת מושלמת.
  5. טובלים כל שתל פעם אחת בצינור 15 מיליליטר המכיל 70% אתנול ופעמים ב 15 מיליליטר צינורות המכילים פוספט שנאגרו מלוח לשטוף אתנול.
  6. להקפיא את allografts במקרר -80 ° C בcryotubes בלפחות שבוע. 1 בשלב זה, לוודא allografts מופיע שקוף (איור 1 ג).

ניתוח 2. calvarial פגם

  1. לנמענים להשתמש עכברים הטרנסגניים המבטאים לוציפראז תחת השליטה של אמרגן osteocalcin 6.
  2. לעקר את הטיפים של הכלים כירורגיים באמצעות תנור חרוז זכוכית למשך 30 שניות. העבר את הכלים לצנצנת המכילה 70% isopropanol כדי לשמור על תנאים סטריליים. השתמש בכפפות סטריליות.
  3. הרדימי נקבת עכבר 7- 8 שבועות בן בזריקת intraperitoneal של תערובת ketamine- medetomidine (75 מ"ג / קילוגרם ו1 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה). לצבוט את האיבר מן החי כדי לוודא שהוא הרדים עמוק. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד ששב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
  4. לגלח את אזור calvarial באמצעות גוזז שיער על ידי יישום זה נגד כיוון צמיחת שיער. החל הסרת שיער קרם להסרת כל שאריות פרווה ולנגב אותו after לא יותר מ 2 דקות באמצעות גזה יבשה ואחריו גזה ספוגה מלוחה. יש להקפיד להימנע מקבלים את זה בעיניים. לחלופין, משחת עיני וטרינר יכול להיות מיושם לפני הסרת שיער בשכבה נוספת של הגנה לעיניים. זה הכרחי כי כל העקבות של הקרם מקריח יוסרו כדי למנוע גירוי אפשרי מחשיפה מוגזמת לסוכן הכימי. לחטא את הקרקפת על ידי החלת 5% chlorhexidine (1D איור).
  5. להזריק מתחת לעור 5 מ"ג / קילוגרם carprofen מדולל ב200 מלוח μl. החל משחה העין וטרינר כדי למנוע יובש ולשמור על בעלי החיים ברפידת תרמית בכל העת. מקם את החיה תחת משקפת ההפעלה.
  6. לעשות חתך סגלגל 1 סנטימטר ארוך בעור הקרקפת באמצעות מספריים ופינצטה (איור 1E) בסדר. החזק את periosteum באמצעות פינצטה המעוקלת ולחתוך באמצעות מספריים בסדר.
  7. מקדחת מ"מ הקדמי calvarial פגם 2 לתפר lambdoid באמצעות מקדח שינייםND מקדחה חיצוני בקוטר 5 מ"מ (איור 1F ו- G). כדי למנוע חדירה של מאטר הדורה, לקדוח שלושה רבעי הדרך לתוך העצם ולנתק את בר העצם בעזרת מרית.
  8. להשתיל autograft, לאחזר את בר העצם ולשטוף אותו בצלחת פלסטיק 10 מ"מ המכילות 10 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר שאריות. אל תסיר את הרקמות הרכות. להשתיל שתל, הפשרה מראש שתל ולנרמל אותו לRT, ולאחר מכן לשטוף אותו.
  9. מניחים את שתל העצם בפגם באמצעות פינצטה המעוקלת כדי שלא לגעת בשוליים הפגם (איור 1H). מדביקים את השתל לעצם המארח באמצעות ג'ל הפיברין (5 μl של 46 מ"ג / מיליליטר פיברינוגן מעורבב עם 5 μl של 25 U / תרומבין מיליליטר).
  10. לתפור את העור באמצעות תפר 4-0 vicryl (איור 1 ט). החל povidone- יוד לחתך הניתוחי. יש להקפיד כדי למנוע הזיהום של התפר בפרווה. 0.25 מ"ג / קילוגרם לא Antisedan אוזן העכבר ולהזריק מארקo להפוך את השפעת ההרדמה של medetomidine.
  11. אם החיה אינה מתעוררת ב 10 דקות, לוודא שהוא ממוקם על משטח מחומם. להזריק 200 μl תמיסת מלח סטרילית, ואם יש צורך להזריק 0.1 מ"ג / קילוגרם Antisedan. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד התאושש לחלוטין.
  12. שמור את החיות בכלובים מופרדים במשך שבוע כדי למנוע מהם לפתוח את התפרים. מניחים אוכל עכבר ספוג במים בצלחת פטרי על רצפת הכלוב למנותח כמה ימים. להזריק תת עורי 200 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון carprofen המדולל בתמיסת מלח סטרילית פעם ביום במשך 3 ימים לאחר ניתוח לטיפול בכאב לאחר ניתוח.

איור 1
איור 1. calvarial שתל ההכנה וcalvarial פגם ניתוח. בר העצם מבודד מאזור calvarial (). טישו רך, מח עצם, והדם ניקו (ב '), והשתל הוא שטף באתנול 70% ואחריו שני שוטף בפוספט שנאגרו מלוח (C, AG = שתל). עכבר הנמען מוכן לניתוח על ידי גילוח וחיטוי של עור באזור calvarial (ד '). לחתוך סגלגל נוצר בעור הקרקפת, וperiosteum מוסר (E). בשלב הבא, פגם calvarial הוא קדח באמצעות מקדחה 5 מ"מ בקוטר (F). בר העצם מנותק בעזרת מרית בצורת כפית, עוזב את סינוס מעולה sagittal שלם (G). השתל ממוקם אז בפגם ומאובטח באמצעות ג'ל הפיברין (H). לבסוף, העור נתפר (I). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת לאפיוןעץ כלי הדם

  1. הכן מלוח heparinized. משקל 2,000 הפרין סודיום U ולמקם אותו בצינור פלסטיק 50 מ"ל. הוסף 20 מיליליטר מלוח ולנער היטב את הצינור. ממלאי מזרק מנעול 20 מ"ל Luer עם 15 מיליליטר חימם מלח heparinized ולחבר את המזרק לסט וריד קרקפת 23-G. להדביק את המזרק למשאבת מזרק, ולהגדיר אותו כדי לשאוב 10 מיליליטר ב 1 מיליליטר / דקה.
  2. שקט ורגוע עכבר באמצעות זריקת intraperitoneal של phenobarbital 50μl (65 מ"ג / מיליליטר .; 100 מ"ג / קילוגרם). לצבוט איבר של בעל החיים כדי לוודא שהוא מורדם. אבטח את העכבר על גבה ללוח קיבעון עטוף באוניית משטח סופגת (איור 2 א). מניחים את העכבר הקבוע במנדף, כדי למנוע חשיפת עובדים לעשן.
  3. חותך את העור מהבטן לצוואר באמצעות מספריים ופינצטה (איור 2) קנס. חותך את דופן הבטן עד לתהליך xiphoid (איור 2 ג). חותך את הצלעות לאורך הצד הלטרלי שלה. למנוע פציעת הריאותלב ד, ולוודא הלב חשוף באופן מלא. השתמש hemostat לחזור עצם החזה (איור 2 ד).
  4. הכנס את מחט פרפר 3 מ"מ לתוך החדר השמאלי (איור 2E). מדביקים את המחט אל הלב וחזה הקיר באמצעות דבק 3 שניות-(איור 2F).
  5. הפעל את המשאבה מייד. אחרי דקה, לנתח את נחות הווריד הנבוב כדי לְהַפִיג לַחַץ כלי הדם (איור 2G). הטה את הלוח כך שנוזלים יזרמו מהראש. זלוף המוצלח יגרום ניקוי הכלים הכבד ודם.
  6. כאשר זלוף המלוח heparinized הושלם, perfuse 10 מיליליטר של פורמלדהיד 4%. הימנע חדירה של בועות אוויר לתוך כלי הדם ולהימנע מחשיפה לאדי פורמלדהיד. זלוף פורמלדהיד המוצלח יגרום התקשות של הזנב. לשטוף את פורמלדהיד עם 10 מיליליטר heparinized מלוח.
  7. הכן את חומר ניגוד הרדיו-אטום פי manufactהוראות urer. בדרך כלל, זה ידרוש ערבוב מתחם, diluent, וסוכן ריפוי של. השתמש בטפטפות סרולוגיות ומערבבים את הפתרון בצינור פלסטיק 15 מיליליטר.
  8. Perfuse את החיה עם תערובת חומר ניגוד בשיעור של 1 מיליליטר / דקה. שימו לב כלי דם כלילי, מעיים וכבדים ולוודא שהם פונים צהובים לאחר טפטוף של 2 - 3 מיליליטר, המציין זלוף המוצלח (איור 2H). עם השלמת זלוף, לחתוך צינורות של מחט הפרפר, לקבל את הפגר לבד ולעטוף אותו בנייר טואלט כדי למנוע דליפה של הפתרון לאזור calvarial. לאפשר פילמור ב 4 ° CO / N.
  9. לנתח את אזור calvarial (איור ט 2); הראשון להשתמש אזמל כדי לחתוך את העור כרוחב ככל האפשר, הימנעות נזק לאזור הגולגולת של עניין. אתר את שתל העצם ולאחר מכן להשתמש במספריים עדינים לחתוך את עצם גולגולת 10 מ"מ מהשתל.
  10. סרוק את calv המבודדיםמדגם עצם Arial באמצעות סורק μCT; להגדיר שדה הראייה ל20.5 מ"מ, אנרגיית רנטגן של 55 KVP, עוצמה של 145 מיקרו-אמפר, באמצעות 1,000 תחזיות לשל 360 מעלות ואינטגרציה זמן של 200 אלפיות שניים. להתאים את הפרמטרים μCT 7 לדגמי פגם עצם אחרים תמונה.
  11. שים לב לפרוסות 2D המשוחזר שנוצרו על ידי תוכנת μCT. הקפד לסרוק את האזור של עניין הוא כראוי ולאחר מכן אתר את פגם calvarial. להעריך את האיכות של זלוף. לאחר זיהוי המוצלח של כלי דם (י 2 איור), להמשיך וdecalcify המדגם באמצעות 6% Trichloroacetic החומצה (TCA) בדילול מלא זוגיים מים מזוקקים (DDW).
  12. לסרוק מחדש המדגם באמצעות הפרמטרים שצוינו בסעיף 3.10. אתר את תפר Lambdoid בפרוסות 2D המשוחזר. להגדיר נפח גלילי של עניין (VOI) בגובה של 2 מ"מ וקוטר 8 מ"מ, שמשיק לתפר - זה האתר האנטומי של פגם.
  13. ה מגזררקמת עצם דואר מרקמות רכות באמצעות הליך thresholding גלובלי; לקבוע את הסף התחתון ל -130, ולהחיל מסנן מוגבל 3D גאוס (Sigma [σ] = 2.0 ותמיכה = 2) לדכא באופן חלקי רעש בכרכים. צור שחזור 3D ולוודא VOI ממוקם כראוי (איור 2K).
  14. ליצור מפת עובי שימוש בתוכנת IPL והפונקציה "dt_object_param" (איור 2L).
    הערה: פונקציה זו מתארת ​​את כלי נפח לכל קוטר כלי.

איור 2
איור 2. זלוף באמצעות סוכן רדיו-אטום באמצעות גישת הלב. העכבר מודבק ללוח הקיבוע (), והעור נחתך לאורך הבטן עד הצוואר (B). דופן הבטן היא לחתוך לאורך הקו עד המדיאלי לproce xiphoidss (C), וכלוב הצלעות הוא לחתוך רוחבי (ד '). מחט פרפר מוכנסת לתוך החדר השמאלי, הימנעות הכנסה לתוך החדר ממני, שהוא במידה ניכרת כהה יותר (E, החדר ממני הוא הצביע על ידי הקו המקווקו הלבן), ואת המחט מודבקת בלב וחזה הקיר (F) . מלח heparinized (2-3 מיליליטר) נשאב לתוך הלב, והווריד הנבוב הנחותים הוא גזור (G, חץ לבן מציין את הווריד הנבוב הנחות). פורמלדהיד (4%) הוא perfused ונשטף החוצה; זה ואחריו זלוף חומר ניגוד רדיו-אטום-צבוע הצהוב של. זלוף המוצלח יהיה ברור על ידי שחרור של כלי הדם, אשר משנים את צבעם לצהוב (H). לאחר פילמור, אזור calvarial מבודד (אני, AG = שתל) והדמיה באמצעות סורק μCT כדי לאשר זלוף הנכון (J, נפח של עניין מסומן בכתום).המדגם הוא נטול הסידן וייסרק (K), ואחריו דור של מפה צבעונית עובי (L). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. דימות פלואורסצנטי של עצם מינרליזציה והדם זלוף

  1. מחדש בדיקות לריכוז של 2 nmol / 100 μl PBS בצינור 1.5 מיליליטר (השתמש בדיקה ניאון בביספוספונטים מצומדות- לפקח מינרליזציה עצם וסוכן ניאון שמקורן בדם כדי למדוד זלוף דם). פיפטה בעדינות מספר פעמים על מנת להבטיח המסה אחידה של החללית.
  2. 24 שעות לפני פגישת ההדמיה המיועדת לקחת תמונת זמן-אפס; להרדים 3 עכברים באמצעות 2 L משאיפת / דקה של 100% חמצן כיתה רפואית בתוספת 3% isoflurane בתא אינדוקציה. לאחר הרדמה נכונה כבר נקבעה, להפחית את הריכוז isoflurane ל -1.5% - 2%.
  3. החל משחה העין וטרינר כדי למנוע יובש ולעשות רפידת תרמית בטוחה מופעלת בכל העת. לצבוט את האיבר מן החי כדי לוודא שהוא הרדים עמוק. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד ששב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
  4. לגלח את אזור calvarial באמצעות גוזז שיער ליישם אותו נגד כיוון צמיחת שיער. הסר שאריות פרווה באמצעות הסרת שיער קרם. כל שריד פרווה יפריע הדמיה אופטית. הסר תפרים באמצעות מספריים ופינצטה בסדר.
  5. הנח שלוש חיות על הבמה IVIS חימם עד 37 מעלות צלזיוס במשך כל פגישת הדמיה. הגדרת זמן חשיפה לרכב, להציג שדה ל- C, ולהתאים את המסננים. למשל, לבדיקת ניאון בביספוספונטים מצומדות- המאופיינת עם עירור מקסימאלי באור באורך הגל של 680 ננומטר, להשתמש מסנן עירור של 675 ננומטר ומסנן פליטה של Cy5.5 . באופן דומה, בעת שימוש בסוכן ניאון שמקורן בדם עם עירור שיא בגל אור 750 ננומטרלהשתמש מסנן עירור של 710 ננומטר ומסנן פליטה של ​​780 ננומטר.
  6. תמונת העכברים דרך החיים תוכנת תמונה על ידי לחיצה על כפתור "רכישה". ודא אזור calvarial גלוי לחלוטין (איור 3 ב) ללייעץ מדריך מקיף אל הים et 2009 8.
  7. לאפשר לעכברים ער שאיפת 100% חמצן.
  8. להזריק את הבדיקה ניאון 2-nmol באמצעות הזרקה תוך ורידית זנב. בפגישה ההדמיה המיועדת, לבצע הדמיה כפי שתואר לעיל.

5. מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת להתחדשות עצם

  1. לכימות של יצירת עצם, להרדים את העכבר על ידי שאיפה של 3% isoflurane, כמתואר בשלב 4.2-4.3. העבר את העכבר למיטת סורק μCT, ולמקם אותו בסורק.
  2. הגדר אנרגיה של סורק μCT צינור רנטגן פוטנציאל 55 KVP ועוצמה של 145 מיקרו-אמפר רזולוציה בינונית. שימוש בשדה הראייה של 20.5 מ"מ, לבצעהסקאוט (רנטגן היחיד) לסרוק ולהגדיר אזור של עניין המשתרע מהעיניים של העכבר לחלק האחורי של הגולגולת שלה. לבצע סריקת CT, באמצעות 1,000 תחזיות לזמן 360 מעלות ואינטגרציה של 200 אלפיות שניים.
  3. לשחזר את פרוסות 2D באמצעות רזולוציה מרחבית נומינלית של 20 מיקרומטר. יישר את שולי פגם לעמדה אחידה באמצעות μCT 9 תוכנה.
  4. בדומה לצעד 3.20, להגדיר נפח גלילי של עניין ולהחיל את מסנן גאוס 3D מוגבל (0.8 σ = ותמיכה = 1) ללדכא את רעש בכרכים באופן חלקי. קטע רקמת העצם מרקמות רכות באמצעות הליך thresholding גלובלי.
  5. לקבוע את עוצמת הקול של רקמת עצם mineralized בהיקף של עניין.

6. הדמיה פליטת אור של גיוס תאי גזע ובידול

  1. הכן את העכבר להדמיה כמתוארת בסעיפים 4.2-4.4 וער העכברים על ידי שאיפה של 100% חמצן.
  2. נהל 126 מ"ג / קילוגרם luciferin חיפושית לכל עכבר באמצעות זריקת intraperitoneal, ולהחזיר את בעלי החיים לתא האינדוקציה. לאחר 2 דקות, להרדים את החיה באמצעות 3% isoflurane. מניחים את העכברים בIVIS חיממו שלב.
  3. באמצעות תוכנת תמונת חיים, להגדיר את זמן חשיפה ל" אוטומטי ", ושדה ראייה לתמונה ג עכברי 5 דקות לאחר מתן luciferin. תמונת בעלי החיים כמתואר בשלב 4.6, באמצעות השיטה "פליטת אור" הגדרת אזורים של עניין, כי ביטוי transgene משתנה בין עכברים. לנרמל את אות calvarial לזנב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neovascularization הוערך על ידי ניתוח נפח μCT ועל ידי FLI באמצעות סוכן שמקורן בדם ניאון לכמת זלוף דם. שבעה ימים לאחר הניתוח, סריקת μCT הפגינה נפח גבוה יותר באופן משמעותי של כלי דם קטנים ובינוני בקוטר בעכברים שקיבלו autografts מאשר בעכברים שקיבלו allografts נקטף מן C57BL / 6 (איור 3 א). מעניין לציין, בקבוצת autograft עץ כלי הדם החדש שנוצר הופיע להגיע לאזור הפגם כולו, ואילו בקבוצת שתל כלי דם הופיעו לחדור אתר המום מהשולים החיצוניים והרחיבו פנימה רק במידה מוגבלת. FLI נתמך תצפית זו, מראה זלוף דם הגבוה באופן משמעותי בבעלי החיים שטופל autograft (איור 3). מהיום ליום ה 14, בקבוצת שתל עץ כלי הדם הגיע כל הקרבה של השתל, עדיין כלי הנפח היה נמוך באופן משמעותי בהשוואהלקבוצת autograft ברוב קטרי כלי שבדקנו (איור 3 ג). הערה: הבדלים בכלי הנפח היו בולטים ביותר כאשר כלי בקטרים ​​0.08- 0.1 מ"מ הושוו. עשרים ושמונה ימים לאחר הניתוח בכלי דם הנפח חזר לנקודת התחלה (איור 3D).

שבעה ימים לאחר הניתוח, FLI בוצע באמצעות הבדיקה מכוונת hydroxyapatite הפגינה מינרליזציה עצם הגדולה יותר באופן משמעותי בקבוצת autograft (איור 4 א). באותו זמן, עצם שנוצר ברחבי קרבת השתל בבעלי החיים-מושתל autograft. לעומת זאת, עצם בעכברים-מושתל השתל יצר רק בשולי הפגם והתאפיין בצורת טבעת. כרכים של יצירת עצם היו לכמת 56 ימים לאחר הניתוח, בנקודת הסיום של תהליך ההתחדשות, על ידי ביצוע ניתוח μCT (איור 4). עצם נפח היה גבוה באופן משמעותי (איור 4C) ותי השתלckness גדול יותר באופן משמעותי בחיות שקבלו autografts (איור 4D). BLI היה בשימוש בעכברים מהונדסים osteocalcin-לוציפראז לעקוב אחר גיוס תאי גזע ובידול כלפי שושלת osteoblastic (איור 4E). בעכברים מושתלים עם allografts, אות BLI הגיעה לשיא 4-7 ימים לאחר ניתוח, כאשר האות נמדדת במִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת הייתה גבוהה פי 15 מזה שנמדד בזנב. בעכברים מושתלים-autograft, אות BLI הגיעה לשיא קצת מאוחר יותר, 7 - 10 ימים לאחר הניתוח, והייתה גבוה יותר באופן משמעותי, והגיעה לפי 2 מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת לזנב גבוהה יותר יחס (איור 4F).

איור 3
3. ליקויי autograft ההשרשה מקדמת אנגיוגנזה. Calvarial איור נוצרו בעכברים. מחצית מבעלי החיים שקיבלה allografts ואת החצי השני קיבל autografts.עכברים היו perfused עם חומר ניגוד polymerizing 7 ימים לאחר הניתוח. אזור calvarial היה מבודד, והדגימות היו נטולות הסידן וצלמו באמצעות סורק μCT. מפת עובי נפח נוצרה באמצעות תוכנת IPL (, n = 3, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך P <0.05). עכברים הוזרקו עם בדיקה דם שמקורן ניאון 6 ימים לאחר הניתוח. 24 שעות מאוחר יותר החיות היו נתונים לFLI וניתוח כמותי בוצע (B, n = 5, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך P <0.05). 14 ניתוח של כלי דם המבוסס על μCT בוצע (ג) ו- 28 ימים (ד ') לאחר ניתוח (C ו- D: n = 3, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך P <0.05). אנא לחצו כאן לצפייה גדולה יותר version של נתון זה.

איור 4
איור 4. השרשה של autograft מקדמת עוד Osteogenesis מ ההשרשה של שתל. עכברים קיבלה שתלים של autografts או allografts calvarial. העכברים הוזרקו מאוחר יותר עם בדיקה ממוקדת-hydroxyapatite על ידי הזרקת IV 6 ימים לאחר הניתוח. 24 שעות מאוחר יותר FLI וניתוח איכותי בוצעו (, n = 5, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך P <0.05). בvivo μCT ניתוח בוצע 56 ימים לאחר הניתוח, ונפח גלילי עניין מסומן ב התפוז הוגדר (B). עצם נפח (C) ועובי שתל (ד) היו לכמת (n = 8, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך <0.05 P) עכברי .Transgenic להביע DRI לוציפראזven ידי האמרגן osteocalcin ניתנו allografts או autografts. BLI בוצע 10 ימים לאחר הניתוח (E), כמו גם בנקודות זמן מיועדות נוספות. האות שנמדדה באזור calvarial הייתה מנורמלת כי רמת הביטוי משתנה בין עכברים (F, n = 8, ברים מייצגים ± SES, וכוכביות מצביעות ערך P <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה של גישות ההדמיה multimodal המתוארות כאן היא לאפשר חקירה מדוקדקת של ציר אנגיוגנזה-Osteogenesis בהקשר של השתלת עצם גולגולת. Neovascularization היה צילם באמצעות פרוטוקול μCT, שאיפשר הפגנת 3D ברזולוציה גבוהה מדויקת של עץ כלי הדם המזין את פגם גולגולת כולה. נתונים μCT ניתן לנתח בקלות באמצעות כלים מתקדמים כגון תוכנת IPL. לדוגמא, ניתוח העובי שמוצג באיור 3 ג גילה כי ההבדלים העיקריים בין autograft ושתל גולגולת הם בכלי החל 0.1-0.08 מ"מ בקוטר, המאפיין arterioles דם 10. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים שבוצעו במודל עצם ארוך 11. יצוין כי כלי זיהוי הצרים של 0.02mm קוטר אינם יציקה באופן מלא בשל הצמיגות של סוכן הרדיו-אטום. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא העובדה שזה כרוך בהמתת חסד של בעלי החיים, ולכן אורך הדמיה היא בלתי אפשרי. בדיקות רדיו-אטום כמה זמינות עבור in vivo כלי דם μCT הדמיה; עם זאת, הם לא כרדיו-אטום כמו חללית polymerizing הצפופה, ורזולוציית התמונה אינה עומדת שניתנת על ידי שיטת vivo לשעבר המתוארת כאן 12. הרזולוציה μCT מוגבלת ולא תהיה שימושי ללמוד נימי דם, למשל. חוץ מזה, בסיוע מיומן יד בשיטה זו מציעה טכניקה לשחזור ללמוד כלי דם עצם בפירוט.

שלב קריטי אחד בפרוטוקולים המתוארים הוא קביעת מיקום הפגם (שלב 2.7). פגיעה בתפר lambdoid יוביל לדימום מסיבי. כאשר קידוח פגם calvarial, יש להיזהר שלא לשבש את מאטר הדורה הזוטרה וסינוס sagittal מעולה. אחרונה, החדרת מחט הפרפר לתוך החדר השמאלי היא הליך עדין (שלב 3.4). אם המחט היא להכניסאד לחדר ממני, חומר הניגוד יהיה perfuse הריאות ולעבור לוורידים, שהוביל לזלוף העני של מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת. אם המחט מוחדרת עמוקה מדי, זה יהיה לנקב את הקיר האחורי לב; ואם המחט אינה מוכנסת רחוק מספיק, זה יכול בקלות לקרוע מן הלב. אל תנסו להתאים מחדש את עמדת המחט כפי שאתה עלול להפריע לזלוף. השיטה יכולה להיות שונה באמצעות סט של בדיקות ניאון זמינות; Integrin-α בדיקה -targeted 3 V β ניתן להשתמש כדי להדגיש כלי דם חדש שנוצרו, תוך בדיקה ממוקדת cathepsin-K ניתן להשתמש כדי לכמת פעילות אוסטאוקלסט.

בהתאם להשערתנו, ראה שיש לי autografts calvarial פוטנציאל osteogenic גבוה מallografts. זה נכון לעצמות ארוכות, כמו גם 13 וניתן לייחס לכמה גורמים. ראשית, autograft מכיל תאי יוצרי עצם, אשר מייצרים מטריצת עצם לאורך כל השתלפני השטח, כפי שמעיד על FLI (איור 4 א) מכוון מינרליזציה; בעוד allografts לגרום להיווצרות עצם נדירה רק בשולי הפגם. שנית, BLI של עכברי osteocalcin לוק גילה פעילות osteogenic יותר בקבוצת autograft, אשר יכול להיות מוסברת על ידי הנוכחות של גורמי גדילה שיוסרה בתהליך הכנת שתל (איור 4F). מעניין לציין, מינרליזציה העצם הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי בימים 6 ו -7, כאשר החללית-ממוקד hydroxyapatite הייתה מנוהלת, והתמיינות התאים מיוצגת על ידי פעילות BLI ניכרה מאוחר יותר, בין יום 7 ויום 10. אנחנו יכולים להסיק מזה שנרחב יותר מינרליזציה עצם יכולה להיות מוסברת לפחות באופן חלקי על ידי כלי הדם החיוביים המאפיין את השתלת עצם אוטולוגית.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שיש לו את יכולת autograft osteogenic מעולה; עם זאת, יש לקחת בחשבון שיש לי השתלת עצם גז כמה DRAwbacks. קציר עצם הוא מוגבל בנפח וכרוך תחלואה לאתר התורם 14-16. בנוסף, השכיחות של ספיגת העצם autograft אינה זניחה 17-19. Allografts זמין ביותר ולהציג את פתרון מחוץ למדף למטפל. כמה עבודות הדגימו כיצד osteo-האינטגרציה של allografts גולגולת יכולה להיות מוגברת על ידי אמצעים שונים, החל מציפוי השתל עם וירוס adeno הקשורים BMP2 קידוד 20,21 לטיפולי משלים כגון טיפול יותרת התריס לסירוגין 22. בסופו של הדבר ברגע שיכולתו של השתל להתמזג עם עצם שלמות, השתל יהפוך את חומר השתלה המועדף.

לאור תוצאות אלו, עניין מיוחד טמון בשאלה כיצד לווסת neovascularization באתר של התחדשות עצם. גישה ישירה של VEGF על הביטוי נמצאה לא יעילה, כמו כלי דם ויוצרים הם דולפים ואינם מהווים functional נטו 23,24. מעניין לציין, נמצא כי העברת אותות BMP מוביל להיווצרות ממוקדת של כלי דם 25,26. יתר על כן, סוכני תרופות 11 וטיפול בתאים 27 הוצגו לשנות דפוסי אנגיוגנזה בקרבת שתל עצם; שני גישות אסטרטגיות מבטיחות הנוכחיות כדי לשפר את ריפוי פגם עצם גולגולת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A, (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, (8), 1347-1353 (2009).
  4. Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. (2015).
  5. Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30, (27), 4639-4648 (2009).
  6. Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18, (3), 570-578 (2003).
  7. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25, (7), 1468-1486 (2010).
  8. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  9. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6, (1), 105-110 (2011).
  10. Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169, (3), 279-284 (2001).
  11. Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28, (3), 586-597 (2013).
  12. Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9, (1), e86562 (2014).
  13. Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20, (12), 2124-2137 (2005).
  14. Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26, (3), 252-255 (2013).
  15. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. (2015).
  16. Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95, (1), 5-13 (1995).
  17. Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23, (5), 1495-1498 (2012).
  18. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7, (4), 1169-1171 (2014).
  19. Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30, (2), 91-95 (2013).
  20. Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6, (10), e43-e50 (2012).
  21. Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11, (3), 291-297 (2005).
  22. Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10, (12), 4462-4471 (2013).
  23. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9, (6), 685-693 (2003).
  24. Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39, (6), 1654-1658 (2011).
  25. Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3, (4), 449-461 (2001).
  26. Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143, (4), 1545-1553 (2002).
  27. Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18, (15-16), 1552-1561 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats