Tissue Karakterisering efter en ny Disaggregering Metode til Skin Micro-udtagne transplantater Generation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollen beskriver en ny metode til at opdele humane væv og skabe autologe mikro-podninger, der kombineret med collagen-svampe, giver anledning til menneskelige bio-komplekser klar til brug i behandlingen af ​​hudlæsioner. Endvidere dette system bevarer cellelevedygtighed af mikro-transplantater på forskellige tidspunkter efter mekanisk opdeling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Der er udviklet en række nye metoder inden for bioteknologi til at opnå autologe cellulære suspensioner under operationen, for at give et trin behandlinger for akutte og kroniske hudlæsioner. Endvidere behandlingen af ​​kronisk men også akutte sår efter traumer, diabetes, infektioner og andre årsager, stadig en udfordring. I denne undersøgelse beskriver vi en ny metode til at skabe autologe mikro-implantater fra kutant væv af en enkelt patient og deres kliniske anvendelse. Desuden blev in vitro biologisk karakterisering af kutant væv stammer fra hud, de-epidermized dermis (DED) og dermis af multi-organ og / eller multi-vævsdonorer også udført. Alle væv blev opdelt efter denne nye protokol, hvilket giver os mulighed for at opnå levedygtige mikro-podninger. Især rapporterede vi, at denne innovative protokol er i stand til at skabe bio-komplekser sammensat af autologe mikro-transplantater og collagen-svampe klar til at blive anvendt på hudlæsioner. Den kli-cal anvendelse af autologe bio-komplekser på et ben læsion blev også rapporteret, viser en forbedring af både re-epitalization proces og blødhed af læsionen. Derudover viste vores in vitro model, at cellelevedygtighed efter mekanisk opdeling med dette system opretholdes over tid for op til syv (7) dage kultur. Vi har også observeret, ved hjælp af flowcytometri analyse, at puljen af ​​celler opnået fra disaggregering er sammensat af flere celletyper, herunder mesenchymstamceller, der udøver en nøglerolle i de processer af vævsregeneration og reparation, for deres høje regenerative potentiale. Endelig demonstrerede vi in vitro, at denne procedure opretholder sterilitet af mikro-implantater ved dyrkning i agar retter. Sammenfattende konkluderer vi, at denne nye regenerative tilgang kan være et lovende redskab for klinikere at opnå i et trin levedygtig, sterilt og klar til brug mikro-implantater, der kan anvendes alene eller i kombination med mest almindelige biologiske scaffoLDS.

Introduction

I de sidste år har flere nye metoder blevet udviklet inden for bioteknologi til at opnå autologe cellulære suspensioner under operationen for at give et-trins behandlinger for akutte og kroniske hudlæsioner. Desuden behandling af akut men hovedsagelig kroniske sår efter traumer, diabetes, infektioner, og andre årsager, stadig en udfordring. Der er stigende tegn på, at kroniske sår er blevet en alvorlig global sundhedsproblem, der forårsager en enorm økonomisk byrde for sundhedssystemerne i hele verden 1.

At forøge hastigheden af ​​succes i behandlingen af ​​hudlæsioner, fraværet af omfattende manipulation (herunder cellulær enhancement) og opretholdelse af sterile betingelser er afgørende, for at skabe en cellulær suspension, der umiddelbart kan anvendes på det beskadigede område af patienter og derved undgå en længere behandling i renrum såsom cellefabrikker. Starting fra små hudbiopsier, slibning, centrifugering og andre adskillelsesmetoder (f.eks enzymatisk eller mekanisk), anvendes ofte til opnåelse af en cellulær suspension, der kan dyrkes i et vækstmedium. Alle disse metoder kræver generelt lang tid for udførelse, understreger de cellestrukturer, og fører til en reduktion af cellelevedygtighed. Et andet væsentligt aspekt er at opnå et autologt cellulær suspension klar til at blive brugt af klinikere, for eksempel til at reparere beskadigede områder. Desuden er det velkendt, at autologe vævstransplantater overlever procedurerne for overførsel til sidst overleve i modtagerens sted ved principperne for induktion og ledning 2, 3. Den ideelle graft væv skal være let tilgængelige og har lav antigenicitet og donor websted sygelighed 4.

På grundlag af disse beviser, den første Formålet med denne undersøgelse var at skabe autologe bio-komplekser er egnede tilklinisk anvendelse i vævsreparation. Til dette formål, vi beskriver en ny metode til at opnå autologe mikro-podninger startende fra kutane væv, der blev opdelt efter denne protokol. En sag præsentation er også heri beskrives som en klinisk anvendelse af autologe mikro-podninger opnået ved denne protokol i kombination med collagen-svampe. Denne fremgangsmåde er allerede blevet rapporteret at være effektiv i den mekaniske opdeling af humane væv 5, og det er blevet anvendt klinisk til transplantater og regenerering af dermale væv 6,7 samt for regenerative terapier af bindevæv i oral-maxillofacial kirurgi 8-10 .

Derudover andet formål med denne undersøgelse var den biologiske karakterisering af de kutane væv efter deres disaggregering af denne protokol. Til dette formål forskellige homologe prøver af kutant væv afledt fra stammen område af forskellige multiorgansystemerog / eller multi-vævsdonorer blev behandlet efter de nationale regler om høst, forarbejdning og distribution af væv til transplantation (CNT 2013) på Emilia Romagna Regional Skin Bank.

CASE PRÆSENTATION:

En 35-årig kvindelig patient, som viser en kompleks traume grundet bilulykke blev indlagt på intensivafdelingen på Ancona Hospital. Patienten viste en infektion på benet grundet et åbent sår og en sammensat brud stabiliseret med ekstern fiksering. To radikale debridering blev udført, og når såret blev rene efter undertryk terapi (VAC-terapi), og periosteum optrådte sunde, vi anvendte protokollen efter to måneder opsving. Efter disaggregering med dette system, blev mikro-implantater fremstillet brugt til at skabe bio-komplekser med en kollagensvamp som efterfølgende blev implanteret med henblik på at undersøge deres virkning på læsionen reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: siden den kliniske anvendelse af protokollen kræver brug af kutant autolog væv af patienten, blev dens karakterisering in vitro udføres inden klinisk brug på homolog kutant væv på Emilia Romagna Regional Skin Bank efter retningslinjerne af nationale regler om høst, forarbejdning og distribuere væv til transplantation (CNT 2013).

1. Bio-kompleks Building for klinisk anvendelse

BEMÆRK: Denne protokol er klinisk baseret på anvendelsen af Rigeneracons (tissue disruptor) og Rigenera Machine (tissue disruptor systemet) (figur 1A). Vævet disruptor er et biologisk medicinsk disruptor af humane væv i stand til at forstyrre små stykker af væv under anvendelse et gitter tilvejebragt af sekskantede knive og filtrering celler og komponenter af ekstracellulær matrix med en afskæring på ca. 50 mikrometer.

  1. Indsamle skinsamples af patienten gennem en biopsy dorn (figur 1B), og opsplitte tilsætte 1 ml saltopløsning for hvert stykke for at opnå autologe mikro-podninger 6,7,9 (eller se trin 2.1).
  2. Placer 1 ml mikro-transplantater på collagen-svampe (figur 1C) toform bio-komplekser til brug for klinisk anvendelse.
  3. Kultur yderligere 1 ml af mikro-transplantater på collagen-svampe i nærvær af 6 ml DMEM-medium suppleret med 10% kalvefosterserum ved 37 ° C i en 5% CO2 fugtig atmosfære.
  4. Efter 3 dages kultur fastsætte bio-komplekser med 0,3% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Hæld paraffin med en specifik dispenser direkte på prøven. Anskaf skiver med en mikrotom med en tykkelse på 5 um og sat direkte i et glas-slide.
  5. Fordybe paraffin skiver af 5 um i et glas til histologiske analyser, indeholdende 15 - 20 ml xylen (kommercielt tilgængelig - en blanding af m-xylen (40 - 65%), p-xylen (20%), o-xylen (20% ) og ethyl benzen (6 - 20%) og spor af toluen, trimethylbenzen, phenol, thiophen, pyridin og hydrogensulfid) i 3 min hver.
  6. Fordybe skiverne i faldende kvaliteter (100% til 70%) af ethanol (100% ethanol i 1 time, 95% ethanol i 1 time, 80% ethanol i 1 time, 70% ethanol i 1 time) og derefter deioniseret vand til de-paraffinizing og rehydrering sektionerne.
  7. Farv afsnittene med 1 - 2 ml 1 g / L Ematoxylin i 1 - 2 min og efterfølgende skylles i vand for at fjerne enhver Ematoxylin overskud.
  8. Farv afsnittene for 4. - 5. min med Eosin Y alkoholisk opløsning på 1% af blandet med ethanol 70% og fortyndes i vand.
  9. Brug 1 - 2 ml Eosin Y for hver slide sektion og skyl under rindende vand.
  10. Fordybe sektioner i stigende kvaliteter af ethanol (se trin 1.6) og endelig efter en passage i xylen i 1 time, dækglas med en baseret montering mediumand observere under et lysmikroskop ved 100 x forstørrelse (figur 1 D).
  11. </ Ol>

    2. Indsamling, Disaggregering og in vitro analyse af væv

    1. Ved hjælp af en dermatom, tage uafhængig hud væv, papillære de-epidermized dermis (DED) eller retikulære dermis (dermis) henholdsvis 0,6 mm, 1 mm eller 2 mm i tykkelse fra stammen område på 4 forskellige multi-organ og / eller multi- vævsdonorer i et område fra 40 til 55 år, efter de nationale regler om høst, forarbejdning og distribution af væv til transplantation (CNT 2013).
      1. Forsigtigt skylles alle prøver i 0,9% NaCl-opløsning sætte dem i et fad på en orbitalryster i 5 min.
      2. Brug af 5-mm biopsi punch, skaber prøver, som er ensartede i diameter fra huden væv, Ded og dermis og vejer alle vævsprøver før opdeling.
      3. Indsæt otte, tre eller fire ensartede prøver af hudvæv, Ded eller Dermis henholdsvis i vævet disruptor, tilføjelse 1,5 ml saltopløsning for opdeling.
      4. Udføre forskelligetider med disaggregering for alle vævsprøver som angivet i tabel 1.
      5. Brug et korrespondent antal Hulning biopsier stammer fra intakte vævsprøver som kontroller.
      6. Efter mekanisk disaggregering, opsug saltopløsning indeholdende mikro-transplantater og sted separat hver prøve i en enkelt brønd på en plade med 12 brønde. Udfør den samme protokol for intakt kontrol Hulning biopsier.
      7. Tilføj 1 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika til hver prøve.
      8. Evaluere cellelevedygtigheden straks. Til hver brønd indeholdende en mikro-implantatet (opnået ved den samtidige disaggregering af otte, tre eller fire ensartede prøver af hudvæv, Ded eller Dermis henholdsvis) tilsættes 1 ml medium indeholdende 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5 dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyltetrazoliumbromid) opløsning og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2 / luft. Udfør den samme protokol for intakt kontrolPunch biopsier.
      9. Efter inkubation fjernes alle medium indeholdende MTT og tilføje til hver prøve 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) i 10 minutter.
      10. Overfør hver prøve og DMSO i en kuvette og aflæst ved optisk densitet (OD) ved 570 nm med et spektrofotometer. Beregn cellelevedygtighed som forholdet mellem absorbansen ved 570 nm og vægten i gram (GR) af væv, der anvendes inden disaggregering. Udfør den samme protokol for intakt kontrol Hulning biopsier.
    2. Efter mekanisk disaggregering, opsug saltopløsning indeholdende mikro-graft afledt af hudvæv, DED og dermis prøver af en enkelt donor.
      1. Anbring separat hver prøve i en enkelt brønd på en plade med 12 brønde eller i en dyrkningskolbe for cellelevedygtighed test og morfologisk analyse hhv.
      2. Kultur mikro-transplantater tilsætte 1 ml (12-brønds plade) eller 5 ml (dyrkningskolbe), i RPMI 1640-medium suppleret med 10% FBS og antibiotika ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2 / air i 24 timer eller 7 dage.
      3. Vurdere cellelevedygtighed efter 24 timer eller 7 dage (gentage trin 2.1.8-2.1.10).
      4. Udføre morfologisk analyse vurdere tilstedeværelsen af ​​cellesuspensionen ved lysmikroskopi efter 24 timer og 7 dages dyrkning i kolbe.
      5. Analyser prøver af dermis for positivitet til mesenkymale og bloddannende cellemarkører, herunder CD146, CD34 og CD45 antigener ved FACS-analyse 6.
      6. Under laminar flow hætte frø hver mikro-implantatet (opnået ved den samtidige disaggregering af otte, tre eller fire ensartede prøver af hudvæv, Ded eller Dermis henholdsvis) og en korrespondent lille fragment af hver vævsprøve ikke helt disaggregeret (> 50 mikron i størrelse efter disaggregation proces) på Columbia-agar-plade indeholdende 5% fåreblod bouillon 100 pi.
      7. Inkubér pladen ved 37 ° C i tre dage og udføre mikrobiologisk analyse på Columbia-agarplade for at vurdere steriliteten 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne indledende undersøgelse, den første mål var at undersøge evnen af ​​humane autologe mikro-transplantater kombineret med en biologisk støtte, såsom collagen, til frembringelse af bio-komplekser klar til brug. Disse bio-komplekser blev implanteret i en patient med et ben læsion forårsaget af en bilulykke (figur 2A) og en komplet re-epitelisering forbundet med vævsreparation efter 30 dage (figur 2B) blev observeret. Desuden klinisk opfølgning viste en god tekstur og blødhed af det beskadigede område efter 5 måneder (Figur 2C). Parallelt til klinisk anvendelse, blev in vitro-undersøgelser også udføres for at vurdere cellernes levedygtighed af forskellige kutane væv såsom hud væv , Ded og dermis før og efter opdeling af dette system. Navnlig under hensyntagen til den forskellige tykkelse af hver type væv, grænsen på otte,fire og tre biopsier, som kan behandles i et enkelt trin til hud væv, Ded og dermis, henholdsvis, blev etableret. Den etablerede antal biopsier blev derefter opdelt i fire forskellige tidspunkter som angivet i tabel 1, i henhold til deres biologiske egenskaber for at identificere den optimale betingelse for opdeling at opretholde en god cellelevedygtighed.

Selvom vævsbehandling selv uundgåeligt inducerede en svækkelse af cellelevedygtighed sammenlignet med intakt væv, den mekaniske opdeling udført med dette system synes at opretholde en middelværdi på cellelevedygtighed på 30% i alle prøver af hud, Ded og dermis evalueret på forskellige tidspunkter (figur 3A), med hensyn til intakt væv (figur 3B) (gennemsnit af 92 OD / gr for intakt hudvæv og 29 OD / gr efter opdeling, fra 22 OD / gr til 7 OD / gr for intakt ded med hensyn til opdeling og endelig fra 16 OD / gr til 2,7 OD / gr for intakte dermis med hensyn til opdeling). Således er disse foreløbige resultater viser, at dette system er i stand til at opretholde betydelige niveauer af cellelevedygtighed efter øjeblikkelig opdeling. Virkningen af ​​disaggregering på cellelevedygtighed blev også undersøgt på vævsprøver dyrket i 24 timer eller 7 dage og variable resultater blev observeret. Især blev der ikke observeret nogen væsentlig variation af cellelevedygtighed i huden vævsprøver uafhængigt af tidspunktet for homogenisering og kultur sammenlignet med starttidspunktet (T 0) (figur 4A). På den anden side, en nedsat levedygtighed DED prøver efter 24 timer af kultur i forhold til starttidspunktet (T 0) blev observeret, men overraskende cellelevedygtigheden blev restaureret efter 7 dages dyrkning (figur 4B). Lignende resultater blev også observeret for prøver af dermis (figur 4C). Hver prøve blev evalueret i to eksemplarer og værdier rapporteret i tabel 2.

På grundlag af disse resultater, vi identificeret passende tidspunkt for opdeling for at opretholde cellernes levedygtighed i tre typer af kutant væv som angivet i tabel 3. Ud over cellelevedygtighed, blev den morfologiske aspekt af dyrket cellulære suspension også evalueret, identificere enkeltceller efter 24 timer fra væv disaggregering, mens efter 7 dage der rester af fibre i både hud væv og Ded / dermis prøver blev observeret (figur 5 AB). Desuden blev en celle karakterisering ved flowcytometri analyse udført i en prøve af dermis efter homogenisering: en heterogen pulje af celler sammensat af flere cellulære typer, herunder endotelceller og mesenkymale stamceller blev identificeret (figur 6). Endvidere blev der ikke foreligger bakterievækst identificeret i n alle disaggregerede prøver belejligt podet på Agar retter, der beviser sterilitet eksperimentelle procedure (figur 7).

Figur 1
Figur 1. Bio-komplekser Building Tissue Afbrydelse System (A) og Indsamling af et lille stykke af Derma fra læsionen område med Patient, der var Efterfølgende Disaggregeret med væv stoffer. De bio-komplekser blev opnået kombinere mikro-transplantater på collagen-svampe at opnå menneskelige patches klar til brug til læsion reparation (C). (D) Hematoxylin & eosin (H & E) farvning af en repræsentativ bio-kompleks dyrket i tre dage i DMEM-medium og observeret at mikroskopi klik her for at se en større udgave af dette tal.

indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2. Bio-komplekser Application på Leg Læsion Bioprodukterne komplekser sammensat af collagen og mikro- transplantater opnået fra patienten blev påført på benet læsion (A), og såret blev evalueret efter 30 dage (B) og 5 måneder (C ). klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. C ell Levedygtighed Umiddelbart efter Disaggregering på forskellige tidspunkter af Three Type af kutane væv (A) i forhold til Intakte kutane væv (B). Huden, DED og dermis væv stammer fra fire forskellige donorer blev opdelt med væv disruptors som angiver i det relevante afsnit i teksten. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-test udført i dobbeltbestemmelse for hver vævsprøve. Grafen repræsenterer fire forskellige eksperimenter udført in duplo for hver prøve. Resultaterne udtrykkes som et forhold mellem optisk densitet (OD) og gram (GR) af væv; standardafvigelsen blev beregnet på forholdet mellem optisk densitet (OD) og gram (gr) af væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. C ell Levedygtighed Niveauer af en Disaggregeret Prøve af hudvævet (A), Ded (B) og dermis (C) til Start Time (T 0) og efter Subkultur i 24 timer og 7 dage. Vævene blev homogeniseret med væv stoffer som indicate i det relevante afsnit i teksten. De disaggregerede prøver blev efterfølgende dyrket i 24 timer og 7 dage efter opdeling og opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2 / luft. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT som tidligere beskrevet. Grafen repræsenterer et forsøg udført to gange for hver prøve af hudvæv, Ded og dermis afledt fra en enkelt donor. Resultaterne er udtrykt som forholdet mellem optisk densitet (OD) og gram (gr) af væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Morfologisk Analyse af Disaggregeret hudvæv (A) og Ded / Dermis (B) efter 24 timer og 7 dage i Cult ure. Morfologisk analyse blev udført ved hjælp af lysmikroskopi efter 24 timer og 7 dages dyrkning i nærværelse af RPMI medium på huden væv og DED / dermis væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Cell Karakterisering ved flowcytometri Analysis. Efter mekanisk opdeling, mikro-transplantater fremstillet ved dermis blev sat i kultur og efter 7 dage blev analyseret for positivitet til mesenkymale og hæmatopoietisk celle markør, herunder CD146, CD34 og CD45-antigener. Klik her for at se en større version af dette tal.

les / ftp_upload / 53.579 / 53579fig7.jpg "/>
Figur 7. mikrobiologisk analyse af Disaggregeret hudvæv, DED og dermis prøver. Små fragmenter disaggregerede vævsprøver blev podet på Columbia-agar tilsat 5% fåreblod (BioMerieux Company) under laminar flow hætte og inkuberet ved 37 ° C i tre dage til udføre mikrobiologisk analyse og vurdere sterilitet proceduren. klik her for at se en større version af dette tal.

vævsprøver Disaggregering TIDER (sek / min)
Hud 30 sek
1 min
2 min
5 min
Ded 1 min
2 min
5 min
10 min
dermis 1 min
2 min
5 min
10 min

Tabel 1. Skematisk repræsentation af de fire forskellige tidspunkter anvendes til Opdeling af Hud, Ded og dermis. Otte, fire og tre Punch biopsier af hud, Ded og Dermis henholdsvis blev opdelt på fire forskellige tidspunkter, alt efter deres biologiske karakteristika.

hud væv
Til 24 timer 7 dage
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37,1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35,8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
Ded
T 0 24 timer 7 dage
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
dermis
Til 24 timer 7 dage
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabel 2. Rækkevidde af værdierne i OD / gr for One Biologisk Repliker. Værdier for cellernes levedygtighed fra hud væv, Ded og dermis vurderet til starttidspunkt og efter mekanisk opdeling til angivne tider. Resultaterne er repræsentative for et eksperiment udført in duplo, og udtrykt som forholdet mellem optisk densitet (OD) og gram (g) af væv.

Prøve disaggregering Time
hud væv 5 min
Ded 1 min
Derma 2 min

Tabel 3. Skematisk repræsentation den bedste tid på Disaggregering at opretholde en god Cell Levedygtighed i different vævsprøver. Hud, Ded og dermis vævsprøver viser den optimale cellelevedygtighed efter 5, 1 og 2 min på disaggregering hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne indledende undersøgelse viste, at mikro-implantater fremstillet ved denne protokol kan kombineres med collagen-svampe, som allerede rapporteret i andre kliniske anvendelser, for at optimere effektiviteten af mikro-transplantater implantater 9, 10. Især denne undersøgelse rapporteret kapaciteten af bio -complexes, udgøres af mikro-grafts og collagen-svampe, på adjuverende sårhelingen af ​​et ben læsion efter 30 dage fra klinisk anvendelse. Desuden in vitro resultater dokumentere om effektiviteten af denne protokol til at opsplitte tre forskellige kutane væv, opretholde en mærkbar cellelevedygtighed både umiddelbart efter den mekaniske opdeling og også efter 24 timer og 7 dage efter kultur.

Opretholdelsen af ​​cellelevedygtighed efter denne form for homogenisering muligt at opnå i kun ét trin sterile autologe mikro-podninger, undgå omfattende manipulation. Dette beviser er i overensstemmelsemed andre nyere papirer, hvor effekten af denne protokol in vitro blev testet også i andre typer af væv, herunder periost, biopsi af hjerte-atrier og laterale rectus muskel i øjeæblet 5. Vi har især observeret i DED og dermis prøver en forøget cellelevedygtighed efter 7 dages dyrkning, sandsynligvis på grund af anvendelsen af ​​et medium suppleret med 10% føtalt bovint serum.

Udover opretholdelsen af ​​cellelevedygtighed, dette system er sikkert og let at bruge og i et par minutter er i stand til mekanisk at opsplitte forskellige typer af væv forhindre afbrydelse af cellestrukturer, med hensyn til traditionelle metoder til celleisolering, såsom enzymatisk fordøjelse, der kræver længere tid for udførelse. Desuden er dette system kan vælge celler med en afskæring på 50 mikrometer og dette aspekt er meget vigtigt i betragtning af succesen af ​​injicerbare mikro-implantater, fordi dette område omfatterprogenitorceller kunne differentiere i mange celletyper og derefter lindre læsionen reparation. Denne protokol tillader os ikke kun at opnå levedygtige men også autologe mikro-implantater, eftersom donoren emne er også acceptoren af ​​disse mikro-transplantater. Kapaciteten af ​​dette system til at opnå autologe mikro-transplantater blev især rapporteret inden for tandpleje hvor det er blevet påvist, at transplantation af autologe Dental Pulp stamceller (DPSC'er) på en ikke indeholdt infrabony defekt bidraget til periodontal opheling og regeneration af atrofisk overkæben 5,6. Evnen af disse mikro-transplantater at forbedre sårheling proces blev også tidligere rapporteret i forvaltningen af komplekse sår efter kirurgiske indgreb eller komplikationer 4.

En anden fordel om anvendelsen af ​​autolog og klar til brug mikro-transplantater er helt sikkert hold af sterile betingelser med henblik på deres senere implantat på hudlæsioner.

Som konklusion er beskrevet i dette dokument protokol viste evnen til at skabe humane mikro-graft væv klar til brug i klinisk intervention at forbedre heling af akut / kronisk hudsår, såsom dem der er angivet i denne undersøgelse. In vitro resultater på muligheden for at skabe levedygtige mikro-transplantater er også blevet rapporteret, og denne parameter er helt sikkert væsentligt at øge andelen af ​​succes i væv reparation. Taget sammen viste data, at dette nye system kan betragtes som en lovende værktøj for klinikere, der har behov for en hurtig og sikker instrument i forvaltningen af ​​hudsår.

I øjeblikket er der ikke særlige ændringer eller begrænsninger for protokollen i denne specifikke anvendelse, da huden repræsenterer et væv let at bruge og i andre studier, vi rapporterede effekten af den samme protokol i forskellige hudlæsioner 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren Antonio Graziano er videnskabelig direktør for Human Brain Wave srl, der producerer og markedsfører Rigenera systemet. Forfatteren Letizia Trovato er samarbejdspartner med videnskabelig Division of Human Brain Wave srl

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at takke Dr. Federica Zanzottera for at bidrage til undersøgelsen udfører flowcytometri analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics