Tissue Karakterisering etter en ny Disaggregering metode for Skin Micro-Grafts Generation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den protokollen beskriver en ny metode for å disaggregert menneskelig vev, og for å skape autologe mikro-grafts som i kombinasjon med kollagen svamper, gir opphav til humane bio-komplekser er klare for bruk i behandling av hudlesjoner. Videre bevarer dette system cellenes levedyktighet av mikro grafts på forskjellige tidspunkter etter mekanisk dekomponering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Flere nye fremgangsmåter er blitt utviklet innen feltet bioteknologi for å oppnå autologe cellesuspensjoner under operasjonen, for å tilveiebringe en trinn behandlinger for akutte og kroniske hudlesjoner. Videre behandling av kronisk, men også akutte sår som følge av traumer, diabetes, infeksjoner og andre årsaker, er fortsatt utfordrende. I denne studien beskriver vi en ny metode for å lage autologe mikro grafts fra kutan vev av en enkelt pasient og deres klinisk anvendelse. Videre in vitro biologisk karakterisering av hud vev avledet fra hud, de-epidermized dermis (DED) og dermis av multi-organ og / eller multi-vev givere ble også utført. Alle vev ble inndelt etter denne nye protokollen, som tillater oss å få levedyktige mikro grafts. Spesielt rapporterte vi at dette innovative protokollen er i stand til å lage bio-komplekser komponert av autologe mikro grafts og kollagen svamper klar til å bli brukt på hudlesjoner. den klinical anvendelse av autologe bio-komplekser på et ben lesjon ble også rapportert, og viser en forbedring av både re-epitalization prosess og mykhet av lesjonen. I tillegg vår in vitro modell viste at celleviabilitet etter mekanisk disaggregation med dette systemet opprettholdes over tid for opptil syv (7) dager kultur. Vi har også observert, ved strømningscytometri-analyse, at utvalget av celler oppnådd fra dekomponering er sammensatt av flere celletyper, inkludert stamceller, som utøver en nøkkelrolle i prosesser av vev regenerering og reparasjon, for sin høye regenerative potensial. Til slutt har vi vist in vitro at denne fremgangsmåten opprettholder steriliteten av mikro grafts når dyrket på agarskåler. I sammendrag, konkluderer vi med at denne nye regenerativ fremgangsmåten kan være et lovende verktøy for klinikere å oppnå i ett trinn levedyktig, sterilt og klart til bruk mikro-grafts som kan anvendes alene eller i kombinasjon med de vanligste biologisk scaffoLDS.

Introduction

I de siste årene har flere nye metoder blitt utviklet innen bioteknologi for å oppnå autologe cellesuspensjoner under operasjonen for å gi ett-trinns behandling for akutte og kroniske hudskader. Videre behandling av akutte men hovedsakelig kroniske sår som følge av traumer, diabetes, infeksjoner, og andre årsaker, er fortsatt utfordrende. Det er montering bevis for at kroniske sår har blitt et alvorlig globalt helseproblem, forårsaker en enorm økonomisk byrde på helsesystemer verden over ett.

For å øke graden av suksess i behandling av hudlesjoner, fravær av utstrakt manipulering (inkludert cellulært forbedring) og opprettholdelse av sterile betingelser er viktig, for å skape en cellulær suspensjon som umiddelbart kan anvendes på den skadede delen av pasienter, og dermed unngå en lengre behandling i renrom slik som cellefabrikker. Starting fra små huden biopsier, sliping, sentrifugering og andre separasjonsmetoder (for eksempel enzymatisk eller mekanisk), blir ofte benyttet for å oppnå en cellesuspensjon, som kan dyrkes i et vekstmedium. Alle disse metodene generelt krever en lang tid for utførelse, understreker cellestrukturer, og som fører til en reduksjon av cellelevedyktighet. Et annet vesentlig aspekt er å oppnå en autolog cellulær suspensjon klar til å bli brukt av klinikere, for eksempel for å reparere skadede områder. Videre er det vel etablert at autologe vev grafts overleve overføringsfremgangsmåter for til slutt å overleve i mottaker området av prinsippene for induksjon og ledning 2, 3. Den ideelle pode vevet bør være lett tilgjengelig og har lav antigenisitet og donorsete sykelighet 4.

På grunnlag av disse bevisene, den første Hensikten med denne studien var å skape autologe bio-komplekser egnet forklinisk anvendelse i vevsreparasjon. For dette formål beskriver vi en ny metode for å oppnå autologe mikro grafts fra og kutane vev som ble inndelt ved denne protokollen. En sak presentasjon er også her beskrevet som et klinisk anvendelse av autologe mikro grafts oppnådd med denne protokollen i kombinasjon med kollagen svamper. Denne tilnærmingen har allerede blitt rapportert å være effektive i den mekaniske disaggregation av menneskelig vev 5 og det har vært brukt klinisk for grafts og regenerering av dermal vev 6,7 samt for regenerativ behandling av bindevev i oral-maxillofacial kirurgi 8-10 .

I tillegg er den andre Hensikten med denne studien var den biologiske karakterisering av de kutane vev etter deres dekomponering av denne protokollen. For dette formål, forskjellige homologe prøver av kutane vev avledet fra stammen området av forskjellig multi-organog / eller multi-vev givere ble behandlet etter nasjonale regler for fangst, foredling og distribusjon av vev for transplantasjon (CNT 2013) på Emilia Romagna Regional Skin Bank.

CASE PRESENTASJON:

En 35 år gammel kvinnelig pasient som viser en komplekse traumer på grunn av bilulykke ble innlagt på intensivavdelingen på Ancona Hospital. Pasienten viste en infeksjon på benet på grunn av et åpent sår og en forbindelse brudd stabilisert med ekstern fiksering. To radikale debridement ble utført, og når såret ble rent etter undertrykksbehandling (VAC terapi) og periosteum dukket sunt, vi påføres protokollen etter to måneder fra utvinning. Etter dekomponering med dette systemet, ble mikro grafts erholdt som brukes til å lage bio-komplekser med en kollagen svamp som deretter ble implantert for å undersøke deres effekt på lesjonen reparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Siden klinisk anvendelse av protokollen krever bruk av kutan autologt vev av pasienten, sin karakterisering in vitro ble utført før klinisk bruk på homolog kutant vev ved Emilia Romagna Regional Skin Bank følger retningslinjene for nasjonale regler om høsting, foredling og distribusjon av vev for transplantasjon (CNT 2013).

1. Bio-kompleks Building for klinisk anvendelse

NB: Denne protokollen er klinisk basert på bruk av Rigeneracons (vev disruptor) og Rigenera Automat (tissue disruptor system) (figur 1A). Vevet disruptor er en biologisk medisinsk disruptor av humane vev i stand til å forstyrre små biter av vev ved bruk av et rutenett levert av heksagonale blader og filtrerings celler og komponenter av ekstracellulær matriks med en cut-off på ca. 50 mikron.

  1. Samle skinsamples til pasienten gjennom en biopsy slag (figur 1B) og disaggregert tilsette 1 ml saltoppløsning for hver del for å få autologe mikro grafts 6,7,9 (eller se trinn 2.1).
  2. Plasser 1 ml av mikro-grafts på kollagen svamper (figur 1C) toform bio-komplekser til bruk for klinisk anvendelse.
  3. Kultur ytterligere 1 ml av mikro-grafts på kollagen-svamp i nærvær av 6 ml DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet atmosfære.
  4. Etter 3 dagers dyrking, løse bio-komplekser med 0,3% paraformaldehyd i 10 minutter ved RT. Hell parafin med en spesiell dispenser direkte på prøven. Skaff skiver med en mikrotom med en tykkelse på 5 mikrometer og sette direkte i et glass-lysbilde.
  5. Dyppe parafin skiver av 5 um i et glass for histologiske analyser, inneholdende 15 - 20 ml xylen (kommersielt tilgjengelig - en blanding av m-xylen (40 - 65%), p-xylen (20%), o-xylen (20% ) og ethyl-benzen (6 - 20%) og spor av toluen, trimetylbenzen, fenol, tiofen, pyridin og hydrogensulfid) i 3 minutter hver.
  6. Dyppe skivene i minkende karakterer (100% til 70%) av etanol (100% etanol i 1 time, 95% etanol i 1 time, 80% etanol i 1 time, 70% etanol i 1 time) og deretter avionisert vann for de-paraffinizing og rehydrerende seksjonene.
  7. Flekk seksjonene med 1 - 2 ml 1 g / L Ematoxylin i 1 - 2 minutter og deretter skyll i vann for å fjerne Ematoxylin overskudd.
  8. Flekk seksjonene i 4 - 5 min med Eosin Y alkoholisk oppløsning ved 1% av konsentrasjon blandet med etanol 70% og fortynnet i vann.
  9. Bruk 1 - 2 ml Eosin Y for hvert lysbilde seksjon og skyll under rennende vann fra springen.
  10. Fordyp seksjoner i økende grader av etanol (se trinn 1.6) og til slutt, etter en passasje i Xylen for 1t, dekkglass med en basert monterings mediumand observere under et lysmikroskop med 100 x forstørrelse (figur 1D).
  11. </ Ol>

    2. Collection, Disaggregering og in vitro analyse av vev

    1. Ved hjelp av en dermatome, ta selvstendige huden vev, papillær de-epidermized dermis (Ded) eller retikulære dermis (dermis) henholdsvis på 0,6 mm, 1 mm eller 2 mm i tykkelse fra stammen området av fire forskjellige multi-organ og / eller multi- vev givere i et område fra 40 til 55 år, etter nasjonale regler om høsting, foredling og distribusjon av vev for transplantasjon (CNT 2013).
      1. skyll forsiktig alle prøver i 0,9% NaCl-løsning å sette dem i en skål på en orbital shaker for 5 min.
      2. Bruk av 5-mm biopsi punch, lage prøver som er ensartet i diameter fra huden vev, Ded og dermis og veie alle vevsprøver før disaggregation.
      3. Sett åtte, tre eller fire ensartede prøver av hudvevet, Ded eller Dermis henholdsvis i vevet disruptor, å tilsette 1,5 ml saltløsning for dekomponering.
      4. Utfør annerledestider på dekomponering for alle vevsprøver som angitt i tabell 1.
      5. Bruk en korrespondent rekke punsj biopsier avledet fra intakte vevsprøver som kontroller.
      6. Etter mekanisk dekomponering, Aspirer saltoppløsning inneholdende mikro transplantat og sted hver for hver prøve i en enkelt brønn i en 12-brønns plate. Utfør den samme protokollen for intakt kontroll punsj biopsier.
      7. Legg 1 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika til hver prøve.
      8. Vurdere celleviabilitet umiddelbart. Til hver brønn inneholdende et mikro pode (oppnådd ved samtidig disaggregering av åtte, tre eller fire ensartede prøver av hudvevet, Ded eller Dermis henholdsvis) tilsett 1 ml medium inneholdende 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- dimetyltiazol-2-yl] -2,5 difenyltetrazoliumbromid) løsning og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2 / luft. Utfør den samme protokollen for intakt kontrollpunsj biopsier.
      9. Etter inkubering, fjernes alt medium inneholdende MTT, og legge til hver prøve 1 ml dimethylsulfoxyd (DMSO) i 10 minutter.
      10. Overfør hver prøve og DMSO i en kyvette og avlest ved optisk tetthet (OD) ved 570 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. Beregn cellelevedyktighet som forholdet mellom absorbans ved 570 nm og den vekt i gram (GR) av vev som brukes før dekomponering. Utfør den samme protokollen for intakt kontroll punsj biopsier.
    2. Etter mekanisk disaggregation, aspirer saltløsning som inneholder mikro-pode avledet fra hudvev, Ded og dermis prøver av en enkelt donor.
      1. Sette inn hver for hver prøve i en enkelt brønn i en 12-brønns plate, eller i et kulturflaske for cellenes levedyktighet test og morfologisk analyse respektivt.
      2. Kultur mikro grafts tilsetning av 1 ml (12-brønns plate) eller 5 ml (kulturflaske) i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og antibiotika ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2 / air i 24 timer og 7 dager.
      3. Vurdere celleviabilitet etter 24 timer eller 7 dager (gjenta trinn 2.1.8-2.1.10).
      4. Utføre morfologisk analyse å evaluere nærværet av cellesuspensjonen ved lysmikroskopi etter 24 timer og 7 dagers dyrking i kolben.
      5. Analysere prøvene av dermis for positivitet til mesenchymale og blodkreft cellemarkører, inkludert CD146, CD34 og CD45 antigener ved FACS analyse 6.
      6. Under laminær strømningshette frø hvert mikro pode (oppnådd ved samtidig disaggregering av åtte, tre eller fire ensartede prøver av hudvevet, henholdsvis Ded eller dermis) og en korrespondent lite fragment av hver vevsprøve ikke helt disaggregert (> 50 um i størrelse etter dekomponering prosess) på Columbia-agar plate inneholdende 5% saueblod buljong 100 ul.
      7. Inkuber platen ved 37 ° C i tre dager og utføre mikrobiologiske analyser på Columbia-agar plate for å vurdere sterilitet 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne innledende studie den første målet var å undersøke evnen til human autologe mikro grafts kombinert med en biologisk bærer, så som kollagen, for å produsere bio-komplekser ferdig til bruk. Disse bio-kompleksene ble implantert i en pasient med et bein lesjon forårsaket av en bilulykke (figur 2A) og en komplett re-epithelialization assosiert med vev reparasjon etter 30 dager (figur 2B) ble observert. Videre er klinisk oppfølging viste en god konsistens og mykhet av det skadede området etter 5 måneder (figur 2C). Parallelt til klinisk anvendelse, ble in vitro-studier også utført for å vurdere cellelevedyktigheten til forskjellige kutane vev, slik som hud vev , Ded og dermis før og etter dekomponering av dette systemet. Spesielt tar hensyn til den forskjellige tykkelse av hver type av vev, terskelen til åtte,fire og tre biopsier som kan behandles i et enkelt trinn for hudvev, Ded og dermis, henholdsvis, ble etablert. Den etablerte antall biopsier ble deretter inndelt i fire forskjellige tider som angitt i tabell 1, i henhold til deres biologiske egenskaper for å identifisere den optimale tilstanden disaggregation å opprettholde en god celle levedyktighet.

Selv om vevet behandling i seg selv uunngåelig indusert en svekkelse av cellelevedyktighet i forhold til intakt vev, mekanisk disaggregation utføres med dette systemet synes å opprettholde en middelverdi av cellelevedyktighet på 30% i alle prøver av hud, Ded og dermis evaluert ved forskjellige tidspunkter (figur 3A), med hensyn til intakt vev (figur 3B) (gjennomsnitt på 92 OD / gr for intakt hud og vev 29 OD / g etter dekomponering; fra 22 OD / gr til 7 OD / gr for intakt Ded med hensyn til disaggregation og til slutt fra 16 OD / gr til 2,7 OD / gr for intakte dermis med hensyn til dekomponering). Dermed disse foreløpige resultater viser at dette systemet er i stand til å opprettholde betydelige nivåer av cellelevedyktigheten etter umiddelbar dekomponering. Effekten av disaggregering av cellelevedyktighet ble også undersøkt på vevsprøver dyrket i 24 timer eller 7 dager og variable resultater ble observert. Spesielt ble ingen vesentlig variasjon av cellelevedyktighet i huden vevsprøver observert uavhengig av tidspunktet for homogenisering og kultur sammenlignet med starttiden (T 0) (figur 4A). På den annen side, en redusert levedyktighet av DED prøver etter 24 timers kultur sammenlignet med starttiden (T 0) ble observert, men overraskende cellelevedyktigheten ble gjenopprettet etter 7 dagers dyrking (figur 4B). Lignende resultater ble også observert for prøver av dermis (figur 4C). Hver prøve ble bedømt i duplikat, og verdiene er rapportert i tabell 2.

På grunnlag av disse resultatene, identifiserte vi den passende tid til dekomponering for å opprettholde cellenes levedyktighet for tre typer av kutane vev som angitt i tabell 3. I tillegg til celle-levedyktighet, ble den morfologiske aspekter av dyrkede cellesuspensjonen også evaluert, identifisering av enkeltceller etter 24 timer fra vev disaggregation, mens etter 7 dager det rester av fiber i både hud vev og Ded / dermis prøvene ble observert (Figur 5 AB). I tillegg ble en celle karakterisering ved strømningscytometri-analyse utført på en prøve av dermis etter dens homogenisering: en heterogen pool av celler sammensatt av flere cellulære typer, inkludert endotelceller og stamceller ble identifisert (figur 6). Videre ble fravær av bakterievekst identifisert i n alle disaggregerte prøvene opportunely seedet på Agar retter, beviser sterilitet av eksperimentell prosedyre (figur 7).

Figur 1
Figur 1. Bio-komplekser Building Tissue forstyrre System (A) og innkreving av et lite stykke Derma fra lesjon området av pasienten som ble senere skilt ut med Tissue Disruptors. Bio-komplekser ble oppnådd kombinere mikro-grafts på kollagen svamper å skaffe menneskelige patcher klar til bruk for lesjon reparasjon (C). (D) Hematoxylin & eosin (H & E) farging av en representant bio-kompleks dyrket i tre dager i DMEM medium og observert å mikroskopi klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. Bio-komplekser Application på ben Lesjon bio-kompleksene består av kollagen og mikro-grafts oppnådd fra pasienten ble påført på benet lesjon (A) og såret ble evaluert etter 30 dager (B) og 5 måneder (C ). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. C ell Livskraftig Umiddelbart etter Disaggregering på ulike tider av Three Type Kutan Vev (A) med hensyn til Intakte Kutan Vev (b). The Skin, Ded og dermis vev avledet fra fire forskjellige donorer ble inndelt med vev disruptors som tyder i den aktuelle delen i teksten. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-test som ble utført i duplikat for hver vevsprøve. Grafen er representativ for fire forskjellige eksperimenter utført in duplo for hver prøve. Resultatene er uttrykt som forholdet mellom optisk tetthet (OD) og g (GR) av vev; standardavviket ble beregnet på forholdet mellom optisk tetthet (OD) og g (gr) av vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. C ell Levedyktighet Nivåer av en disaggregert Eksempel på hudvev (A), Ded (B) og dermis (C) til starttid (T 0) og etter Subkultur for 24 timer og 7 dager. Vevet ble homogenisert med vev forstyrrende som indicate i den aktuelle delen i teksten. De disaggregert Prøvene ble deretter dyrket i 24 timer og 7 dager etter dekomponering og holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2 / luft. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT som beskrevet tidligere. Grafen er representativ for et eksperiment utført i duplikat for hvert sampel av hudvev, Ded og dermis avledet fra en enkelt donor. Resultatene er uttrykt som forholdet mellom optisk tetthet (OD) og g (gr) av vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. morfologisk analyse av disaggregerte hudvev (A) og Ded / dermis (B) etter 24 timer og 7 dager med Cult ure. Morfologisk analyse ble utført ved hjelp av lysmikroskopi etter 24 timer og 7 dager for kultur i nærvær av RPMI medium på huden vev og ded / dermis vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Cell Karakterisering av flowcytometrisystemer Analysis. Etter mekanisk disaggregation, mikro-grafts innhentet av dermis ble satt i kultur og etter 7 dager ble analysert for positivitet til mesenchymale og blodkreft cellemarkør, inkludert CD146, CD34 og CD45 antigenene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Figur 7. Mikrobiologisk analyse av disaggregert hudvev, DED og dermis Prøver. Små fragmenter av disaggregert vevsprøver ble sådd på Columbia-agar tilsatt av 5% saueblod (BioMerieux Company) i henhold til laminær hette og inkubert ved 37 ° C i tre dager for å utføre mikrobiologisk analyse og vurdere sterilitet av prosedyren. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

VEVSPRØVER Disaggregering TIMES (sec / min)
Hud 30 sek
1 min
2 min
5 min
Ded 1 min
2 min
5 min
10 min
dermis 1 min
2 min
5 min
10 min

Tabell 1. Skjematisk fremstilling av fire forskjellige tider brukt for Disaggregering av hud, Ded og dermis. Eight, fire og tre punsj biopsi av hud, Ded og dermis henholdsvis ble inndelt i fire forskjellige tider, i henhold til deres biologiske egenskaper.

hudvev
Til 24-timers 7 dager
2 ' 5 ' 2. ' 5 ' 2. ' 5 '
37.1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35.8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
Ded
T 0 24-timers 7 dager
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
dermis
Til 24-timers 7 dager
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabell 2. Utvalg av verdier uttrykt i OD / gr for en biologisk gjenskape. Verdier for celleviabilitet fra hudvev, Ded og dermis evaluert til starttid og etter mekanisk disaggregation til angitte tider. Resultatene er representative for et eksperiment utført i duplikat, og uttrykt som forholdet mellom optisk tetthet (OD) og gram (g) av vev.

Eksemplar Disaggregering Tid
hudvev 5 min
Ded 1 min
Derma 2 min

Tabell 3. Skjematisk fremstilling av den beste tiden av Disaggregering å opprettholde en god celleviabilitet i different vevsprøver. Hud, Ded og prøver dermis vev viser optimal celleviabilitet etter 5, 1 og 2 min av dekomponering, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne innledende undersøkelsen viste at mikro grafts som oppnås ved denne protokollen kan kombineres med kollagen svamper, som allerede er rapportert i andre kliniske anvendelser, for å optimalisere effekten av mikro-grafts implantater 9, 10. Spesielt denne studien rapportert kapasiteten av bio -complexes, bestående av mikro-grafts og kollagen svamper på adjuvant såret helbredelse av en etappe lesjon etter 30 dager fra klinisk anvendelse. Videre in vitro resultatene gir bevis om effektiviteten av denne protokollen til disaggregert tre forskjellige kutane vev, opprettholde en merkbar celleviabilitet både umiddelbart etter mekanisk disaggregation og også etter 24 timer og 7 dager etter kultur.

Opprettholdelse av cellenes levedyktighet etter en slik homogenisering gjør det mulig å oppnå i bare ett trinn sterile autologe mikro grafts, og unngå utstrakt manipulasjon. Dette beviset er enigemed andre nylige papirer i hvilken effektiviteten av denne protokollen in vitro ble også undersøkt i andre typer vev, inkludert periosteum, biopsi av hjerte atriene og lateral rectus muskel av øyeeplet 5. I særdeleshet har vi observert i DED og dermis prøvene en økt cellelevedyktigheten etter 7 dagers dyrking, sannsynligvis på grunn av bruken av et medium supplert med 10% føtalt bovint serum.

I tillegg til opprettholdelse av cellenes levedyktighet, er dette systemet sikkert og enkelt å bruke, og i noen få minutter er i stand til mekanisk å disaggregert forskjellige typer vev hindrer forstyrrelse av cellestrukturer, med hensyn til tradisjonelle metoder for celleisolasjon, for eksempel enzymatisk fordøyelse som krever lengre tid for gjennomføring. Videre er dette systemet i stand til å velge celler med en cut-off på 50 mikrometer og dette aspektet er svært viktig av hensyn til suksess for injiserbare mikro grafts, fordi dette området inneholderprogenitorceller i stand til å differensiere i mange celletyper og deretter lindre lesjonen reparasjon. Denne protokollen tillater oss ikke bare å få levedyktige, men også autologe mikro grafts, gitt at donor motivet er også akseptor av disse mikro-grafts. Kapasiteten av dette systemet for å få autologe mikro grafts ble spesielt rapportert innen tannbehandling, hvor det er vist at transplantasjon av autologe Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) i et ikke- inneholdt infrabony defekt bidratt til periodontal reparasjon og regenerering av atrofisk maxilla 5,6. Evnen til disse mikro-grafts å forbedre sårheling prosessen ble også tidligere rapportert i forvaltningen av komplekse sår etter kirurgiske inngrep eller komplikasjoner 4.

En annen fordel med bruk av autologt og klar til bruk mikro grafts er absolutt oppbevaring av sterile betingelser med henblikk på deres senere implantatet på hudlesjoner.

Konklusjonen er at den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen viste evnen til å lage humane mikro pode vev klar til bruk i klinisk inngripen for å forbedre leging av akutte / kroniske sår i huden, slik som de som er angitt i denne studien. In vitro-resultater på muligheten for å skape levedyktige mikro grafts har også blitt rapportert, og denne parameteren er absolutt viktig å øke andelen av suksess i vev reparasjon. Til sammen dataene viste at dette nye systemet kan anses som en lovende verktøy for klinikere som har behov for en rask og trygg instrument i forvaltningen av huden sår.

For øyeblikket er det ikke særlig endringer eller begrensninger for protokollen i dette spesielle bruksområdet, gitt at huden representerer et vev lett å bruke, og i andre studier vi rapporterte effekten av den samme protokoll i forskjellige hudlesjoner 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren Antonio Graziano er vitenskapelig direktør for bemannet Brain Wave srl som produserer og markedsfører Rigenera system. Forfatteren Letizia Trovato er en samarbeidspartner av Scientific Division of Human Brain Wave srl

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å Takk Dr. Federica Zanzottera for å bidra til studiet utfører flowcytometri analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics