Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
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Bioengineering

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Summary

La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.

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Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

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Abstract

Un parámetro importante que determina el éxito de un procedimiento de injerto óseo es la vascularización de la zona que rodea el injerto. La hipótesis de que la implantación de un autoinjerto de hueso induciría una mayor regeneración ósea mediante la formación de vasos sanguíneos abundantes. Para investigar el efecto del injerto sobre la neovascularización en el sitio del defecto, hemos desarrollado un enfoque micro-tomografía computarizada (μCT) para caracterizar los vasos sanguíneos de nueva formación, lo que implica la perfusión sistémica del animal con un agente de contraste de polimerización. Este método permite el análisis detallado vascular de un órgano en su totalidad. Además, la perfusión sanguínea se evaluó a través de imágenes de fluorescencia (FLI) de un agente fluorescente transmitida por la sangre. La formación de hueso se cuantificó por FLI utilizando una sonda de hidroxiapatita de orientación y análisis μCT. Reclutamiento de células madre se siguió por imágenes de bioluminiscencia (BLI) de ratones transgénicos que expresan la luciferasa bajo el control del promotor de la osteocalcina.Aquí describimos y demostramos preparación del aloinjerto, la cirugía defecto de la bóveda craneal, los protocolos de exploración μCT para el estudio y análisis de la neovascularización la formación de hueso (incluyendo la perfusión in vivo de agente de contraste), y el protocolo para el análisis de datos.

El análisis de alta resolución 3D de la vasculatura demostró significativamente mayor angiogénesis en animales con autoinjertos implantados, especialmente con respecto a la formación arteriola. En consecuencia, la perfusión sanguínea fue significativamente mayor en el grupo de autoinjerto por el día después de la cirugía. Se observó mineralización ósea superior y la formación de hueso mayor medido en animales que recibieron autoinjertos. Implantación autoinjerto residente inducida reclutamiento de células madre a la sutura ósea injerto-huésped, donde las células diferenciadas en células formadoras de hueso entre el 7 y el 10 º día postoperatorio. Este hallazgo significa que la formación de hueso mejorada puede ser atribuida ala alimentación vascular aumentada que caracteriza a la implantación autoinjerto. Los métodos presentados pueden servir como una herramienta óptima para estudiar la regeneración ósea en términos de formación de hueso bien delimitada y neovascularización.

Introduction

Pérdida de masa ósea debido a un traumatismo craneofacial, la resección del tumor, craneotomía descompresiva y defecto congénito rara vez se cura por sí mismo y presenta una clara necesidad clínica insatisfecha. Injertos óseos autólogos y alogénicos injertos óseos son ampliamente utilizados para tratar estas condiciones 1.

Es ampliamente aceptado que la osteogénesis está estrechamente unida con la angiogénesis 2,3. Por lo tanto, el estudio completo de una terapia propuesta para la regeneración ósea debe incluir una investigación exhaustiva del árbol vascular formando lo largo de todo el sitio del defecto. Hay varios métodos disponibles para caracterizar la vascularización en los modelos de investigación. El árbol vascular puede ser investigado por el análisis histológico. Desde la histología se basa en seccionar los tejidos, hay una alta probabilidad de que la imagen resultante será distorsionada. Para abordar este problema, la microscopía intravital se puede realizar para los vasos sanguíneos intactos imagen 4; Sin embargo, este método eslimitado a imágenes de un avión. μCT de exploración de especímenes obtenidos de un animal perfundido con agente de contraste permite obtener imágenes 3D de la red vascular que alimenta el sitio de regeneración 5. Este enfoque permite una manifestación muy detallada de la vasculatura de un órgano en su conjunto, así como un análisis minucioso de la distribución de los vasos sanguíneos. Además, permite la diferenciación entre μCT variados diámetros de los vasos sanguíneos, que caracterizan los diferentes subtipos de los vasos sanguíneos.

La hipótesis de que la implantación de un autoinjerto de calota inducirá una mayor neovascularización de la implantación de un injerto, y este aumento de la neovascularización dará lugar, a su vez, a los huesos mejorado formation.To perseguir esta hipótesis se empleó una variedad de técnicas. Se investigaron los patrones del árbol vascular recién formado mediante la realización de un análisis basado en μCT. Se midió la perfusión sanguínea usando una sonda fluorescente sangre piscina. A continuación, asnossed mineralización de tejido óseo por FLI de una sonda dirigida hidroxiapatita y análisis μCT. Finalmente, monitorizamos el reclutamiento de células madre y la diferenciación, la realización de BLI en ratones transgénicos en los que la luciferasa se expresa en células de osteocalcina-positivo.

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Protocol

El protocolo sigue las directrices del comité de cuidado de los animales y el uso institucional (IACUC) de la Universidad Hebrea de Jerusalén, Israel, una instalación de AAALAC aprobado (Solicitud MD-12-13524-4 No.), y por el Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Solicitud Nº 3770). Los animales fueron tratados en estricto apego a las directrices del NIH.

1. Preparación de aloinjertos óseos

  1. La eutanasia de 7 a 8 semanas de edad, los ratones Balb / C, o cualquier cepa diferente del receptor, utilizando el método estándar de CO 2 inhalación o inyección intraperitoneal de 50 l fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirme la ausencia de un latido del corazón y realizar dislocación cervical. Por otra parte, la cosecha de los aloinjertos de canales que se han mantenido en los -20 ° C y descongelado antes de la cosecha.
  2. Afeitarse la región calvarial utilizando una cortadora de cabello, aplicándolo contra la dirección del crecimiento del vello. Desinfectar la cabeza de la canal aplicando el 70% isopropanol. Cortar la piel del cuero cabelludo utilizando un bisturí No. 11 y retire el periostio.
  3. Usando un taladro dental y una de 4.5 mm de diámetro interior trépano, separar un fragmento circular de hueso de calota. Transferir el fragmento de hueso a un plato de plástico de 100 mm que contiene solución salina estéril. En este punto, observar la sangre y el tejido blando unido al fragmento de hueso (Figura 1A). Obtener fragmentos de hueso de esta manera a partir de 22 donantes.
  4. Mantenga fragmento de un hueso en un momento con unas pinzas curvas. Hisopo usando fondo de algodón con punta de aplicador y eliminar cualquier tejido cerebral, el tejido blando, y la sangre (Figura 1B). Cortar con cuidado cualquier astillas de hueso que permanecen unidos al injerto con unas tijeras finas para que el injerto tendrá una forma redondeada perfecto.
  5. Sumergir cada injerto, una vez en un tubo de 15 ml que contiene 70% de etanol y dos veces en tubos de 15 ml que contienen solución salina tamponada con fosfato para lavar el etanol.
  6. Congelar los aloinjertos en un refrigerador -80 ° C en criotubos por lomenos 1 semana. En este punto, asegúrese de que los aloinjertos aparecen transparente (Figura 1C).

Cirugía 2. calota Defecto

  1. Para los destinatarios usar ratones transgénicos que expresan la luciferasa bajo el control del promotor de osteocalcina 6.
  2. Esterilizar las puntas de las herramientas quirúrgicas utilizando un calentador de perlas de vidrio durante 30 segundos. Transferencia de las herramientas para un frasco que contiene 70% de isopropanol para mantener las condiciones estériles. Use guantes estériles.
  3. Anestesiar un ratón hembra de 7 a 8 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal de una mezcla ketamine- medetomidina (75 mg / kg y 1 mg / kg, respectivamente). Apriete la extremidad de los animales para asegurarse de que está profundamente anestesiado. No deje a un animal sin vigilancia hasta que recobró el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
  4. Afeitarse la región calvarial utilizando una cortadora de cabello, aplicándolo contra la dirección del crecimiento del vello. Aplicar la crema depilatoria para eliminar los restos de piel y límpielo faetr no más de 2 minutos utilizando una gasa seca seguido de solución salina gasa embebida. Se debe tener cuidado para evitar el contacto con los ojos. Alternativamente, el ungüento oftálmico veterinario puede ser aplicado antes de la depilación como una capa adicional de protección para los ojos. Es imperativo que todos los restos de la crema depilatoria ser removidos a fin de evitar la posible irritación de la exposición excesiva al agente químico. Desinfectar el cuero cabelludo mediante la aplicación de un 5% de clorhexidina (Figura 1D).
  5. Inyectar por vía subcutánea 5 mg / kg carprofeno diluido en 200 l de solución salina. Aplique ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad y mantener al animal en una almohadilla térmica en todo momento. Colocar el animal en las que operan los prismáticos.
  6. Haga un corte oval de 1 cm de largo en la piel del cuero cabelludo utilizando finas tijeras y pinzas (Figura 1E). Sostenga el periostio con unas pinzas curvas y cortar con unas tijeras finas.
  7. Perforar el calvario mm anterior defecto 2 a la sutura lambdoidea mediante el uso de un taladro dental unaencontrar un trépano exterior de diámetro de 5 mm (Figura 1F y G). Para evitar la penetración de la duramadre, perforar tres cuartas partes de la forma en el hueso y separar el fragmento de hueso con una espátula.
  8. Para implantar un autoinjerto, recuperar el fragmento de hueso y lavarlo en una placa de plástico de 10 mm que contiene 10 ml de solución salina estéril para eliminar los residuos. No quite los tejidos blandos. Para implantar un aloinjerto, deshielo de antemano un aloinjerto y normalizar a RT, y luego lavarlo.
  9. Coloque el injerto óseo en el defecto con unas pinzas curvas para que no toque las márgenes del defecto (Figura 1H). Pegar el injerto al hueso huésped usando gel de fibrina (5 l de 46 mg / ml de fibrinógeno mezcló con 5 l de 25 U / ml de trombina).
  10. Suturar la piel con sutura vicryl 4-0 (Figura 1I). Aplicar povidona yodada a la incisión quirúrgica. Se debe tener cuidado para evitar la contaminación de la sutura por la piel. Marque la oreja de ratón e inyectar 0,25 mg / kg Antisedan to revertir el efecto anestésico de la medetomidina.
  11. Si el animal se despierta en 10 minutos, asegúrese de que está situado en una almohadilla caliente. Inyectar 200 l solución salina estéril, y si es necesario inyectar 0,1 mg / kg Antisedan. No devuelva un animal que se ha sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere totalmente.
  12. Mantener a los animales en jaulas separadas por una semana para evitar que la apertura de las suturas. Coloque ratón chow empapado en agua en una placa de Petri en el suelo de la jaula por unos pocos días después de la operación. Inyectar por vía subcutánea 200 l de / ml solución Carprofeno 1 mg diluida en solución salina estéril una vez al día durante 3 días después de la cirugía para tratar el dolor post-quirúrgico.

Figura 1
Figura 1. Preparación de calota aloinjerto y de calota Defecto Surgery. El fragmento de hueso está aislada de la región de la bóveda craneal (A). Tejido suave, Médula ósea, y la sangre se tomaron muestras (B), y el injerto se enjuaga en etanol al 70% seguido de dos lavados en solución salina tamponada con fosfato (C, AG = aloinjerto). El ratón receptor se prepara para la cirugía por el afeitado y la desinfección de la piel en la región de la bóveda craneal (D). Un corte ovalado se crea en la piel del cuero cabelludo, y se retira el periostio (E). A continuación, el defecto de calota se perfora utilizando un trépano de 5 mm de diámetro (F). El fragmento de hueso se separa usando una espátula en forma de cuchara, dejando el seno sagital superior intacta (G). El aloinjerto se coloca entonces en el defecto y se fija usando gel de fibrina (H). Por último, la piel se sutura (I). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Micro-tomografía computarizada de Caracterización deel árbol vascular

  1. Preparar una solución salina heparinizada. Peso 2.000 U de heparina sódica y colocarlo en tubo de plástico de 50 ml. Añadir 20 ml de solución salina y agitar bien el tubo. Llene una jeringa de 20 ml cierre Luer con 15 ml de solución salina heparinizada calentó y conectar la jeringa a un conjunto vena del cuero cabelludo 23-G. Colocar la jeringa a una bomba de jeringa, y configurarlo para bombear 10 ml a 1 ml / min.
  2. Sedate un ratón utilizando una inyección intraperitoneal de fenobarbital 50 l (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Apriete las extremidades del animal para asegurarse de que está profundamente sedado. Asegure el ratón sobre la espalda a una placa de fijación envuelto con un revestimiento de superficie absorbente (Figura 2A). Coloca el ratón fijo en una campana de extracción para evitar la exposición del personal a humo.
  3. Cortar la piel del abdomen hasta el cuello con finas tijeras y pinzas (Figura 2B). Cortar la pared abdominal hasta el proceso xifoides (Figura 2C). Cortar la caja torácica a lo largo de su cara lateral. Evite lesionar los pulmones und corazón, y asegúrese de que el corazón está completamente expuesto. Use una pinza hemostática para retraer el esternón (Figura 2D).
  4. Inserte la aguja de mariposa 3 mm en el ventrículo izquierdo (Figura 2E). Pegue la aguja a la pared del corazón y el pecho con pegamento de 3 segundos (Figura 2F).
  5. Activar la bomba de inmediato. Después de un minuto, diseccionar la vena cava inferior con el fin de despresurizar el sistema vascular (Figura 2G). Incline el tablero de modo que los líquidos fluyan lejos de la cabeza. Perfusión exitosa resultará en la limpieza de los vasos del hígado y la sangre.
  6. Cuando se completa la perfusión de solución salina heparinizada, perfundir 10 ml de formaldehído al 4%. Evitar la penetración de burbujas de aire en el sistema vascular y evitar la exposición a los vapores de formaldehído. El éxito de la perfusión formaldehído dará lugar a la rigidez de la cola. Lave el formaldehído con 10 ml de solución salina heparinizada.
  7. Preparar el agente de contraste radio-opaco de acuerdo con manufactinstrucciones urer. Típicamente, se requerirá de mezcla del compuesto, diluyente, y un agente de curado. Utilice pipetas serológicas y mezclar la solución en un tubo de plástico de 15 ml.
  8. Perfundir el animal con la mezcla de agente de contraste a una velocidad de 1 ml / min. Observar los vasos sanguíneos coronarios, intestinales y hepáticas y asegurarse de que están dando vuelta amarilla después de la perfusión de 2 - 3 ml, lo que indica la perfusión exitosa (Figura 2H). Al término de la perfusión, cortar los tubos de la aguja de mariposa, obtener la carcasa solos y se envuelve con papel higiénico para evitar fugas de la solución a la región de bóveda craneal. Permitir la polimerización en 4 ° CO / N.
  9. Diseccionar la región calota (Figura 2I); En primer lugar utilizar un bisturí para cortar la piel como lateral como sea posible, evitando dañar la región craneal de interés. Busque el injerto óseo y luego usar tijeras finas para cortar el hueso craneal 10 mm del injerto.
  10. Busque en la calv aisladomuestra de médula arial utilizando un escáner μCT; establecer un campo de visión de 20.5 mm, la energía de rayos X de 55 kVp, Intensidad de 145 mu, con 1.000 proyecciones por 360 ° y la integración momento de 200 ms. Ajustar parámetros μCT 7 a imagen de otros modelos de defecto óseo.
  11. Tenga en cuenta las rebanadas 2D reconstruida que se generaron por el software μCT. Asegúrese de explorar la región de interés es correcta y luego localizar el defecto de la bóveda craneal. Evaluar la calidad de la perfusión. Después de la identificación exitosa de los vasos sanguíneos (Figura 2J), continuará y descalcificar la muestra utilizando 6% de ácido tricloroacético (TCA) diluido en agua doblemente destilada (DDW).
  12. Volver a analizar la muestra utilizando los parámetros indicados en la Sección 3.10. Busque esta sutura en los cortes 2D reconstruidos. Definir un volumen cilíndrico de interés (VOI) en altura de 2 mm y 8 mm de diámetro, que es tangente a la sutura - este es el sitio anatómico de defecto.
  13. º Segmentotejidos e hueso de tejidos blandos utilizando un procedimiento de umbral mundial; establecer el umbral inferior a 130, y aplicar un filtro gaussiano 3D limitado (sigma [σ] = 2,0 y apoyo = 2) para suprimir parcialmente el ruido en los volúmenes. Generar una reconstrucción en 3D y asegurarse de que el VOI se coloca correctamente (Figura 2C).
  14. Generar un mapa de espesor utilizando el software de IPL y la función "dt_object_param" (Figura 2 l).
    NOTA: Esta función describe el volumen del depósito para cada diámetro de los vasos.

Figura 2
Figura 2. Perfusión usando un agente radio-opaco a través del enfoque cardíaco. El ratón se fija a la placa de fijación (A), y la piel se corta a lo largo del abdomen hasta el cuello (B). La pared abdominal se corta a lo largo de la línea media hasta el proce xifoidesss (C), y la caja torácica se corta lateralmente (D). Una aguja de mariposa se ​​inserta en el ventrículo izquierdo, evitando la inserción en el ventrículo derecho, que es marcadamente más oscuro (E, el ventrículo derecho se indica por la línea discontinua blanco), y la aguja se fija a la pared del corazón y el pecho (F) . Solución salina heparinizada (2-3 ml) se bombea en el corazón, y la vena cava inferior se diseca (G, flecha blanca indica la vena cava inferior). El formaldehído (4%) se perfunde y lavado; esto es seguido por una perfusión del agente de contraste radio-opaco de color amarillo teñido. Perfusión éxito será evidente por el aclaramiento de los vasos sanguíneos, que cambian de color a amarillo (H). Después de la polimerización, la región de calota está aislado (I, AG = aloinjerto) y fotografiado usando un escáner μCT confirmar la perfusión adecuada (J, volumen de interés se marca con naranja). losmuestra es descalcificada y reescaneado (K), seguido por la generación de un mapa de espesor de color (L). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. La fluorescencia de imágenes de hueso mineralización y la Sangre de perfusión

  1. Reconstituir las sondas a una concentración de 2 nmol / 100 l de PBS en un tubo de 1,5 ml (utilizar una sonda fluorescente-bisfosfonato conjugado para supervisar la mineralización ósea y un agente fluorescente transmitida por la sangre para medir la perfusión de la sangre). Pipetear suavemente varias veces para asegurar la disolución homogénea de la sonda.
  2. 24 horas antes de la sesión de imágenes designada tomar una imagen de tiempo de cero; anestesiar 3 ratones utilizando 2 L / min inhalación de oxígeno de grado médico 100% suplementado con 3% de isoflurano en una cámara de inducción. Después de la anestesia apropiada ha sido establecida, disminuir la concentración de isoflurano al 1,5% - 2%.
  3. Aplique ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad y hacer almohadilla térmica seguro está encendido en todo momento. Apriete la extremidad de los animales para asegurarse de que está profundamente anestesiado. No deje a un animal sin vigilancia hasta que recobró el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
  4. Afeitarse la región calvarial utilizando una cortadora de cabello aplicándolo contra la dirección del crecimiento del vello. Retire los restos de piel que utilizan la crema depilatoria. Cualquier remanente de piel interferirá con imágenes ópticas. Retire las suturas finas utilizando tijeras y pinzas.
  5. Coloque tres animales en el escenario IVIS calentó a 37 ° C para cada sesión de imágenes. Establezca el tiempo de exposición al auto, ver el campo a C, y ajustar los filtros. Por ejemplo, por una sonda fluorescente-bifosfonato conjugado caracterizado con excitación máxima a la longitud de onda de luz de 680 nm, utilice un filtro de excitación de 675 nm y un filtro de emisión de Cy5.5 . Del mismo modo, cuando se utiliza un agente fluorescente transmitida por la sangre con el pico de excitación a la longitud de onda de luz de 750 nmutilizar un filtro de excitación de 710 nm y un filtro de emisión de 780 nm.
  6. Imagen de los ratones a través de Vivir software de imagen pulsando el botón "Adquirir". Asegúrese de que la región de la bóveda craneal es completamente visible (Figura 3B) Para un asesoramiento integral guía Lim et al 2009 8.
  7. Permitir a los ratones para despiertan la inhalación de oxígeno al 100%.
  8. Se inyecta la sonda fluorescente de 2 nmol través de una inyección intravenosa de cola. En la sesión de formación de imágenes designado, realizar las imágenes como se describe anteriormente.

5. Micro-tomografía computarizada para la regeneración ósea

  1. Para la cuantificación de la formación de hueso, anestesiar el ratón por la inhalación de 3% de isoflurano, tal como se representa en el paso 4.2 - 4,3. Transferir el ratón hacia la superficie del escáner μCT, y lo coloca en el escáner.
  2. Establecer tubo de rayos X de energía potencial del escáner μCT a 55 kVp y la intensidad de 145 mu resolución media. El uso de un campo de visión de 20,5 mm, realiceun explorador (simple radiografía) explorar y definir una región de interés se extiende desde los ojos del ratón a la parte posterior de su cráneo. Realice una tomografía computarizada, con 1.000 proyecciones por 360 ° y la integración momento de 200 ms.
  3. Reconstruir las rodajas 2D utilizando una resolución espacial nominal de 20 micras. Alinear los márgenes del defecto a una posición estandarizada utilizando el software μCT 9.
  4. Similar al paso 3.20, definir un volumen cilíndrico de interés y aplicar el filtro de Gauss 3D limitado (σ = 0.8 y soporte = 1) para suprimir parcialmente el ruido en los volúmenes. Segmento del tejido óseo de los tejidos blandos utilizando un procedimiento de umbral global.
  5. Determinar el volumen de tejido óseo mineralizado en el volumen de interés.

6. La bioluminiscencia de imágenes de Contratación de Células Madre y Diferenciación

  1. Preparar el ratón para la imagen como se muestra en las secciones 4.2-4.4 y despertar los ratones por inhalación de oxígeno al 100%.
  2. Administrar 126 mg / kg luciferina de escarabajo a cada ratón mediante inyección intraperitoneal, y devolver el animal a la cámara de inducción. Después de 2 minutos, anestesiar al animal usando 3% isoflurano. Coloque los ratones en el IVIS calentaron el escenario.
  3. Via Vivir software de imagen, ajustar el tiempo de exposición a la "auto", y el campo de visión a C. Imagen los ratones 5 min después de la administración luciferina. Imagen de los animales como se representa en el paso 4.6, utilizando la modalidad "bioluminiscencia" Definir regiones de interés debido a la expresión del transgen varía entre los ratones. Normalizar la señal del calvario a la cola.

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Representative Results

La neovascularización se evaluó mediante análisis volumétrico μCT y FLI utilizando un agente de transmisión sanguínea fluorescente para cuantificar la perfusión sanguínea. Siete días después de la cirugía, la exploración μCT demostró una significativamente mayor volumen de los vasos sanguíneos pequeños y medianos de diámetro en los ratones que habían recibido autoinjertos que en los ratones que habían recibido aloinjertos cosechadas de C57BL / 6 (Figura 3A). Curiosamente, en el grupo de autoinjerto el árbol vascular recién formado apareció para llegar a toda el área del defecto, mientras que en el grupo de aloinjerto aparecieron los vasos sanguíneos para penetrar en el sitio del defecto a partir de los bordes exteriores y se extienden hacia adentro para solamente un grado limitado. El FLI apoyó esta observación, que muestra significativamente mayor perfusión de la sangre en los animales tratados con autoinjerto (Figura 3B). Por el día 14, en el grupo de aloinjerto árbol vascular alcanzó todos proximidad del injerto, con todo el volumen del depósito fue significativamente menor compararal grupo de autoinjerto en la mayoría de diámetros de los vasos que se examinaron (Figura 3C). Nota: Las diferencias en el volumen del depósito eran más prominente cuando se compararon los vasos con diámetros 0,08 a 0,1 mm. Veintiocho días después de la cirugía el volumen vasculatura regresó a la línea de base (Figura 3D).

Siete días después de la cirugía, FLI realizó usando la sonda de hidroxiapatita dirigida demostró significativamente mayor mineralización ósea en el grupo de autoinjerto (Figura 4A). Por ese tiempo, el hueso se había formado a lo largo de la proximidad del injerto en los animales autoinjerto-implantado. En contraste, el hueso en los ratones aloinjerto implantado había formado sólo en los márgenes del defecto y fue marcada por una forma de anillo. Los volúmenes de la formación de hueso se cuantificaron 56 días después de la cirugía, en el punto final del proceso de regeneración, mediante la realización de análisis μCT (Figura 4B). Volumen óseo fue significativamente mayor (Figura 4C) y thi injertockness significativamente mayor en los animales que recibieron autoinjertos (Figura 4D). BLI se utilizó en ratones transgénicos-osteocalcina luciferasa para controlar el reclutamiento de células madre y la diferenciación hacia el linaje osteoblástico (Figura 4E). En ratones implantados con aloinjertos, la señal de BLI alcanzó su punto máximo 4 - 7 días después de la cirugía, cuando la señal medida en la bóveda craneal era 15 veces mayor que la medida en la cola. En ratones autoinjerto implantado, la señal de BLI alcanzó un poco más tarde, 7 - 10 días después de la cirugía, y fue significativamente mayor, alcanzando un 2 veces calvaria-a cola relación (Figura 4F) mayores.

figura 3
Figura 3. defectos autoinjerto Implantación Facilita angiogénesis. Calota fueron creados en ratones. La mitad de los animales recibieron aloinjertos y la otra mitad recibió autoinjertos. loslos ratones fueron perfundidos con un agente de contraste de polimerización de 7 días después de la cirugía. La región de bóveda craneal fue aislado, y las muestras fueron descalcificadas y fotografiado usando un escáner μCT. Un mapa espesor volumétrica se ha generado utilizando el software de IPL (A, n = 3, barras representan ± SE, y asteriscos indican p valor <0,05). Los ratones fueron inyectados con una sonda de transmisión sanguínea fluorescente 6 días después de la cirugía. 24 horas después, los animales fueron sometidos a FLI y se realizó un análisis cuantitativo (B, n = 5, barras representan ± SE, y asteriscos indican p valor <0,05). Se realizó un análisis vascular basada en μCT 14 (C) y 28 días (D) después de la cirugía (C y D: n = 3, barras representan ± SE, y asteriscos indican p valor <0,05). Haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Implantación de un autoinjerto Promueve Más osteogénesis Que Implantación de un aloinjerto. Los ratones recibieron implantes de autoinjertos o aloinjertos de calota. Los ratones fueron inyectados posteriormente con una sonda de hidroxiapatita orientada por inyección IV 6 días después de la cirugía. 24 horas más tarde FLI y un análisis cualitativo se realizaron (A, n = 5, barras representan ± SE, y asteriscos indican p valor <0,05). En vivo μCT análisis se realizó 56 días después de la cirugía, y un volumen cilíndrico de interés marcados con naranja se definió (B). Volumen de hueso (C) y el espesor del injerto (D) se cuantificaron (n = 8, barras representan ± SE, y los asteriscos indican valor <0,05 P) .Transgenic ratones que expresan luciferasa drincluso por el promotor de osteocalcina recibieron aloinjertos o autoinjertos. BLI se realizó 10 días después de la cirugía (E), así como en los puntos de tiempo designados adicionales. La señal medida en la región del calvario se normalizó ya que el nivel de expresión varía entre los ratones (F, n = 8, barras representan ± SE, y asteriscos indican p valor <0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo de los enfoques de formación de imágenes multimodales se describe aquí es para permitir meticulosa investigación del eje angiogénesis-osteogénesis en el contexto de injerto de hueso craneal. La neovascularización fue fotografiada utilizando un protocolo μCT, lo que permitió una alta resolución de demostración 3D precisa del árbol vascular alimentar todo el defecto craneal. datos μCT se pueden analizar fácilmente utilizando herramientas avanzadas como el software de IPL. Por ejemplo, el análisis de espesor se muestra en la Figura 3C reveló que las principales diferencias entre autoinjerto y aloinjerto son craneal en los vasos que van desde 0.1 a 0,08 mm de diámetro, que caracteriza a las arteriolas de sangre 10. Este resultado es consistente con los estudios realizados en el modelo de hueso largo 11. Cabe señalar que los vasos detectables más estrechas de 0,02 mm de diámetro no están completamente fundidas debido a la viscosidad del agente radio-opaco. La principal desventaja de este método es el hecho de que implicaeutanasia del animal, y la imagen de este modo longitudinal es imposible. Varias sondas radio-opacos están disponibles para in vivo vascular μCT de imagen; sin embargo, no son tan radio-opaco como la sonda de polimerización denso, y la resolución de la imagen no cumple con la proporcionada por el método ex vivo 12 representado aquí. μCT resolución es limitada y no será útil para estudiar los capilares sanguíneos, por ejemplo. Aparte de eso, con la ayuda de una mano hábil este método ofrece una técnica reproducible para estudiar la vasculatura hueso en detalle.

Un paso crítico en los protocolos descritos es la determinación de la ubicación de defectos (paso 2.7). Lesión a la sutura lambdoidea dará lugar a una hemorragia masiva. Al perforar el defecto del calvario, se debe tener cuidado de no perturbar la duramadre subalterno y el seno sagital superior. Por último, la inserción de la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo es un procedimiento delicado (paso 3.4). Si la aguja está insertoed en el ventrículo derecho, el agente de contraste se perfusión de los pulmones y pasar a las venas, lo que lleva a una mala perfusión de la bóveda craneal. Si se inserta la aguja demasiado profunda, será perforar la pared del corazón posterior; y si la aguja no se inserta lo suficiente, puede romper fácilmente desde el corazón. No intente volver a ajustar la posición de la aguja, ya que puede interferir con la perfusión. El método se puede modificar usando un conjunto de sondas fluorescentes disponibles; Integrin-α β 3 v -targeted sonda puede ser utilizado para enfatizar vasos sanguíneos recién formados, mientras que la sonda orientada por la catepsina-K se puede usar para cuantificar la actividad de los osteoclastos.

De acuerdo con nuestra hipótesis, se observó que los autoinjertos de calota tienen un mayor potencial osteogénico de aloinjertos. Esto es cierto para los huesos largos, así 13 y puede ser atribuido a varios factores. En primer lugar, el autoinjerto contiene células formadoras de hueso, que producen la matriz ósea en todo el injertosuperficie, como se evidencia en la mineralización dirigida FLI (Figura 4A); mientras que los aloinjertos de inducir la formación de hueso escasa sólo en los márgenes del defecto. En segundo lugar, de los ratones BLI-osteocalcina luc reveló más actividad osteogénica en el grupo de autoinjerto, que puede explicarse por la presencia de factores de crecimiento que se elimina en el proceso de preparación del aloinjerto (Figura 4F). Curiosamente, la mineralización ósea fue significativamente mayor en los días 6 y 7, cuando se administró la sonda hidroxiapatita-dirigida, y la diferenciación celular representado por la actividad BLI fue evidente después, entre el día 7 y el día 10. Podemos inferir de esto que cuanto más extensa mineralización ósea puede explicarse al menos parcialmente por la vasculatura favorable que caracteriza el injerto óseo autólogo.

Nuestros resultados indican que el autoinjerto tiene la capacidad osteogénica superiores; Sin embargo, hay que tener en cuenta que el injerto óseo autógeno tiene varios drawbacks. Recolección de hueso es limitada en volumen y conlleva la morbilidad de la zona donante 14-16. Además, la incidencia de la resorción de hueso de autoinjerto no es despreciable 17-19 de. Los aloinjertos son altamente disponible y presentan una solución off-the-shelf para el clínico. Varios trabajos han demostrado cómo la osteo-integración de aloinjertos craneales puede ser mejorada por diferentes medios, que van desde el recubrimiento de la aloinjerto con BMP2-encoding virus adeno-asociado 20,21 a terapias adyuvantes, tales como terapia intermitente 22 paratiroidea. Al final, una vez que se perfecciona la capacidad del aloinjerto para fusionarse con el hueso, el aloinjerto se convertirá en el material de injerto preferido.

A la luz de estos resultados, un interés particular radica en la pregunta cómo modular la neovascularización en el sitio de la regeneración ósea. Enfoque directo de VEGF sobre-expresión se encontró ineficaz, ya que los vasos sanguíneos que forman son goteras y no forman una functional neta 23,24. Curiosamente, se encontró que la transducción de señales BMP conduce a la formación selectiva de los vasos sanguíneos 25,26. Por otra parte, agentes farmacéuticos 11 y la terapia de células 27, se mostró a alterar los patrones de la angiogénesis en el injerto de la proximidad del hueso; ambos enfoques actuales estrategias prometedoras para mejorar craneal sanación defecto óseo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

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References

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