Caracterização do tecido depois de um novo método de desagregação para a pele Micro-enxertos Generation

Medicine

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Summary

O protocolo descreve um novo método para desagregar os tecidos humanos e para criar micro-enxertos autólogos que, combinado com esponjas de colagénio, dá origem à bio-complexos humanos, prontos para utilização no tratamento de lesões da pele. Além disso, este sistema preserva a viabilidade das células de micro-enxertos em diferentes momentos após a desagregação mecânica.

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Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

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Abstract

Vários novos métodos foram desenvolvidos no campo da biotecnologia para obter suspensões celulares autólogas durante a cirurgia, a fim de proporcionar tratamentos de uma etapa para lesões cutâneas agudas e crônicas. Além disso, o tratamento de feridas agudas crónicas mas também resultantes de trauma, diabetes, infecções e outras causas, permanece um desafio. Neste estudo, descrevemos um novo método para criar autólogas micro-enxertos de tecido cutâneo de um único paciente e sua aplicação clínica. Além disso, também foi realizada in vitro caracterização biológica do tecido cutâneo derivadas da pele, derme desepidermizada (DED) e derme de múltiplos órgãos e / ou doadores de multi-tecido. Todos os tecidos foram desagregados por este novo protocolo, o que nos permite obter micro-enxertos viáveis. Em particular, relatou que este protocolo inovador é capaz de criar bio-complexos compostos por micro-enxertos autólogos e esponjas de colagénio prontas para serem aplicadas sobre lesões cutâneas. o cliniaplicação de bio-CAL complexos autólogos de uma lesão da perna também foi relatado, mostrando uma melhoria de ambos processo de re-epitalization e suavidade da lesão. Para além disso, o nosso modelo in vitro mostrou que a viabilidade das células após a desagregação mecânica com este sistema é mantido ao longo do tempo durante até sete (7) dias de cultura. Também se observou, por análise de citometria de fluxo, que o conjunto de células obtidas a partir de desagregação é composta por vários tipos de células, incluindo células estaminais mesenquimais, que exercem um papel fundamental nos processos de regeneração e reparação de tecidos, para o seu elevado potencial de regeneração. Finalmente, foi demonstrado in vitro que este procedimento mantém a esterilidade das micro-enxertos, quando cultivadas em placas de agar. Em resumo, conclui-se que esta nova abordagem regenerativa pode ser uma ferramenta promissora para os clínicos para se obter num só passo viável, esterilizado e pronto a utilizar micro-enxertos que podem ser aplicados isoladamente ou em combinação com mais Scaffo biológica comumLDS.

Introduction

Nos últimos anos, vários novos métodos têm sido desenvolvidos no campo da biotecnologia para obter suspensões celulares autólogas durante a cirurgia, a fim de proporcionar tratamentos de um passo para lesões cutâneas agudas e crónicas. Além disso, o tratamento de feridas agudas, mas principalmente crónicas resultantes de trauma, diabetes, infecções, e outras causas, permanece um desafio. Há evidências crescentes de que feridas crônicas tornaram-se um grave problema de saúde global, causando um encargo financeiro enorme para os sistemas de saúde em todo o mundo 1.

Para aumentar a taxa de sucesso no tratamento de lesões da pele, a ausência de manipulação extensiva (incluindo o reforço celular) e a manutenção de condições estéreis é essencial, a fim de criar uma suspensão celular que pode ser imediatamente aplicada sobre a área danificada da pacientes, evitando assim um maior processamento em salas limpas, como fábricas celulares. Starting a partir de pequenas biópsias de pele, moagem, centrifugação e outros métodos de separação (por exemplo, mecânica ou enzimática), são frequentemente utilizados para se obter uma suspensão celular, que podem ser cultivadas num meio de crescimento. Todos estes métodos requerem geralmente um longo período de tempo de execução, salientando as estruturas celulares, e que conduz a uma redução da viabilidade das células. Outro aspecto importante é a obtenção de uma suspensão celular autólogo preparado para ser utilizado por médicos, por exemplo, para reparar áreas danificadas. Além disso, está bem estabelecido que os enxertos de tecido autólogo sobreviver aos procedimentos de transferência de, eventualmente, sobreviver no local receptor pelos princípios da indução e condução 2, 3. O tecido do enxerto ideal deveria ser prontamente disponíveis e têm baixa antigenicidade e dador local morbidade 4.

Na base destas evidências, o primeiro objectivo deste estudo foi o de criar bio-complexos autólogos adequados paraaplicação clínica na reparação de tecidos. Para este fim, descrevemos um novo método para obter autólogas micro-enxertos a partir de tecidos cutâneos que foram desagregados por este protocolo. A apresentação do caso também é aqui descrito como uma aplicação clínica de micro-enxertos autólogos obtidos por este protocolo em combinação com esponjas de colágeno. Esta abordagem já foi relatada como sendo eficaz na desagregação mecânica dos tecidos humanos e 5 tem sido utilizado clinicamente para enxertos e a regeneração de tecidos dérmicos 6,7, bem como para as terapias de regeneração de tecidos conjuntivos em cirurgia oral-maxilofacial 8-10 .

Além disso, o segundo objetivo deste estudo foi a caracterização biológica dos tecidos cutâneos após a sua desagregação por este protocolo. Para este efeito, diferentes amostras de tecido cutâneo homólogos derivados de área do tronco de diferentes múltiplos órgãose / ou doadores multi-tecido foram processadas seguindo as normas nacionais relativas colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013) no Bank Emilia Romagna Regional da pele.

APRESENTAÇÃO DO CASO:

Uma paciente de 35 anos de idade, mostrando um trauma complexo devido ao acidente de carro foi admitido na Unidade de Terapia Intensiva do Hospital Ancona. O paciente mostrou uma infecção na perna devido a uma ferida aberta e uma fratura estabilizada com fixação externa. Dois desbridamento radical foram realizadas e quando a ferida se tornou limpa após a terapia de pressão negativa (terapia VAC) e do periósteo parecia saudável, foi aplicado o protocolo depois de dois meses de recuperação. Após a desagregação com este sistema, as micro-enxertos obtidos foram utilizados para criar bio-complexos com uma esponja de colagénio, que foram subsequentemente implantado, a fim de investigar a sua eficácia sobre a reparação da lesão.

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Protocol

Declaração de ética: uma vez que a aplicação clínica do protocolo requer o uso de tecido autólogo cutânea do paciente, a sua caracterização in vitro foi realizado antes do uso clínico sobre o tecido cutâneo homólogo do Bank pele Emilia Romagna Regional seguindo as orientações das normas nacionais de colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013).

1. Edifício Bio-complexo para Aplicação Clínica

NOTA: Este protocolo é clinicamente com base na utilização de Rigeneracons (disruptor de tecido) e o Rigenera Máquina (sistema disruptor de tecido) (Figura 1A). O disruptor de tecido é um disruptor médica biológica de tecidos humanos capazes de perturbar pequenos pedaços de tecidos por meio de uma grade fornecida por lâminas hexagonais e células de filtragem e componentes de matriz extracelular com um cut-off de cerca de 50 microns.

  1. Recolha skinsamples do paciente através de um bisoco opsy (Figura 1B) e desagregar a adição de 1 ml de solução salina por cada peça para obter autólogas micro-enxertos 6,7,9 (ou veja o passo 2.1).
  2. Colocar 1 ml de micro-enxertos sobre esponjas de colagénio (Figura 1C) toform bio-complexos de utilizar para aplicação clínica.
  3. Cultura mais 1 ml de micro-enxertos sobre esponjas de colagénio na presença de 6 ml de meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino a 37 ° C em atmosfera de CO2 a 5% humidificada.
  4. Após 3 dias de cultura, fixar os bio-complexos com 0,3% de paraformaldeído durante 10 min à TA. Verter a parafina com um distribuidor específico directamente sobre a amostra. Obter fatias com um micrótomo com espessura de 5 mm e colocar diretamente em um copo-slide.
  5. Imergir fatias de parafina de 5 pm em um copo para análises histológicas, contendo 15 - 20 ml de xileno (disponível comercialmente - uma mistura de m-xileno (40 - 65%), p-xileno (20%), o-xileno (20% ) e ethbenzeno il (6 - 20%) e traços de tolueno, trimetilbenzeno, fenol, tiofeno, piridina e sulfureto de hidrogénio), durante 3 minutos cada.
  6. Mergulhar as fatias em graus decrescentes (100% a 70%) de etanol (100% de etanol durante 1 h, 95% de etanol durante 1 h, 80% de etanol durante 1 h, 70% de etanol durante 1 hora) e água, em seguida água desionizada para de-paraffinizing e re-hidratação das secções.
  7. Manchar as seções com 1 - 2 ml de 1 g / L Ematoxylin para 1-2 min e posteriormente enxaguar em água para remover qualquer excesso de Ematoxylin.
  8. Corar as secções de 4 - 5 min com solução alcoólica de eosina Y à concentração de 1% misturado com etanol a 70% e diluiu-se em água.
  9. Use 1 - 2 ml de eosina Y para cada seção lâmina e lavar em água corrente da torneira.
  10. Imergir secções em aumentar os graus de etanol (ver passo 1.6) e, por fim, depois de uma passagem em xileno durante 1h, a lamela com uma base de montagem mediumand observar sob um microscópio de luz, uma ampliação de 100X (Figura 1D).
  11. </ Ol>

    2. Recolha, desagregação e Análise in vitro dos tecidos

    1. Usando um dermátomo, pegue o tecido independente da pele, papilares derme desepidermizada (DED) ou derme reticular (derme), respectivamente, de 0,6 mm, 1 mm ou 2 mm de espessura da área de tronco de 4 de múltiplos órgãos e / ou multi- diferente doadores de tecidos em um intervalo de 40 a 55 anos, seguindo as normas nacionais relativas colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013).
      1. Lave todas as amostras em solução de NaCl 0,9% colocando-os em um prato em um agitador orbital por 5 min.
      2. Usando o soco biópsia de 5 mm, criar amostras que são uniformes de diâmetro a partir do tecido da pele, Ded e derme e pesar todas as amostras de tecido antes da desagregação.
      3. Inserir oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente, no disruptor de tecido, adicionando 1,5 ml de solução salina por a desagregação.
      4. execute diferentetempos de desagregação para todas as amostras de tecido, tal como indicado na Tabela 1.
      5. Usar um número correspondente de biópsias derivados a partir de amostras de tecidos intactos como controlos.
      6. Após a desagregação mecânica, aspirar a solução salina contendo micro-enxertos e lugar separadamente cada uma das amostras num único poço de uma placa de 12 poços. Execute o mesmo protocolo para biópsias de controle intacto.
      7. Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos para cada amostra.
      8. Avaliar a viabilidade celular imediatamente. A cada poço contendo um micro-enxerto (obtido pela desagregação simultânea de oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente) adicionar 1 ml de meio contendo 0,5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5- dimetiltiazol-2-il] brometo) -2,5 difeniltetrazólio solução e incubar durante 3 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 / ar. Execute o mesmo protocolo para controle intactasoco biópsias.
      9. Após a incubação, MTT remover todo o meio contendo e adicionar a cada amostra de 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) durante 10 min.
      10. Transferir cada amostra e DMSO numa cuvete e lida a densidade óptica (DO) a 570 nm utilizando um espectrofotómetro. Calcular a viabilidade celular como a razão entre a absorvância a 570 nm e o peso em gramas (gr) de tecido utilizados antes desagregação. Execute o mesmo protocolo para biópsias de controle intacto.
    2. Após a desagregação mecânica, aspirar a solução salina contendo micro-enxerto derivadas de tecido da pele, as amostras Ded e derme de um único doador.
      1. Coloque separadamente cada amostra num único poço de uma placa de 12 poços ou em um frasco de cultura para o ensaio de viabilidade celular e análise morfológica respectivamente.
      2. Cultura micro-enxertos adição de 1 ml (placa de 12 poços) ou 5 ml (frasco de cultura) de meio RPMI 1640 suplementado com FBS 10% e antibióticos, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 / air durante 24 horas ou 7 dias.
      3. Avaliar a viabilidade celular após 24 horas ou 7 dias (repita os passos 2.1.8-2.1.10).
      4. Realizar a análise morfológica avaliar a presença de suspensão de células por microscopia de luz depois de 24 h e 7 dias de cultura em frasco.
      5. Analisar as amostras de Derme para a positividade ao mesenquimais e marcadores de células hematopoiéticas, incluindo CD146, CD34 e CD45 antígenos por análise FACS 6.
      6. Sob fluxo laminar semente capa cada micro-enxerto (obtido pela desagregação simultânea de oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente) e um pequeno fragmento correspondente de cada amostra de tecido não totalmente desagregado (> 50 mícron em tamanho após o processo de desagregação) na placa de agar de Columbia contendo 5% de caldo de sangue de carneiro a 100 ul.
      7. Incubar a placa a 37 ° C durante três dias e executar análise microbiológica em placa de agar Columbia, a fim de avaliar a esterilidade 11.

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Representative Results

Neste estudo preliminar, o primeiro objetivo foi investigar a capacidade de micro-enxertos autólogos humanos, combinado com um suporte biológico, como o colágeno, para produzir bio-complexos prontos para usar. Estes bio-complexos foram implantadas num doente com uma perna lesão causada por um acidente de carro (Figura 2A) e uma re-epitelização completa associado com a reparação de tecidos após 30 dias (Figura 2B) foi observado. Além disso, o seguimento clínico mostrou uma boa textura e macieza da área danificada depois de 5 meses (Figura 2C). Em paralelo com a aplicação clínica, os estudos in vitro foram também realizados para avaliar a viabilidade de células de diferentes tecidos cutâneos, tais como o tecido da pele , Ded e derme antes e depois da desagregação por este sistema. Em particular, tendo em conta a espessura diferente de cada tipo de tecido, o limiar de oito,quatro e três biópsias que podem ser processados ​​num único passo para o tecido da pele, Ded e derme, respectivamente, foi estabelecido. O número estabelecido de biópsias foram então desagregada em quatro momentos diferentes, tal como indicado na Tabela 1, de acordo com as suas características biológicas a fim de identificar a condição óptima de desagregação para manter uma boa viabilidade celular.

Embora o processamento de tecidos induzida inevitavelmente uma diminuição da viabilidade celular em comparação com o tecido intacto, a desagregação mecânica realizada com este sistema parece manter um valor médio de viabilidade celular de 30% em todas as amostras de pele, derme e Ded avaliadas em momentos diferentes (Figura 3A), com relação ao tecido intacto (Figura 3B) (média de 92 OD / gr de tecido da pele intacta e 29 OD / gr após a desagregação, a partir de 22 de OD / gr a 7 OD / gr for intacta Ded em relação à desagregação e, finalmente, a partir de 16 OD / gr para 2,7 OD / gr para derme intactas com relação à desagregação). Assim, estes resultados preliminares mostram que este sistema é capaz de manter os níveis apreciáveis ​​de viabilidade celular após a desagregação imediata. O efeito de desagregação na viabilidade das células foi também investigada em amostras de tecido cultivado durante 24 horas ou 7 dias e os resultados variáveis ​​foram observados. Em particular, nenhuma variação substancial da viabilidade celular em amostras de tecido da pele foi observada de forma independente por tempo de homogeneização e de cultura em comparação com o tempo de partida (T 0) (Figura 4A). Por outro lado, uma viabilidade reduzida das amostras Ded após 24 h de cultura em comparação com o tempo de início (T 0) foi observada, mas surpreendentemente a viabilidade celular foi restaurado após 7 dias de cultura (Figura 4B). Resultados semelhantes foram também observadas para as amostras de derme (Figura 4C). Cada amostra foi avaliada em duplicado e os valores relatados na Tabela 2.

Com base nestes resultados, foram identificados o tempo de desagregação adequada para manter a viabilidade das células por três tipos de tecido cutâneo como relatado na Tabela 3. Além disso, a viabilidade celular, foi também avaliado o aspecto morfológico de suspensão celular em cultura, a identificação de células individuais após 24 horas de desagregação do tecido, enquanto que depois foram observados 7 dias lá resíduos de fibras em ambos os tecidos da pele e amostras de Ded / derme (Figura 5 AB). Além disso, uma caracterização de células por citometria de fluxo de análise foi realizada numa amostra de derme após a sua homogeneização: um conjunto heterogéneo de células compostas por vários tipos celulares, incluindo células endoteliais e células estaminais mesenquimais foram identificados (Figura 6). Além disso, a ausência de crescimento bacteriano foi identificado i n todas as amostras desagregadas oportunamente semeadas em placas de agar, evidenciando a esterilidade do procedimento experimental (Figura 7).

figura 1
Figura 1. Bio-complexos Tissue Edifício Perturbar System (A) e Coleção de um pequeno pedaço de Derma da área da lesão do paciente, que foi posteriormente desagregado com Disruptores tecidos. Os bio-complexos foram obtidos combinando os micro-enxertos em esponjas de colágeno para obter manchas humanos pronta a usar para reparação da lesão (C). (D) hematoxilina & eosina (H & e) coloração de um representante bio-complexo cultivadas durante três dias em meio DMEM e observadas à microscopia por favor, clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 2
Figura 2. Aplicação Bio-complexos em Perna de Lesão Os bio-complexos compostos por colagénio e micro-enxertos obtidos a partir do paciente foram aplicados sobre a lesão perna (A) e a ferida foi avaliada após 30 dias (B) e 5 meses (C ). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. C ell Viabilidade Imediatamente após a desagregação em diferentes momentos do tipo três de cutâneas tecidos (A) em relação ao intactas cutâneas tecidos (B). A pele, Ded e derme tecidos derivados de quatro dadores diferentes foram desagregados com disru tecidoptors como indicam na seção apropriada no texto. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste MTT realizada em duplicado para cada amostra de tecido. O gráfico é representativos de quatro experiências diferentes realizadas em duplicado para cada amostra. Os resultados são expressos como uma razão entre a densidade óptica (OD) e gramas (gr) de tecido; o desvio padrão foi calculado com a relação entre a densidade óptica (OD) e gramas (gr) de tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Níveis Figura 4. C ell viabilidade de uma amostra desagregada do tecido da pele (A) o DED (B) e derme (C) a partir de tempo (T 0) e após a subcultura durante 24 horas e 7 dias. Os tecidos foram homogeneizados com tecidos disruptores como indicate na seção apropriada no texto. As amostras foram desagregados subsequentemente cultivadas durante 24 horas e 7 dias após a desagregação e mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibióticos, a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO2 / ar. A viabilidade celular foi avaliada através de MTT como anteriormente descrito. O gráfico é representativa de uma experiência realizada em duplicado para cada amostra de tecido da pele, e derme Ded derivado de um único doador. Os resultados são expressos como a relação entre a densidade óptica (DO) e gramas (gr) de tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Análise morfológica do tecido da pele desagregada (A) e Ded / Derme (B) após 24 horas e 7 dias de Cult ure. A análise morfológica foi realizada usando microscopia de luz depois de 24 horas e 7 dias de cultura na presença de meio RPMI sobre o tecido da pele e Ded / derme tecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. celular Caracterização pela Flow Análise Citometria. Depois de desagregação mecânica, micro-enxertos obtidos por derme foram postas em cultura e após 7 dias foram analisadas para a positividade para mesenquimal e marcador de células hematopoiéticas, incluindo antígenos CD146, CD34 e CD45. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. Análise microbiológica dos tecidos da pele desagregado, Ded e derme amostras. Pequenos fragmentos de amostras de tecido desagregados foram semeadas em agar de Columbia adicionou-se 5% sangue de carneiro (BioMerieux Company) sob fluxo laminar e incubou-se a 37 ° C durante três dias a realizar a análise microbiológica e avaliar a esterilidade do procedimento. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As amostras de tecido DESAGREGAÇÃO TIMES (seg / min)
Pele 30 seg
1 minuto
2 min
5 min
Ded 1 minuto
2 min
5 min
10 min
derme 1 minuto
2 min
5 min
10 min

Tabela 1. Representação esquemática dos quatro diferentes tempos utilizados para Desagregação da pele, Ded e derme. Oito, quatro e três biópsias de pele, Ded e derme, respectivamente, foram desagregados em quatro momentos diferentes, de acordo com as suas características biológicas.

O tecido da pele
Para 24 hr 7 dias
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37,1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35,8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
Ded
t 0 24 hr 7 dias
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
derme
Para 24 hr 7 dias
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabela 2. Faixa de valores expressos em OD / gr para uma réplica Biológica. Os valores de viabilidade celular do tecido da pele, Ded e derme avaliada a hora de início e após a desagregação mecânica aos tempos indicados. Os resultados são representativos de uma experiência realizada em duplicado e expressa como a relação entre a densidade óptica (OD) e gramas (g) de tecido.

espécime desagregação Tempo
O tecido da pele 5 min
Ded 1 minuto
Derma 2 min

Tabela 3. Representação esquemática do melhor momento de desagregação para manter uma boa viabilidade celular em DiffereAs amostras de tecido nt. da pele, Ded e amostras de tecido derme mostram a viabilidade celular óptimo após 5, 1 e 2 minutos de desagregação, respectivamente.

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Discussion

Este estudo preliminar demonstrou que as micro-enxertos obtidos por este protocolo pode ser combinada com as esponjas de colagénio, como já foi relatado em outras aplicações clínicas, para optimizar a eficácia de micro-implantes de enxertos 9, 10. Em particular, este estudo relatou a capacidade de bio em complexos, constituído por micro-enxertos e esponjas de colágeno, para adjuvante da cicatrização de uma lesão na perna após 30 dias de aplicação clínica. Além disso, in vitro resultados fornecem evidências sobre a eficácia deste protocolo de desagregar três tecidos cutâneos diferentes, mantendo uma viabilidade celular significativa tanto imediatamente após a desagregação mecânica e também após 24 horas e 7 dias de cultura.

A manutenção da viabilidade celular após este tipo de homogeneização permite obter em micro-enxertos autólogos apenas um passo estéreis, evitando manipulação extensiva. Esta evidência está de acordocom outros trabalhos recentes em que a eficácia deste protocolo in vitro foi testada também em outro tipo de tecidos, incluindo o periósteo, a biópsia de átrios cardíaco e do músculo reto lateral do globo ocular 5. Em particular, observou-se em amostras de Ded derme e um aumento da viabilidade das células após 7 dias de cultura, provavelmente devido ao uso de um meio suplementado com soro fetal bovino a 10%.

Além disso para a manutenção da viabilidade celular, este sistema é seguro e fácil de usar e em poucos minutos é capaz de desagregar mecanicamente diferentes tipos de tecidos prevenção da ruptura das estruturas celulares, em relação aos métodos tradicionais de isolamento de células, tais como enzimática digestão que requerem mais tempo de execução. Além disso, este sistema é capaz de seleccionar as células com um cut-off de 50 microns e este aspecto é muito importante, tendo em consideração o sucesso de micro-enxertos injectáveis, porque esta gama incluicélulas progenitoras capazes de se diferenciar em muitos tipos de células e, em seguida, melhorar a reparação da lesão. Este protocolo permite-nos não só para obter viáveis, mas também autólogas micro-enxertos, uma vez que o sujeito doador é também o receptor destes micro-enxertos. A capacidade deste sistema para obter autólogas micro-enxertos foi relatado especialmente no campo da medicina dentária, onde foi demonstrado que o transplante autólogo de células estaminais dental polpa (DPSC) de forma não continha defeito infraósseos contribuiu para a reparação e regeneração de atrófica periodontal maxila 5,6. A capacidade destes micro-enxertos para melhorar o processo de cicatrização da ferida também foi anteriormente relatado no tratamento de feridas complexas após intervenções cirúrgicas ou complicações 4.

Outra vantagem sobre a utilização de autólogo e pronto para utilizar micro-enxertos é, certamente, a manutenção de condições estéreis em vista a sua subsequente implante sobre as lesões da pele.

Em conclusão, o protocolo descrito no presente documento demonstraram a capacidade para criar tecido de micro-enxerto humano pronto para usar em intervenção clínica para melhorar a cicatrização da aguda / crónica feridas da pele, tais como as indicadas neste estudo. Os resultados in vitro sobre a possibilidade de criar micro-enxertos viáveis ​​também têm sido relatadas e este parâmetro é certamente importante para aumentar a percentagem de sucesso na reparação de tecidos. Tomados em conjunto, os dados mostraram que este novo sistema pode ser considerado uma ferramenta promissora para os médicos que têm necessidade de um instrumento rápida e segura no tratamento de feridas da pele.

No momento, não existem limitações particulares modificações ou para o protocolo nesta aplicação específica, dado que a pele constitui um tecido simples de usar e em outros estudos relataram que a eficácia do mesmo protocolo em diferentes lesões de pele 6,7

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Disclosures

O autor Antonio Graziano é o diretor científico do cérebro humano Onda srl, que produz e comercializa o sistema Rigenera. O autor Letizia Trovato é um colaborador da Divisão Científica do cérebro humano Onda srl

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer Dr. Federica Zanzottera para contribuir para o estudo realizar citometria de fluxo análise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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