אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה חדשה disaggregate ברקמות אדם ליצור-שתל מייקרו עצמי, וזה ביחד עם ספוגי קולגן, להצמיח-מתחמים ביו אדם מוכנים לשימוש בטיפול נגעים בעור. יתר על כן, מערכת זו שומרת כדאיות התא של שתלי מיקרו בזמנים שונים לאחר חלוקה מכני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כמה שיטות חדשות פותחו בתחום הביוטכנולוגיה להשיג השעיות הסלולר עצמיות במהלך ניתוח, על מנת לספק טיפולי צעד אחד עבור נגעי עור כרוניים וחמורים. יתר על כן, ההנהלה כרוני אלא גם פצעים חריפים כתוצאה מטראומה, סוכרת, זיהומים וכן גורמים נוספים, נותרת מאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה חדשה ליצירה-שתל מייקרו עצמי מרקמות עורית של חולה יחיד היישום הקליני שלהם. יתר על כן, במבחנה ביולוגית ואפיון של רקמות עורית נגזרו עור, הדרמיס-epidermized דה (Ded) ו הדרמיס של באיברים רבים ו / או תורמים רבות רקמות גם בוצע. כל הרקמות היו מפוצל על פי הפרוטוקול החדש, המאפשר לנו להשיג-שתלי מיקרו קיימא. בפרט, דיווחנו כי פרוטוקול חדשני זו הוא מסוגל ליצור ביו-מתחמים שהלחינו שתלי-מייקרו עצמי וקולגן ספוגים מוכן להיות מיושם על פצעים בעור. cliniיישום קאל של מתחמי ביו עצמיים על נגע ברגלו נמסר גם, מראה שיפור של שני תהליך מחדש epitalization ורכות של הנגע. בנוסף, המודל במבחנה שלנו הראה כי כדאיויות תא לאחר חלוקה מכאנית עם מערכת זו נשמרות לאורך זמן עד שבעה (7) ימים של התרבות. אנחנו גם ציינו, על ידי ניתוח תזרים cytometry, כי ברכת תאים המתקבלים חלוק מורכבת של תאים מסוגים שונים, כוללים בתאי גזע mesenchymal, כי להפעיל תפקיד מרכזי בתהליכי התחדשות ותיקון רקמות, עבור פוטנציאל ההתחדשות הגבוה שלהם. לבסוף, הראינו במבחנה כי נוהל זה שומר על סטריליות של שתלי מיקרו כאשר בתרבית במנות אגר. לסיכום, אנו מגיעים למסקנה כי גישת משובים חדשה זו יכולה להיות כלי מבטיח עבור קלינאים להשיג בצעד אחד קיימא, סטרילי ומוכנה לשימוש-שתל מייקרו שניתן ליישם לבד או בשילוב עם מרבית scaffo הביולוגי המשותףLDS.

Introduction

בשנים האחרונות, מספר שיטות חדשות פותחו בתחום הביוטכנולוגיה להשיג השעיות הסלולר עצמיות במהלך ניתוח על מנת לספק טיפולי צעד אחד עבור נגעי עור כרוניים וחמורים. יתר על כן, את הניהול של פצעים חריפים אבל בעיקר כרוניים כתוצאה מטראומה, סוכרת, זיהומים, וכן גורמים נוספים, נותר מאתגר. יש ראיות גוברות כי בפצעים כרוניים הפכו בעיה בריאותית עולמית רצינית, ועלולים ליצור ניטל כספי עצום על מערכות בריאות ברחבי עולם 1.

כדי להגדיל את שיעור ההצלחה בטיפול נגעים בעור, בהיעדר המניפולציה נרחבת (כולל שיפור הסלולר) והשמירה על תנאים סטריליים חיוניים, כדי ליצור השעיה הסלולר שניתן ליישם באופן מיידי על האזור הפגוע של חולים, ובכך להימנע עיבוד יותר מן החדרים הנקיים כגון מפעלי סלולרי. רחובarting ביופסיות עור קטנים, טחינה, צנטריפוגה ושיטות הפרדה אחרות (למשל, אנזימטי או מכאני), משמשים לעתים קרובות כדי לקבל השעיה הסלולר, אשר יכול להיות מתורבתת במדיום גידול. כל השיטות האלה דורשים בדרך כלל זמן רב של ביצוע, והדגיש מבני התא, מה שמוביל לירידה של כדאיויות תא. היבט נוסף משמעותי הוא להשיג השעיה הסלולר עצמית מוכנה להיות בשימוש על ידי רופאים, למשל, כדי לתקן אזורים פגועים. יתר על כן, היא מבוססת היטב כי שתל רקמה עצמית לשרוד את נהלי ההעברה בסופו של דבר לשרוד האתר המקבל על פי העקרונות של אינדוקציה וחוטים 2, 3. רקמת השתל האידיאלית צריכה להיות זמינה ויש antigenicity נמוך באתר תורם לתחלואה 4.

על בסיס עדויות אלה, המטרה הראשונה של המחקר הנוכחי הייתה ליצור מתחמי ביו עצמיים מתאימיםיישום קליני בתיקון רקמות. לשם כך, אנו מתארים שיטה חדשה לקבלה-שתל מייקרו עצמי החל רקמות עורית שהיו מפוצלות על פי פרוטוקול זה. הצגה מקרה גם מתוארת במסמך זה כיישום קליני של שתלי מייקרו העצמיים מתקבלים על ידי פרוטוקול זה בשילוב עם ספוגי קולגן. גישה זו כבר דווחה להיות יעיל החלוקה המכאנית של רקמות אנושיות 5 וזה כבר בשימוש קליני עבור שתלים והתחדשות של רקמות עורי 6,7 וכן עבור טיפולים רגנרטיבית של רקמות חיבור בכירורגיה אוראלית ולסת 8-10 .

בנוסף, המטרה השנייה של המחקר היה ביולוגי והאפיון של הרקמות עורית לאחר החלוקה שלהם על ידי פרוטוקול זה. לשם כך, דגימות הומולוגיות שונות של רקמות עורית נגזרו באזור תא המטען של באיברים רבים שוניםו / או תורמים רבות רקמות עובד הבאים חוקים לאומיים קציר, עיבוד והפצה של רקמות להשתלה (CNT 2013) ב Skin אמיליה רומניה האזורית בנק.

הצגת מקרה:

מטופלת 35 בן מראה טראומה מורכבת בשל תאונת דרכים אושפז ביחידה לטיפול נמרץ של בית החולים אנקונה. החולה הראה זיהום על הרגל בשל פצע פתוח שבר מסובך התייצב עם קיבוע חיצוני. שנייה הטריה רדיקלית בוצעה וכאשר הפצע הפך נקי לאחר טיפול בלחץ שלילי (טיפול VAC) ואת קרום העצם ונראה בריא, אנחנו מוחלים הפרוטוקול לאחר חודשי התאוששות. לאחר חלוקה עם מערכת זו, מיקרו-שתלי השיג שימשו כדי ליצור ביו-קומפלקסים עם ספוג קולגן אשר הושתלו מכן על מנת לחקור את יעילותם על תיקון הנגע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: מאז היישום הקליני של הפרוטוקול מחייב שימוש רקמות עצמיות עורית של המטופל, האפיון שלה במבחנה בוצעה לפני שימוש קליני על רקמות עורית הומולוגיות בבנק עור האזורי אמיליה רומניה ביצוע ההנחיות של חוקי המדינה על קצירה, עיבוד והפצת רקמות להשתלה (CNT 2013).

1. בניין ביו-קומפלקס עבור יישומים קליניים

הערה: פרוטוקול זה מבוסס קליני על השימוש Rigeneracons (משבש רקמות) ואת מכונת Rigenera (מערכת משבש רקמות) (איור 1 א). משבש הרקמות הוא משבש רפואי ביולוגי של רקמות אדם מסוגלות לשבש חתיכות קטנות של רקמות באמצעות רשת שמספקת להבי משושה ותאי סינון מרכיבי תאי מטריקס עם ניתוק של כ -50 מיקרון.

  1. אסוף skinsamples של המטופל באמצעות דואגרוף opsy (איור 1B) ו disaggregate הוספת 1 ​​מ"ל של תמיסת מלח בעד כל יחידה להשיג 6,7,9 מיקרו שתלי עצמיים (או ראה שלב 2.1).
  2. מקום 1 מ"ל של שתלי מיקרו על ספוגים קולגן (איור 1 ג) מתחמי ביו toform להשתמש עבור יישומים קליניים.
  3. תרבות 1 מ"ל נוסף של שתלי מיקרו על ספוגים קולגן בנוכחות 6 מ"ל של מדיום DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified 5% CO 2.
  4. בעקבות 3 ימים של תרבות, לתקן את מתחמי ביו עם Paraformaldehyde 0.3% במשך 10 דקות ב RT. יוצק את פרפין עם מתקן ספציפי ישירות על המדגם. השג פרוסות עם microtome עם עובי של 5 מיקרומטר ולשים ישירות א-שקף זכוכית.
  5. לטבול פרוסות פרפין 5 מיקרומטר בכוס עבור ניתוחים היסטולוגית, המכיל 15 - 20 מ"ל קסילן (זמינים מסחרית - שילוב של-קסילן מ (40 - 65%), p-קסילן (20%), o-קסילן (20% ) ו ת 'בנזן י.ל. (6 - 20%) ואת עקבות של טולואן, בנזן trimethyl, פנול, thiophene, פירידין ומימן גופרי) עבור 3 דקות כל אחד.
  6. לטבול את פרוסות בכיתות ירידה (100% עד 70%) של אתנול (אתנול 100% עבור 1 שעות, אתנול 95% במשך שעה 1, 80% אתנול עבור 1 שעות, 70% אתנול עבור שעה 1) ולאחר מכן מים deionized עבור דה-paraffinizing ו rehydrating הסעיפים.
  7. הכתם בסעיפים עם 1 - 2 מ"ל של 1g / L Ematoxylin 1 - 2 דקות ולאחר מכן לשטוף במים כדי להסיר כל עודף Ematoxylin.
  8. כתם בסעיפים 4 - 5 דקות עם פתרון אלכוהוליים Eosin Y ב 1% של הריכוז מהול% אתנול 70 ו מדולל במים.
  9. השתמש 1 - 2 מ"ל של Eosin Y עבור כל מקטע השקופית ולשטוף תחת מי ברז זורמים.
  10. לטבול סעיפים בהגדלת ציונים של אתנול (ראה שלב 1.6) ולבסוף, אחרי מעבר קסילן עבור 1h, coverslip עם הרכבה מבוססת mediumand להתבונן במיקרוסקופ אור בהגדלת 100x (1D איור).
  11. </ Ol>

    2. אוסף, חלוקה ו בניתוח חוץ גופית של רקמות

    1. באמצעות dermatome, לקחת רקמת העור עצמאית, הדרמיס papillary-epidermized דה (Ded) או הדרמיס רשתי (הדרמיס) בהתאמה של 0.6 מ"מ, 1 מ"מ או 2 מ"מ עובי מאזור תא המטען של 4-איבר רב שונים ו / או רב תורם רקמה נעימה בין 40 עד 55 שנים, לפי החוקים הלאומיים קציר, עיבוד והפצה של רקמות להשתלה (CNT 2013).
      1. בעדינות ולשטוף את כל הדגימות בתמיסת 0.9% NaCl לשים אותם בצלחת על שייקר מסלולית במשך 5 דקות.
      2. באמצעות ביופסיה של 5 מ"מ, ליצור דוגמאות אשר הם אחידים בקוטר מרקמת העור, Ded ו הדרמיס ולשקול כל דגימות רקמה לפני חלוקה.
      3. כנס שמונה, שלוש או ארבע דגימות אחידות של רקמת עור, Ded או הדרמיס בהתאמה, המשבש הרקמות, הוספת 1.5 מיליליטר של תמיסת מלח על החלוקה.
      4. בצע שונהבעתות חלוקות לכל דגימות הרקמה הצביעו כפי בטבלה 1.
      5. השתמש במספר כתב של ביופסיות אגרוף נגזרות דגימות רקמת שלמים כקבוצת ביקורת.
      6. לאחר חלוקה מכני, לשאוב את תמיסת מלח המכיל מיקרו-שתלי ומקום בנפרד כל דגימה בתוך באר אחת של צלחת 12-היטב. בצע את הפרוטוקול זהה עבור ביופסיות אגרוף שליטה ללא פגע.
      7. הוסף 1ml של מדיום 1640 RPMI בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקת מדגם זה.
      8. להעריך את כדאיות התא מיד. זה טוב המכיל-שתל מיקרו (והושג ע"י חלוקה סימולטני של שמונה, שלושה או ארבעה דגימות אחיד של רקמת העור, Ded או הדרמיס בהתאמה) להוסיף 1ml של המדיום המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-י.ל.) פתרון ברומיד] -2,5 diphenyltetrazolium דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C באווירה של 5% 2 / אוויר CO. בצע את הפרוטוקול אותה לשליטה ללא פגעאגרוף ביופסיות.
      9. לאחר דגירה, להסיר את כל MTT בינוני המכיל ולהוסיף לכל sulfoxide דימתיל מדגם 1 מ"ל (DMSO) במשך 10 דקות.
      10. העבר לדגום כל DMSO ב קובט ולקרוא בו צפיפות אופטית (OD) ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. חישוב כדאיויות תא כיחס בין הספיגה ב 570 ננומטר ואת המשקל בגרמים (גר ') של רקמה בשימוש לפני החלוקה. בצע את הפרוטוקול זהה עבור ביופסיות אגרוף שליטה ללא פגע.
    2. לאחר חלוקה מכני, לשאוב את תמיסת מלח המכיל מיקרו-שתל נגזר רקמות העור, Ded ו הדרמיס דגימות של מתורם יחיד.
      1. מניחים בנפרד כל דגימה בתוך באר אחת של צלחת 12-היטב או בבקבוק תרבות עבור מבחן כדאיות התא ניתוח מורפולוגי בהתאמה.
      2. מיקרו-שתלי תרבות הוספת 1 ​​מ"ל (צלחת 12-היטב) או 5 מ"ל (בקבוק תרבות) של RPMI 1640 בתוספת בינוני עם 10% FBS ואנטיביוטיקה ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2 / AIr למשך 24 שעות או 7 ימים.
      3. להעריך את כדאיות התא לאחר 24 שעות או 7 ימים (חזור על שלבים 2.1.8-2.1.10).
      4. ביצוע ניתוח מורפולוגי הערכת הנוכחות של תרחיף תאים על ידי מיקרוסקופ אור לאחר 24 שעות ו -7 ימים של תרבות בקבוק.
      5. ניתוח דגימות של הדרמיס עבור חיוביות אל mesenchymal וסמנים תאים hematopoietic, כולל CD146, אנטיגנים CD34 ו CD45 על ידי FACS ניתוח 6.
      6. תחת זרע תזרים ברדס למינרית כל-שתל מייקרו (והושג ע"י החלוקה סימולטני של שמונה, שלוש או ארבע דגימות אחידות של רקמת עור, Ded או הדרמיס בהתאמה) ושבר כתב קטן של כל דגימת רקמה לא מפוצל לגמרי (> 50 מיקרון גודל לאחר תהליך חלוק) על צלחת אגר קולומביה המכילה מרק דם כבשים 5% 100 μl.
      7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים ולבצע ניתוח מיקרוביולוגית על צלחת אגרה קולומביה כדי להעריך את העקרות 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר ראשוני זה, המטרה הראשונה הייתה לבדוק את היכולת של שתלי מייקרו עצמיים אדם בשילוב עם תמיכה ביולוגית, כגון קולגן, לייצר ביו-מתחמים מוכנים לשימוש. ביו-מתחמים אלה הושתלו בחולה עם פצע ברגל נגרם על ידי (איור 2 א) בתאונת דרכים מחדש epithelialization מלא הקשורים לתקן רקמות לאחר 30 ימים (איור 2 ב) נצפה. יתר על כן, המעקב הקליני הראה מרקם טוב ורכות של האזור הפגוע לאחר 5 חודשים (איור 2 ג). במקביל ליישום קליני, במבחנה בוצעה גם להעריך את כדאיויות התא של רקמות עורית שונות כגון רקמת עור , Ded ו הדרמיס לפני ואחרי חלוקה על ידי המערכת הזו. בפרט, תוך לקיחה בחשבון את העובי השונה של כל סוג של רקמה, הסף של שמונה,ארבעה ושלוש ביופסיות שניתן לעבד אחד צעד עבור רקמת עור, Ded ו הדרמיס, בהתאמה, הוקמו. מספר הוקמה של ביופסיות היו מפולח אז בארבע פעמים שונות כמו שניתן לראות בטבלה 1, על פי המאפיינים הביולוגיים שלהם על מנת לזהות את המצב האופטימלי של חלוקה לשמור על כדאיויות תא טובות.

למרות עיבוד הרקמות בהכרח עוצמה מושרה ירידת ערך של כדאיויות תא לעומת רקמה שלמה, החלוקה המכאנית המבוצעת בעזרת מערכת זו נראית לשמור על ערך ממוצע של כדאיויות תא של 30% בכל הדגימות של עור, הדרמיס Ded ו הערך בזמנים שונים (איור 3 א), ביחס רקמות שלמות (איור 3 ב) (ממוצע של 92 OD / גר 'עבור רקמת עור ללא פגע ו -29 OD / גר' לאחר חלוקה; מ -22 OD / גר 'ל -7 OD / גר FOr שלם ded ביחס חלוקה ולבסוף מ -16 OD / גר 'ל -2.7 OD / גר' עבור הדרמיס שלם ביחס חלוקה). לפיכך, תוצאות הראשוניות אלה מראים כי מערכת זו היא מסוגלת לשמור על רמות ניכרות של כדאיויות תא לאחר חלוקה מיידית. השפעת חלוקה על כדאיות התא גם נחקר על דגימות רקמה בתרבית למשך 24 שעות או 7 ימים תוצאות משתנות נצפו. בפרט, אין שונות משמעותית של כדאיות התא בדגימות רקמת העור נצפתה באופן עצמאי על ידי הזמן של הומוגניזציה והתרבות לעומת שעת ההתחלה (T 0) (איור 4 א). מצד השני, כדאיות מופחתת של דגימות Ded לאחר 24 שעות של התרבות לעומת בהחלת השעון (T 0) נצפתה אך באופן תמוה כדאי התא שוקם לאחר 7 ימים של התרבות (האיור 4B). תוצאות דומות נצפו גם עבור דגימות של הדרמיס (איור 4C). כל דגימה הוערכה בשני עותקים וערכים המדווחים בטבלה 2.

על סמך התוצאות הללו, זיהינו את הזמן של חלוקה מתאים לשמור על כדאיות התא ספציפיות לשלושה סוגים של רקמות עורית כפי שדווח בטבלה 3. בנוסף כדאיות התא, ההיבט הצורני של ההשעיה הסלולר בתרבית הוערכה גם, זיהוי תאים בודדים לאחר 24 שעות מן חלוקת רקמות, זמן מה לאחר 7 ימים יש שאריות של סיבי בשתי רקמות עור דגימות Ded / הדרמיס נצפו (איור 5 א.ב.). בנוסף, אפיון התא על ידי זרימת cytometry הניתוח בוצע במדגם של הדרמיס לאחר המגון שלה: בריכת הטרוגנית של תאים שהלחין סוגי הסלולר, ובהם תאי האנדותל ותאי גזע mesenchymal זוהה (איור 6). יתר על כן, בהעדר התפתחות חיידקים זוהה i n כל הדגימות והמפולחות זורעות בעתו על מנות אגרו, המעידים על סטריליות של הליך ניסוי (איור 7).

איור 1
איור 1. ביו-מתחמי רקמות בניין מערכת שיבוש (א) ו אוסף של חתיכה קטנה של Derma מן נגע הפינה של החולה כי הייתה בהמשך מפוצל עם משבשי רקמות. ביו המתחמים התקבלו שילוב-שתל מייקרו על ספוגי קולגן תיקוני האדם להשיג מוכן לשימוש לתיקון הנגע (C). (ד) Hematoxylin & eosin (H & E) מכתים של נציג ביו-קומפלקס תרבותי במשך שלושה ימים במדיום DMEM וצפו במיקרוסקופ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2. יישום ביו-מתחמים על רגל נגע המתחמים ביו-שהלחינו קולגן-שתל מייקרו מתקבל החולה יושם על נגע הרגל (א) והפצע הוערך לאחר 30 ימים (ב) ו -5 חודשים (C ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. C ell הכדאיים מייד לאחר חלוקה בשעות שונות של שלושה סוג של רקמות עורית (א) ביחס לרקמות עורית שלמים (B). העור, Ded ו הדרמיס רקמות שמקורן ארבעה תורמים שונים היו מפולחות עם הרקמה disruptors כמו מצביע בסעיף המתאים בטקסט. כדאיות התא הוערכה על ידי מבחן MTT ביצע בשני עותקים עבור כל דגימת רקמה. הגרף הוא נציג של ארבעה ניסויים שונים שבוצעו בשני עותקים עבור כל דגימה. התוצאות באות לידי ביטוי כיחס בין צפיפות אופטית (OD) ו גרם (גרם) של רקמות; סטיית התקן חושבה על היחס בין צפיפות אופטית (OD) ו גרם (גרם) של רקמות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
רמות כדאיות איור 4. C ell של מדגם מפוצל של רקמת עור (א), Ded (B) ו הדרמיס (C) כדי בהחלת שעון (T 0) ואחרי תת למשך 24 שעות ו -7 ימים. הרקמות היו הומוגני עם רקמות משבשים כמו אינדיקהte בסעיף המתאים בטקסט. הדגימות והמפולחות היו ובהמשך בתרבית למשך 24 שעות ו -7 ימים לאחר החלוקה ומתוחזק RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% בסרום שור עובר ואנטיביוטיקה ב 37 ° C באווירה של 5% CO2 / אוויר. כדאיות התא הוערכה על ידי MTT כפי שתואר לעיל. הגרף הוא נציג של ניסוי מבוצע בשני עותקים עבור כל דגימה של רקמת העור, Ded ו הדרמיס נגזר מאותו תורם. התוצאות באות לידי ביטוי היחס בין צפיפות אופטית (OD) ו גרם (גרם) של רקמות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. ניתוח מורפולוגי של רקמת עור מפוצלת (א) ו Ded / הדרמיס (B) לאחר 24 שעות ו -7 ימים של קאלט יור. ניתוח מורפולוגי בוצע באמצעות מיקרוסקופ אור לאחר 24 שעות ו -7 ימים של התרבות בנוכחות של מדיום RPMI על רקמת עור ורקמות Ded / הדרמיס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
אפיון Cell איור 6. על ידי ניתוח cytometry זרימה. לאחר חלוקה מכני, מיקרו-שתלי מתקבל על ידי הדרמיס הועלו בתרבות ואחרי 7 ימים נותחו עבור חיוביות כדי mesenchymal ו סמן תא hematopoietic, כולל CD146, CD34 ו CD45 אנטיגנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

les / ftp_upload / 53,579 / 53579fig7.jpg "/>
איור 7. ניתוח מיקרוביולוגיות של רקמת עור מפוצלת, Ded ו הדרמיס דוגמאות. שברים קטנים של דגימות רקמה ומפולחות היו זורעים על אגרת קולומביה הוסיף 5% כבשי דם (Biomerieux חברה) מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית וטופח על 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים לבצע את ניתוח המיקרוביולוגית ולהעריך את סטריליות של הליך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דגימות רקמה חלוקת פעמים (שניות / דקה)
עור 30 שניות
דקה 1
2 דקות
5 דקות
Ded דקה 1
2 דקות
5 דקות
10 דק '
עוֹר דקה 1
2 דקות
5 דקות
10 דק '

ייצוג סכמטי טבלת 1. טיימס הארבעה השונה המשמש חלוקה של עור, Ded ו בדרמיס. שמונה, ארבעה ושלוש אגרוף ביופסיות של עור, Ded ו הדרמיס בהתאמה היו מפולחים בארבע פעמים שונות, בהתאם למאפיינים הביולוגיים שלהם.

רקמת העור
ל 24 שעות 7 ימים
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 41.07143 41.07143 65.78571 41.14286 37.42857
35.8 43.82143 36.60714 66.5 41.46429 38.67857
Ded
T 0 24 שעות 7 ימים
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7.85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
עוֹר
ל 24 שעות 7 ימים
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2.77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

טווח טבלה 2. של הערכים הבאים לידי ביטוי ב OD / גר 'עבור אחת ביולוגי לשכפל. ערכים של כדאיויות תא מרקמות עור, Ded ו הדרמיס הוערכו בהחלת שעון ואחרי חלוקה מכאנית במועדים מצוינים. התוצאות הן נציג של ניסוי אחד ביצע בשני עותקים כפי שבאה לידי ביטוי היחס בין צפיפות אופטית (OD) ו גרם (גרם) של רקמות.

דוּגמָה חלוקה זמן
רקמת העור 5 דקות
Ded דקה 1
derma 2 דקות

ייצוג סכמטי לוח 3. על הרגעים הכי יפים של חלוקה לשמור על כדאיות התא טוב ב DiffereNT רקמות דוגמאות. עור, Ded דגימות רקמות הדרמיס להראות את כדאיות התא אופטימלי אחרי 5, 1 ו -2 דקות של חלוקה, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר ראשוני מראה כי שתלי מיקרו-מתקבל על ידי פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם ספוגים קולגן, כפי שכבר דווח ביישומים קליניים אחרים, כדי לייעל את היעילות של שתלים מיקרו שתלי 9, 10. בפרט, מחקר זה דיווח על קיבולת של ביו -complexes, היווה ידי שתלים-מייקרו וספוגי קולגן, כדי adjuvant לריפוי הפצע של נגע רגל לאחר 30 ימים מהגשת בקשה קלינית. יתר על כן, תוצאות במבחנה לספק ראיות לגבי היעילות של פרוטוקול זה disaggregate שלוש רקמות עורית שונות, שמירה על כדאיויות תא ניכרות הוא מייד לאחר החלוקה המכאנית וגם לאחר 24 שעות ו -7 ימים של התרבות.

התחזוקה של כדאיויות תא לאחר סוג זה של הומוגניזציה מאפשרת להשיג רק צעד אחד-שתל מייקרו עצמי סטרילי, הימנעות מניפולציה נרחבת. עדות זו עולה בקנה אחדעם ניירות אחרונים אחרים בם את היעילות של פרוטוקול זה במבחנה נבדקת גם סוג של רקמות אחרים, כולל periosteum, ביופסיה של אטריית לב ושרירי rectus לרוחב של גלגל עין 5. בפרט, צפינו בדגימות Ded ו הדרמיס כדאי תא גדל לאחר 7 ימים של תרבות, ככל הנראה בשל שימוש מדיום בתוספת 10% בסרום שור עובר.

בנוסף לשמירה על כדאיויות תא, מערכת זו היא בטוחה וקלה לשימוש בעוד כמה דקות הוא מסוגל disaggregate סוגים שונים מכאני של רקמות למנוע שיבוש המבנים תאיים, ביחס לשיטות מסורתיות של בידוד תא, כגון אנזימטי עיכול הדורשות זמן רב יותר של ביצוע. יתר על כן, מערכת זו היא מסוגלת לבחור תאים עם ניתוק של 50 מיקרון ו היבט זה חשוב מאוד בהתחשב ההצלחה של שתלי מייקרו להזרקה, כי טווח זה כולל ובתאים מסוגלים להבדיל בסוגי תאים רבים ולאחר מכן לשפר את תיקון הנגע. פרוטוקול זה מאפשר לנו לא רק כדי להשיג קיימא אלא גם עצמיים-שתלי מיקרו, בהתחשב בכך את הנושא התורם גם את המקבל של מיקרו-שתלי אלה. הקיבולת של מערכת זו כדי להשיג-שתל מייקרו עצמי נמסרה בעיקר בתחום רפואת השיניים, שם הוכח השתיל כי בתאי גזע עצמיים שיניים זולות (DPSCs) בתוך הלא כלול פגם infrabony תרם תיקון חניכיימיים והתחדשות של מכולה maxilla 5,6. היכולת של מיקרו-שתלי אלה כדי לשפר את תהליך ריפוי הפצע גם דווחה בעבר בניהול פצעים מורכבים לאחר התערבות כירורגית או סיבוכים 4.

יתרון נוסף על השימוש עצמי ומוכן לשימוש-שתל מייקרו בהחלט החזקת תנאים סטריליים לאור השתל הבא שלהם על הנגעים בעור.

"Jove_content">

לסיכום, הפרוטוקול המתואר במאמר זה הראה את היכולת ליצור רקמות מייקרו שתל אדם מוכן לשימוש התערבות קלינית לשפר ריפוי של פצעי עור כרוניים / אקוטיים, כגון כאלו שהוצגו במחקר זה. תוצאות חוץ גופייה על האפשרות ליצור שתלי-מיקרו קיימא דווחו גם פרמטר זה בהחלט משמעותי להגדיל את אחוזי ההצלחה של תיקון רקמות. יחדיו, הנתונים הראו כי המערכת החדשה יכולה להיחשב כלי מבטיח עבור קלינאים זקוקים של מכשיר מהיר ובטוח בניהול פצעים בעור.

כרגע, אין שינויים מסוימים או מגבלות עבור הפרוטוקול ביישום הספציפי הזה, בהתחשב בכך את העור מייצגת רקמות קלות לשימוש במחקרים אחרים דיווחנו על היעילות באותו הפרוטוקול בנגעים בעור שונה 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אנטוניו גרציאנו הוא המנהל המדעי של srl המוח האנושי גל כי מייצר ומשווק את מערכת Rigenera. המחבר לטיציה Trovato הוא משת"פ של חטיבת מדעי של המוח האנושי גל srl

Acknowledgments

המחברים מבקשים הודות ד"ר פדריקה Zanzottera לתרום לחקר ביצוע ניתוח תזרים cytometry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics