Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Протокол описывает новый метод дезагрегации тканей человека и создать аутологичных микро-трансплантаты, которые, в сочетании с коллагеном губок, порождающие человека био-комплексов, готовых к использованию в лечении поражений кожи. Кроме того, эта система сохраняет жизнеспособность клеток микро-трансплантатов в разное время после механической дезагрегации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить еще один этап лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление хронических, но и острых ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. В этом исследовании мы описываем новый метод для создания аутологичных микро-трансплантаты из кожной ткани одного пациента и их клинического применения. Кроме того, в пробирке биологическая характеристика кожной ткани , полученной из кожи, де-epidermized дермы (DED) и дермы полиорганной и / или доноров нескольких тканей также была проведена. Все ткани были разбиты по этим новым протоколом, что позволяет нам получить жизнеспособные микро-трансплантатов. В частности, мы сообщали, что этот инновационный протокол способен создать био-комплексы, составленные аутологичных микро-трансплантатов и коллагеновых губок, готовых наносить на кожных поражений. Клиникал применение аутологичных биологических комплексов на поражения ног также сообщалось, показывая улучшение как процесса повторного epitalization и мягкости поражения. Кроме того, наша модель в пробирке показали , что жизнеспособность клеток после механического разукрупнения с этой системой поддерживается в течение долгого времени до семи (7) дней культуры. Мы также наблюдали, с помощью проточной цитометрии, что пул клеток, полученных из дезагрегации состоит из нескольких типов клеток, в том числе мезенхимальные стволовые клетки, которые оказывают ключевую роль в процессах регенерации и восстановления тканей, для их высокой регенеративного потенциала. Наконец, мы продемонстрировали в пробирке , что эта процедура сохраняет стерильность микро-трансплантатов при культивировании в чашки с агаром. Таким образом, мы приходим к выводу, что этот новый регенеративный подход может быть перспективным инструментом для врачей, чтобы получить в одну стадию жизнеспособного, стерильный и готов к использованию микро-трансплантаты, которые могут быть применены по отдельности или в сочетании с наиболее распространенным биологическим scaffoLDS.

Introduction

В последние годы несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить один шаг лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление острыми, но в основном хронических ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. Существует свидетельств того, что хронические раны стали серьезной глобальной проблемой здравоохранения, в результате чего огромное финансовое бремя на системы здравоохранения во всем мире 1.

Чтобы увеличить скорость успеха в лечении поражений кожи, отсутствие обширной манипуляции (в том числе сотовой усиления) и поддержание стерильных условий необходимы для того, чтобы создать клеточную суспензию, которую может быть выполнено немедленно на поврежденный участок пациентов, что позволит избежать более длительного обработки в чистых помещениях, таких как мобильные заводы. улицаarting из небольших биопсий кожи, шлифовка, центрифугирования и других методов разделения (например, ферментативным или механические), которые часто используются для получения суспензии клеток, которые могут быть выращены в среде для роста. Все эти методы обычно требуют длительного времени выполнения, подчеркивая клеточных структур, а также приводит к снижению жизнеспособности клеток. Другим важным аспектом является получение аутологичных клеточной суспензии готов к использованию клиницистами, например, для ремонта поврежденных участков. Кроме того, хорошо известно , что трансплантаты аутологичных ткани выживают процедуры передачи , чтобы в конечном итоге выжить в месте реципиента принципами индукции и проводимости 2, 3. Идеальная трансплантат ткани должны быть легко доступны и имеют низкую антигенность и доноров сайта заболеваемости 4.

На основании этих доказательств, первая цель данного исследования состояла в том, чтобы создать аутологичных био-комплексы, пригодные дляклиническое применение в восстановлении тканей. Для этой цели мы описываем новый метод для получения аутологичных микро-трансплантаты, начиная от кожных тканей, которые были с разбивкой по этому протоколу. Случай презентации также описано здесь в качестве клинического применения аутологичных микро-трансплантатов, полученных этим протоколом в сочетании с коллагеном губок. Такой подход уже сообщалось , чтобы быть эффективными в механической дезагрегации тканей человека 5 и он был использован в клинике для трансплантатов и регенерации тканей дермы 6,7, а также для регенеративной терапии соединительной ткани в полости рта челюстно - лицевой хирургии 8-10 ,

Кроме того, второй целью данного исследования было биологическая характеристика кожных тканей после того, как их дезагрегации по этому протоколу. С этой целью различные гомологичные образцы кожной ткани происходит от области ствола различных полиорганнойи / или доноры нескольких тканей были обработаны в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распределению тканей для трансплантации (НСТ 2013) на Эмилия-Романья Региональный Skin Bank.

История болезни:

A 35-летний пациентка показывает сложную травму из-за автомобильной аварии был принят в отделении интенсивной терапии больницы Анконы. Пациент показал инфекцию на ноге из-за открытой раны и сложный перелом, стабилизированный внешней фиксации. Два радикала санацию были выполнены и когда рана стала чистой после отрицательной Прессотерапия (VAC терапия) и надкостницы выглядели здоровыми, мы применили протокол по истечении двух месяцев с момента восстановления. После дезагрегации с этой системой, микро-трансплантаты, полученные были использованы для создания био-комплексы с коллагеновой губки, которые впоследствии были имплантированы для того, чтобы исследовать их эффективность по ремонту повреждений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: так как клиническое применение протокола требует использования кожным аутогенной ткани пациента, его характеристика в пробирке проводили до клинического применения на гомологичной кожной ткани в Эмилия - Романья Региональный банк кожи с соблюдением требований национальных правил по заготовке, переработке и распределение тканей для трансплантации (НСТ 2013).

1. Био-комплекс здания для клинического применения

Примечание: Этот протокол клинически основанный на использовании Rigeneracons (ткань дезинтегратор) и Rigenera Machine (тканевой системы дезинтегратор) (Рис . 1А) Дезинтегратор ткани представляет собой биологический медицинский разрушитель человеческих тканей, способных нарушить небольшие кусочки тканей с использованием сетки, представленную шестиугольными лезвиями и фильтрующих элементов и компонентов внеклеточного матрикса с отсечкой около 50 микрон.

  1. Соберите skinsamples пациента через биopsy пуансон (Фиг.1В) и дезагрегации добавлением 1 мл физиологического раствора для каждой части , чтобы получить аутогенные трансплантаты микро-6,7,9 (или см шаг 2.1).
  2. Поместите 1 мл микро-трансплантатов на коллагеновых губок (Рисунок 1C) toform био-комплексы использовать для клинического применения.
  3. Культура еще 1 мл микро-трансплантатов на коллагене губок в присутствии 6 мл DMEM среде , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 увлажненной атмосфере.
  4. После 3-х дней культивирования фиксируют био-комплексы с 0,3% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Налейте парафин с конкретным дозатором непосредственно на образце. Получают срезы с помощью микротома толщиной 5 мкм и поместить непосредственно в стеклянном салазкам.
  5. Погружают парафиновые срезы 5 мкм в стакане для гистологического анализа, содержащий 15 - 20 мл ксилола (имеющийся в продаже - смесь м-ксилол (40 - 65%), п-ксилол (20%), о-ксилол (20% ) и ETHил бензола (6 - 20%) и следы толуола, триметилбензол, фенол, тиофен, пиридин и сероводород) в течение 3 минут каждый.
  6. Погружают ломтики в убывающем сортов (100% до 70%) этанола (100% этаноле в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 часа, 70% этанола в течение 1 ч), а затем деионизированной воды для де-paraffinizing и регидратации секции.
  7. Пятно разделы с 1 - 2 мл 1 г / л Ematoxylin за 1 - 2 мин, а затем промыть в воде, чтобы удалить любые излишки Ematoxylin.
  8. Пятно секции для 4 - 5 мин с спиртовым раствором эозин Y при 1% концентрации в смеси с этанолом 70% и разводят в воде.
  9. Используйте 1 - 2 мл эозина Y для каждой секции слайдов и промыть под проточной водой.
  10. Погрузитесь секции в увеличении сортов этанола (см шаг 1.6) и , наконец, после прохождения в ксилоле в течение 1 ч, покровное с основанным монтажа mediumand наблюдать под световым микроскопом при 100 - кратном увеличении (рис 1D).
  11. </ Ол>

    2. Сбор, Разбивка и экстракорпоральное Анализ тканей

    1. С помощью дерматома, принимать независимые ткани кожи, папиллярной де-epidermized дермы (DED) или ретикулярной дермы (дермы), соответственно, на 0,6 мм, 1 мм или 2 мм толщиной от области ствола 4-х различных полиорганной и / или многоканальные доноров тканей в диапазоне от 40 до 55 лет, в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распространении тканей для трансплантации (CNT 2013).
      1. Аккуратно промойте все образцы в 0,9% растворе NaCl положить их в блюдо на орбитальном шейкере в течение 5 мин.
      2. Используя трепанобиопсия 5-мм, создавать образцы, которые являются однородными в диаметре от кожной ткани, DED и дермы и взвесьте все образцы тканей перед дезагрегации.
      3. Вставка, восемь трех или четырех однородных образцов ткани кожи, DED или дермы соответственно, в дезинтегратор ткани, добавлением 1,5 мл физиологического раствора для дезагрегации.
      4. Выполните разныевремена дезагрегации для всех образцов ткани , как указано в таблице 1.
      5. Используйте соотвествующее число перфорационных биопсий, полученных из образцов неповрежденной ткани в качестве контрольных.
      6. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантатов и поместить отдельно каждый образец в отдельную лунку 12-луночного планшета. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
      7. Добавить 1 мл RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики для каждого образца.
      8. Оценка жизнеспособности клеток немедленно. В каждую лунку, содержащую микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, DED или дермы соответственно) добавляют 1 мл среды, содержащей 0,5 мг / мл МТТ (3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]) раствор бромида -2,5 дифенилтетразолийбромид и инкубировать в течение 3 ч при 37 ° с в атмосфере 5% СО 2 / воздух. Выполните тот же протокол для интактного контроляпробивать биопсию.
      9. После инкубации, удалить всю среду, содержащую МТТ, и добавляют к каждому образцу 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 10 мин.
      10. Передача каждого образца и ДМСО в кювете и считывали при оптической плотности (OD) при 570 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать жизнеспособность клеток как отношение оптической плотности при длине волны 570 нм и вес в граммах (гр) ткани, использованными перед дезагрегации. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
    2. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантат, полученный из тканей кожи, DED и дермы образцы одного донора.
      1. Поместите отдельно каждую пробу в отдельную лунку 12-луночного планшета или в культуральной колбе для испытания жизнеспособности клеток и морфологического анализа соответственно.
      2. Культура микро-трансплантаты прибавлением 1 мл (12-луночный планшет) и 5 мл (культуральный флакон) в среде RPMI 1640 , дополненной 10% FBS и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 / AIг в течение 24 часов или 7 дней.
      3. Оценка жизнеспособности клеток через 24 часа или 7 дней (повторите шаги 2.1.8-2.1.10).
      4. Выполните морфологический анализ оценки присутствия суспензии клеток с помощью световой микроскопии после 24 часов и 7 дней культивирования в колбе.
      5. Анализируют образцы дермы для позитивности к мезенхимальных и маркеры гемопоэтических клеток, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов с помощью анализа FACS 6.
      6. Под ламинарного потока семян капот каждый микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, Дедом или дермы соответственно) и корреспондентскому небольшой фрагмент каждого образца ткани не полностью детализированном (> 50 мкм по размеру после того, как процесс дезагрегирования) на колумбийского агара, пластину, содержащую 5% овечьей крови отвар по 100 мкл.
      7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение трех дней , а также выполнять микробиологического анализа на колумбийского агара пластины с целью оценки стерильности 11,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом предварительном исследовании, первая цель состояла в том, чтобы исследовать способность человека аутологичных микро-трансплантатов в сочетании с биологической поддержки, таких как коллаген, для производства био-комплексов, готовых к использованию. Эти био-комплексы были имплантированы у пациента с поражением ног , вызванного дорожно - транспортного происшествия (рис 2А) и полной повторной эпителизации , связанного с восстановлением тканей после 30 дней (Фигура 2В) наблюдалась. Кроме того, клиническое наблюдение показало хорошую текстуру и мягкость поврежденной области после того, как 5 месяцев (фиг.2с). Параллельно с клинического применения, в пробирке исследования также были проведены для оценки жизнеспособности клеток различных кожных тканей , таких как ткани кожи , Ded и дермы до и после дезагрегации с помощью этой системы. В частности, принимая во внимание различную толщину каждого типа ткани, порог восьми,четыре и три биопсий, которые могут быть обработаны в одной стадии для ткани кожи, DED и дерме, соответственно, была создана. Установленное число биопсий затем были разбиты на четыре разные моменты времени , как указано в таблице 1, в соответствии с их биологическими характеристиками , с тем чтобы определить оптимальные условия разукрупнения для поддержания хорошей жизнеспособности клеток.

Хотя обработка ткани сама по себе неизбежно индуцировали ухудшение жизнеспособности клеток по сравнению с интактной ткани, механическое дезагрегации выполняется с помощью этой системы, кажется, поддерживать среднее значение жизнеспособности клеток на 30% во всех образцах кожи, DED и дермы оценивается в разное время (рис 3А), по отношению к неповрежденной ткани (рис 3B) (среднее значение 92 OD / г для неповрежденной кожной ткани и 29 OD / г после разукрупнения, от 22 OD / г до 7 OD / г FOг нетронутыми Ded относительно разукрупнения и, наконец, от 16 OD / г до 2,7 OD / г для неповрежденных дермы по отношению к дезагрегации). Таким образом, эти предварительные результаты показывают, что эта система способна поддерживать заметное количество жизнеспособности клеток после немедленного дезагрегации. Влияние дезагрегации на жизнеспособность клеток также была исследована на образцах тканей, культивированных в течение 24 ч или 7 дней и переменные результаты наблюдались. В частности, не наблюдалось существенного изменения жизнеспособности клеток в образцах ткани кожи независимо друг от друга в зависимости от времени гомогенизации и культуры по сравнению с начального времени (Т 0) (рис 4A). С другой стороны, пониженная жизнеспособность образцов DED после 24 ч культуры по сравнению с началом времени (T 0) наблюдалось , но на удивление жизнеспособность клеток была восстановлена ​​после 7 дней культивирования (фиг.4В). Аналогичные результаты наблюдались также для образцов дермы (рис 4C). Каждый образец оценивали в двух экземплярах и значений , представленных в таблице 2.

На основании этих результатов, мы определили подходящее время дезагрегации для поддержания жизнеспособности клеток для трех типов кожной ткани , как показано в Таблице 3. В дополнение к жизнеспособности клеток, морфологический аспект культивируемой клеточной суспензии также оценивали, идентификации отдельных клеток после 24 ч от дезагрегации ткани, в то время как после того, как были обнаружены 7 дней там остатки волокон в ткани кожи как и образцы Ded / дерме (рис 5 AB). Кроме того, характеристика клеток с помощью проточной цитометрии проводили в образце дермы после того, как его гомогенизацию: гетерогенный пул клеток , составленных несколькими сотовыми типов, в том числе эндотелиальные клетки и мезенхимальные стволовые клетки были идентифицированы (рисунок 6). Кроме того, отсутствие роста бактерий был идентифицирован I п все дезагрегированные образцы подходяще высевали на чашки с агаром, что свидетельствует о стерильности экспериментальной процедуры (рисунок 7).

Рисунок 1
Рисунок 1. Био-комплексов Строительство тканей срыве системы (А) и Коллекция небольшой кусочек Derma от поражения Район пациента , который впоследствии был Дезагрегированный с тканью разрушители. Био-комплексы были получены объединением микро-трансплантатов на коллагеновых губок чтобы получить человеческие патчи готовый к использованию для ремонта повреждений (с). (D) гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание представителем био-комплекс культивировали в течение трех дней в DMEM среде и наблюдали микроскопии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Содержание "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> фигура 2
Рисунок 2. Био-комплексы Применение на ноге заболеваний кожи био-комплексы , составленные коллагена и микро-трансплантатов , полученных от пациента , наносили на поражение ног (A) , и рана оценивали через 30 дней (В) и 5 месяцев (С ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. C ELL Жизнеспособность Сразу после дезагрегации в разное время три типа кожных тканей (А) по отношению к интактным кожных тканей (B). Кожа, DED и дерме ткани , полученные из четырех различных доноров были разбиты с disru тканиptors как указать в соответствующем разделе в тексте. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста МТТ дублировались для каждого образца ткани. График является представителем четырех различных экспериментов, выполненных в двух повторностях для каждого образца. Результаты выражали как отношение оптической плотности (OD) и г (гр) ткани; стандартное отклонение рассчитывали по соотношению оптической плотности (OD) и г (гр) ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. C ELL Жизнеспособность Уровни дезагрегированном образца ткани кожи (A), Ded (B) и дермы (С) Время включения (T 0) и после того, как субкультуры в течение 24 часов и 7 дней. Ткани гомогенизируют с тканью разрушители как индикит.е в соответствующем разделе в тексте. Дезагрегированные образцы были впоследствии культивировали в течение 24 часов и 7 дней после дезагрегации и поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% СО2 / воздух. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ, как описано ранее. График является представителем эксперимента, выполненного в двух экземплярах для каждого образца ткани кожи, DED и дермы, полученный от одного донора. Результаты выражены как отношение оптической плотности (OD) и г (гр) ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. морфологический анализ дезагрегированных кожной ткани (А) и Ded / Дерма (B) после того, как 24 часа в сутки и 7 дней Cult Юр. Морфологический анализ проводили с использованием световой микроскопии через 24 часа и 7 дней культивирования в присутствии RPMI среды на ткани кожи и ПСД / дермы тканей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Определение характеристик ячеек с помощью проточной цитометрии. После механической дезагрегации, микро-трансплантаты , полученные дермы были введены в культуру и через 7 дней были проанализированы на позитивности к мезенхимальных и гемопоэтических клеток маркера, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.

ле / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Микробиологический анализ Дезагрегированные ткань кожи, DED и дермы образцов. Небольшие фрагменты образцов детализированных ткани были высеяны на Колумбийский агар добавили 5% овечьей крови (BioMerieux Company) под колпаком с ламинарным потоком и инкубировали при 37 ° С в течение трех дней выполнить микробиологического анализа и оценки стерильность процедуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ОБРАЗЦЫ ТКАНИ ДЕЗАГРЕГИРОВАНИЯ (сек / мин)
кожа 30 сек
1 мин
2 мин
5 мин
Ded 1 мин
2 мин
5 мин
10 минут
дерма 1 мин
2 мин
5 мин
10 минут

Таблица 1. Схематическое представление четырех различных времен использовали для дезагрегации кожи, Ded и дермы. Восемь, четыре и три удара биопсию кожи, Ded и дермы , соответственно , были разбиты на четыре разные моменты времени, в соответствии с их биологическими характеристиками.

ткань кожи
к 24 часа в сутки 7 дней
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37,1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35,8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
Ded
T 0 24 часа в сутки 7 дней
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
дерма
к 24 часа в сутки 7 дней
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Таблица 2. Диапазон значений экспрессируется в OD / г для одной биологической Реплицировать. Значения жизнеспособности клеток из кожной ткани, Ded и дермы оценивали на время начала и после механического разукрупнения в указанное время. Результаты являются репрезентативными для одного эксперимента, выполненного в двух экземплярах и выражали в виде соотношения между оптической плотности (OD) и г (гр) ткани.

образчик Разбивка Время
ткань кожи 5 мин
Ded 1 мин
дерма 2 мин

Таблица 3. Схематическое изображение Лучшее время дезагрегации для поддержания хорошего Жизнеспособность клеток в Differeнт образцов тканей. Кожа, DED и образцы тканей дермы показывают оптимальную жизнеспособность клеток после того, как 5, 1 и 2 мин дезагрегации, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это предварительное исследование показало , что микро-трансплантаты , полученные с помощью этого протокола можно комбинировать с коллагеновыми губками, как уже сообщалось в других клинических применениях, для оптимизации эффективности микро-трансплантаты имплантатов 9, 10. В частности, это исследование показало , способность био -комплексы, состоящими из микро-трансплантатов и коллагеновых губок, адъювантной заживлению раны поражения ног после 30 дней от клинического применения. Кроме того, в пробирке результаты свидетельствуют об эффективности этого протокола детализировать три различных кожных тканей, сохраняя значительную жизнеспособность клеток как непосредственно после механической дезагрегации , а также через 24 часа и 7 дней культивирования.

Поддержание жизнеспособности клеток после такого рода гомогенизации позволяет получить в один шаг стерильных аутологичных микро-трансплантатов, избегая масштабной манипуляции. Это свидетельство согласуетсяс другими недавних работ , в которых был испытан и в другом типе тканей, в том числе надкостницы, биопсии сердца предсердием и латеральной прямой мышцы глазного яблока 5 Действенность этого протокола в пробирке. В частности, мы наблюдали в DED и дермы образцах повышенную жизнеспособность клеток через 7 дней культивирования, вероятно, из-за использования среды, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки.

В дополнение к поддержанию жизнеспособности клеток, эта система безопасна и проста в использовании и в течение нескольких минут в состоянии механически разъединять различные типы тканей, предотвращающих разрушение клеточных структур, по отношению к традиционным методам выделения клеток, таких как ферментативные пищеварения, которые требуют больше времени выполнения. Кроме того, эта система может выбирать клетки с отсечкой 50 мкм, и этот аспект очень важен при рассмотрении успеха инъекционные микро-трансплантатов, потому что этот диапазон включает в себяклетки-предшественники способны дифференцироваться во многих типах клеток, а затем улучшить ремонт поражения. Этот протокол позволяет не только получить жизнеспособные, но и аутологичных микро-трансплантатов, при условии, что субъект донор также акцептором этих микро-трансплантатов. Пропускная способность этой системы для получения аутологичных микро-трансплантатов была особенно сообщалось в области стоматологии, где было показано, что трансплантация аутологичных стволовых клеток пульпы зуба (DPSCs) в не содержали infrabony дефект способствовало восстановления и регенерации атрофического периодонта МахШаге 5,6. Способность этих микро-трансплантатов для улучшения процесса заживления ран также сообщалось ранее в управлении сложными ран после хирургических вмешательств или осложнений 4.

Еще одно преимущество на использовании аутологичных и готов к использованию микро-трансплантаты, безусловно, хранение стерильных условиях с учетом их последующей имплантации на поражения кожи.

В заключение, протокол , описанный в этой статье , показал способность создавать человеческие микро-трансплантат ткани , пригодной для использования в клинической интервенции для улучшения заживления острых / хронических ран кожи, таких как те , которые указаны в данном исследовании. В пробирке результаты о возможности Создание жизнеспособных микро-трансплантаты также сообщалось, и этот параметр, конечно, значительное увеличение процента успеха в восстановлении тканей. Взятые вместе, данные показали, что эта новая система может рассматриваться как перспективный инструмент для врачей, которые нуждаются в быстром и надежном инструменте в управлении кожных ран.

На данный момент, нет особых модификаций или ограничения для протокола в этой конкретной области применения, при условии , что кожа представляет собой ткань , простой в использовании и в других исследованиях , мы сообщали об эффективности того же протокола в различных поражений кожи 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор Антонио Грациано является научным директором мозга человека Wave SRL, которая производит и продает системы Rigenera. Автор Летиция Trovato является сотрудником научного отдела мозга человека Wave SRL

Acknowledgments

Авторы выражают благодарности доктору Федерика Zanzottera за вклад в исследования, выполняющего проточной цитометрии анализа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics