Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olarak, başlamak için en uygun hücre tiplerini belirlemek için araştırılmaktadır.

Havayolu epitel hücreleri allerjik inflamasyon 12 gelişiminde kritik ve epitel Immun ile etkileşim yoluyla alerjik tepkiler ve havayolu yeniden önemli bir sürücüE ve stromal hücreler. solunum yolu epitel Kalkış ve astım gibi akciğer hastalıklarının kalıcılığı önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, alt solunum yolu epitel hücreleri, özellikle sağlıklı kontrol ve çocukların, bir klinik ortamında elde edilmesi zordur. Hava kirliliği ve alerjenlere karşı tepkileri okuyan özellikle birkaç çalışmalardan elde edilen veriler, burun mukozasından epitel hücreleri alt solunum yolu epitel hücreleri 13-20 için geçerli ve pratik vekil olduğu öncül desteklemektedir. Burun mukozası% 90'dan fazla kirpikli hava yolu epitel hücreleri oluşur ve diğer hücre / doku örnekleme tekniklerine göre daha az invazif ve olduğu gibi bu burun epitel hücreleri (UEM) örnekleme kolayca yaş dört ya da beş gibi küçük çocuklarda yapılabilir enfeksiyon 20-23 gibi olumsuz olayların en az risk ile ilişkili. Bu, uzun gereksiz ve sıklıkla ağrılı bronkoskopi procedu olmadan sağlıklı ve hastalıklı çocuklara hem de örnek bir hızlı ve basit bir yol sunuyorsedasyon gerektiren res. Daha önceki çalışmalar, astım şiddeti ile ilişkili bir hastalık alt tipleri burun mukozası gibi astım çocuklardan alınan bronş hücre numuneleri hem de ayırt edilebilir olduğunu bulduk, ve iki doku tipleri arasında gen ekspresyonu olmayan yerde gen 22 yaklaşık% 90 benzer olan 24. iPSCs için bir kaynak olarak, UEM diğer sık ​​kullanılan hücre türleri üzerinde avantajlar sağlar. Fibroblastlar genellikle iPSC üretimi için kullanılan, ancak bu hücreler kolayca cilt biyopsisi kültüre olabilir, ancak, bu süreç genellikle lokal anestezi, bir kesi ve dikişler gerektirir ve enfeksiyon bazı riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, biyopsi bu tip hastaların bilgilendirilmiş onayını aldıktan 25 zor olabilir. fibroblastlar için bir alternatif periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) 'dir. Bununla birlikte, çocuk hastalar arasında iPSC oluşturulması için yeterli derecede kan elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, alt-AP sınırlamalar vardırfibroblast ve kan hücresi kaynaklı iPSCs, belirli hücre tipleri 5,26 özellikle kendi farklılaşma kapasitesi komplikasyonların. Bu nedenle, nispi erişilebilirlik ve kendi koleksiyonu aşağıdaki yan etkileri düşük riski göz önüne alındığında, UEM pediatrik popülasyonların gelen iPSC nesil için ideal bir hücre kaynağını temsil etmektedir.

iPSCs yeni hastalık modelleri, insani kalkınmayı okuyan üretmek için bir platform olarak son zamanlarda ilgi çok aldı ve kişiselleştirilmiş tedaviler için hücrelerin potansiyel bir kaynağı olarak var. Bu teknolojinin tam potansiyelini fark edilebilir önce yeniden programlama sürecinin moleküler temellerinin açıklanması gerekir, ama şimdi bu protokol ve içinde belirtilen usuller havayolu maruz odaklanmış araştırmalar ışık tutacaktır için, yanı sıra bir platform sağlamak iPSCs içeren kişiselleştirilmiş tıp etkilerini araştırmak.

Birkaç laboratuarları işbirlikçi çalışma Generatio yol açmıştırburun mukozasının örnekleme değil, aynı zamanda UEM kültürlenmesi ve iPSCs 23 bu hücrelerin yeniden programlanması sadece için başarılı bir teknik n. Bu makale optimum örnekleme, kültürleme ve yeniden programlama koşulları için bir protokol bir özeti verilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder.

1. Burun mukozasının Örnekleme

NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın.

  1. katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin.
  2. Açık sitoloji sadece örnek almadan önce fırça ve steril fırça tutmak için emin olun ve burun yüzeyleri dışında herhangi bir yüzeye dokunmayın.
  3. Hala oturup tavana doğru kafasını eğmek için katılımcı isteyin. küçük ya da daha fazla huzursuz çocuklar ellerinde oturmak ve / veya uzak fırça swatting önlemek için yatarken.
  4. geçit daraltır (küçük kara delik gibi görünüyor) burun arkasındaki fırça yöneltin. aşağı fırça kaydırın ve fırça Nostri kaldırılır olarak bileklerini büküml.
  5. konik fırça yerleştirin ve Begm daldırın. Fazla fırça kesti ve tüp kapağını kapatın. VORTEKS DO NOT.
    NOT: katılımcı istekli ise, aynı şekilde ancak ikinci burun deliğine ikinci fırça edinin. Her iki burun deliklerinin bir fırçalama Edinme örnekleme başarılı olacaktır daha yüksek bir olasılıkla sonuçlanacaktır. Aynı burun deliği Örnekleme kanama neden olabilir ve büyük olasılıkla örnek iyileştirmek değil.
  6. ılık su ile bir beher kullanarak taşıma sırasında mümkün olduğunca 37 ° C kadar yakın örnekleri tutun.

2. Hücre Sayımı ve sitospin

  1. Yavaşça Begm fırçayı ajite ve hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı için örnek 10 ul alır. canlı / ölü leke 10 ul ekleyin ve sadece mikroskop altında hücrelerin canlı saymak.
  2. örnek 50 ul almak ve 1 x PBS ile 200 ul'ye seyreltilmiş. 2 dakika boyunca 300 rpm'de cam slayt ve spin bağlı Sitospin huni ekle. followin kuru O / N ve leke slayt slayt edelimg üreticinin talimatlarına. tercihen karanlıkta, O / N kurumaya bırakın.
  3. Hema 3 Stain ile Leke Slide
    1. Her solüsyonu (; Hema 3 Çözüm I, pembe, Hema fiksatif, açık mavi ve Hema 3 Çözüm II, mavi derinlik) aktarın boyama kabına; Kullanılmadığı zaman kapalı tutun. slayt boyama tekne içine slaytlar ekleme
    2. Daldırma slaytlar sürekli 30 sn için sabitleyici olarak, daha sonra fazla drenaj sağlar. Daldırma 30 sn için, daha sonra fazla drenaj sağlar Çözüm sürekli olarak kayar. Dip daha sonra fazla süzülmesini bekleyin, 30 saniye boyunca sürekli Çözüm II slaytlar
    3. Su berrak bitene kadar deiyonize su ile durulayın. Karanlıkta, tercihen O / N kurumaya bırakın
  4. epitel hücrelerinin yüzdesini belirlemek, mikroskop ve sayım hücreleri altında slayt bak. örnekleme iyi ise% 90 veya daha fazla olmalıdır.

3. Tohum Hücreler

NOT: Uygun ve sertifikalı doku kültürü tüm hücre kültürü prosedürlerini yürütmekdavlumbaz steril tekniği kullanarak.

  1. Sığır dermal kolajen (BDC) ile kaplayın plakaları, tip 1 49.5 mi 1 x PBS içinde seyreltilmiş, 3 mg / ml BDC 0.5 ml ilave edilir. sadece bir kaç plakaları kullanılacak olursa az hazırlayın. Kat 2 saat boyunca 37 ° C 'de, bir T25 2 mi BDC şişe ve steril bir başlık O inkübe / N veya gerekirse.
  2. İnkübasyondan sonra, herhangi bir geri kalan sıvı aspire. steril bir muhafaza içinde 30 dakika, UV ışığına şişeler Açığa. ama bir ay kadar 4 ° C Mağaza şişeler, hücrelerin ekim önce C RT getirmek ya da 37 °.
  3. Tohum için hazır olana kadar 37 ° C'de Begm fırçayı ve hücreleri tutun. Yavaşça homoseksüel konik içinde fırça, ancak girdap yok.
    1. Plaka, bir T25 şişesi içinde 7 x 10 5 hücre. az olması durumunda, daha küçük bir kap, bir 6-yuvalı plaka gibi bir de kullanmak. Bu boyut plakası yaklaşık 3 x 10 5 hücre gerektirir.
      NOT: Bu birçok hücre yoksa, o devam etmek tavsiye edilmez.
  4. steril Kaputun altında, tüp ve ge dışına fırça almakntly kaplama kazımak için dikkatli olmak, kaplanmış balonun yüzeyi üzerinde fırça döndürün. uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına fırça atın.
  5. Yavaşça konik dışına ve T25 balona Begm kalan hücrelerin pipetle. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Dalgalı bir hücre sayısı görülmektedir ve bu aşamada (Şekil 3A) olarak uygun olan burun, çıkan toz olabilir.

4. Hücre Kültürü

  1. Hücrelerin ekim sonra, onları kesinti olmadan 48 saat (Şekil 3) razı olsun. 48 saat sonra, yavaş yavaş ve hafifçe 2 ml sıcak Begm ve steril Penisilin / streptomisin / Fungizone (P / S / F) 20 ul ekle.
    NOT: Medya orijinal 2 ml aspire ETMEYİN.
  2. Tohumlama sonra 4. gününde, dikkatlice sıvı aspire ve taze 4 ml ile değiştirin, Begm artı 1x Pen / Strep (fungizon artık gerekli değildir) ısındı. Her iki gün medya değiştirin ve takmak için hücreleri değerlendirmekment, büyüme ve izdiham. Hücreler ulaştığında ~% 80 izdiham, genellikle 2-3 hafta içinde, onlar pasajlanır hazırdır.
  3. Bir T25 şişesi (yaklaşık 2.5 x 10 6 hücre olduğunda konfluent), üç T25 şişelerinde ya da bir T75 şişesi içine geçişli olabilir. İlk geçişten sonra, hücreler her üç günde bir kaynaşmaya eriştikten, sağlam ve sağlıklı olmalıdır.

5. Pasajlanması Hücreler

  1. Yavaşça plakadan medya aspire. yaklaşık 4 dakika için inkübatör plaka ve yere T25 şişesi başına 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ekleyin veya hücreler plaka ayrılana kadar. hücrelerin her 2 dakikada bir dekolmanı seviyesini kontrol edin ve daha uzun 10 dk tripsin bırakmayın.
  2. enzimi etkisiz hale getirmek 5 ml Tripsin Giderici Çözüm (TNS), ya da serum içeren medya ekleyin. 15 ml konik tüp içinde şişesi ve yerden tüm sıvı ve hücreleri çıkarın.
  3. 5 dakika boyunca 200 x g'de (hızlanma 0 yavaşlama 0) Santrifüj, bir hücre peleti elde edilmiştir. aspire SupernaYeni şişelere için gerekli olan hacimde S Begm bölgesindeki + U / tant ve tekrar süspansiyon hücreleri (T75 şişeye bir T25 şişesi 4 mi, 10 mi)
  4. (2.1) yukarıda açıklandığı gibi bir ölü / canlı boya ile hücre sayımı gerçekleştirin. kaplanmış şişelere Begm ve hücrelerin uygun miktarda ekleyin ve inkübatör dönmek. Yukarıda detaylı Bakım veya ml başına 0.5-2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ortam (% 70 Begm,% 20 FBS ve% 10 DMSO) dondurma cryopreserve.

iPSCs 6. yeniden programlanması

NOT: iPSCs oluşturmadan önce, nesil ve insan iPSCs kullanımını düzenleyen tüm kurumsal düzenlemelere uyumu sağlamak. Kültür ortamı rutin antibiyotik içermeyen steril bir teknik, iPSC kültürleri için özellikle önemlidir. UEM sağlıklı görünen ve sağlam başarılı yeniden programlama için proliferatif olduğu önemlidir.

  1. Plaka 6 gözenekli bir doku kültürü plakasının oyuk başına 5 x 10 5 UEM. 24 saat sonra, polybrene eklemeBegm için ortama Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc ifade lentiviral partikülleri ilave edilmiş 8 ug / ml transdüksiyonu UEM bir nihai konsantrasyona seyreltildi. ~ 5 27 enfeksiyonu (İçişleri) çokluğu sağlamayı hedefliyoruz.
    1. İçişleri Bakanlığı belirlenmesi için, konsantre-lentiviral stokunun seri dilüsyonları hazırlamak ve bu seyreltmeleri ile HT1080 hücreleri nakletmek. HT1080 hücrelerinde dTomato ifadenin ilk tümden algıladıktan sonra, dTomato-pozitif hücre / her seyreltme hücrelerin küçük kümeleri sayısını puanlama "ml transducing birim /" sayısını hesaplamak.
      NOT: Genellikle, çok yüksek dilüsyonları (her şey dTomato pozitif) ve çok düşük (yok ya da pozitif hücrelerin sadece bir çift) olacaktır.
    2. hücrelerin ayrı ayrı pozitif hücreler / küçük kümeleri tespit edildiği dilüsyonları puanlama gerçekleştirin. Uygun seyreltme faktörü ile birim / ml transducing sayısını düzelterek titresi belirlemek. İB, sonra sayısına oranıdırvirüs partiküllerinin 27 sayısına hücreleri transdüse.
      NOT: Her dTomato pozitif hücre / küçük yığın, tek bir virüs partikülü kaynaklandığı varsayılmaktadır.
  2. Yaklaşık 3 saat sonrası transdüksiyon, medyayı çıkarın ve taze Begm ile değiştirin. kurumsal onaylı prosedürler kullanılarak lentivirüs içeren ortam atın. 3 gün için kuluçka makinesine geri kalıt UEM dönün.
  3. 3 gün, taze Begm ile medyayı değiştirmek ve daha sonra başka 3 gün kuluçkaya yatmaktadır. Aspire medya, 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve iyice 1 ml% 0.05 tripsin çözüm ekleyin geçirdi. Tripsin ile Passage hücreleri (Bölüm 5) Yukarıdaki yazılı olarak. Dikkatle 4 ml Begm + P / S supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Hücreler, işlem bittikten (bir sonraki adıma bakınız) BDC ile kaplanmış bir 6 yuvalı plaka yeni bir oyuğuna geçişli veya MEF kültürlere ilave edilebilir.
  4. MEF kaplı tabak hazırlayın. 4. günde () +/- Thiazovivin (SPT yerine adım 6.6 kadar) de bir 6 2 oyuklarına (1 ml / oyuk) ve% 0.1 jelatin çözeltisi ilave edilir. Bir sonraki ongün, inaktive MEFS 28 bir şişe çözülme.
  5. MEF ortamı (DMEM + 1 x NEAA +% 10 dFCS) 10 ml MEFS yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj pelet. MEF medyada süspanse. Aspire 6 plaka jelatin ve jelatin kaplı 6 plaka oyuk başına 1.87 X 10 5 MEFS ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe ya da 24 saat içinde en az.
  6. Begm Devri 2 mi önceden kaplanmış 6 plaka 2 kuyulara oyuk başına hücreleri transdüse ve / nO inkübe içeren. Bir sonraki gün, 4 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü ihtiva eden, standart HESC ortam oyuk başına 2.5 ml Begm değiştirin. taze hESC medya ile hücrelerin besleyin +/- SPT 10 gün boyunca günde
    NOT: Bu UEM 23 etkinliği ve yeniden programlama kinetiğini arttırmak için küçük moleküller (SB431542, PD0325901 ve Thiazovivin (SPT) kokteyli) oluşan bir karışımla ilave edilmesi mümkündür.
  7. On gün sonra, SPT olmadan HESC ortamını kullanarak günlük beslemeye devam ediyor. hESC benzeri koloniler kadar günlük kültürleri beslemek(Şekil 5A, P0 koloni) görünür. sitoplazmik oranı ve belirgin nükleol: yüksek çekirdeği tarafından varsayılan iPSCs barındıran koloniler belirleyin.
  8. hESC benzeri morfolojisi ile manuel olarak tüketim ve transfer koloniler bir besleyici içermeyen sistemde ayrı satır olarak kültür ve genişleme için kuyu ayırmak için. Eksize koloniler bu koşullara hızla adapte edilmelidir.
    1. kaplama eksize koloniler sonra bu ayrık varsayımsal iPSC hatları artık geçit 1 (p1) olarak kabul edilir. Günlük mTeSR1 ile yem kültürleri. Passage ve standart prosedürler kullanılarak iPSC hatları genişletmek. p1 koloniler onlar pasajlanır edilmesi gereken büyüklüğe ulaşması için bir hafta birkaç gün sürebilir.

7. Kültür iPSCs bakımı

  1. Yem ve günlük kültürleri değerlendirir. El ile özel tüketim alanları steril bir cam pipet veya mikro pipet ile kazıyarak açık farklılaşma sergileyen. Günlük toplama sonra ortamı değiştirin.
  2. Passage hücreleri approxima sonrately her dört günde: yavaşça aspire ortam, 6-çukurlu bir tablaya (yarısı besleme hacmi) oyuk başına 1 mi, sıcak Dispase (1 mg / ml) ekleyin, sonra yaklaşık 4 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kolonilerin kenarları kolonisi etrafında beyaz bir anahat gibi görünüyor, hangi kaldırmaya başlayacaktır. Yavaşça Dispase aspire ve ısıtılmış DMEM / F12 ile 3x yıkayın.
  3. 2 ml mTeSR1 ekleyin ve plaka koloniler kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanmak. koloniler küçük kümeler halinde kırılmış kadar yavaşça hücreleri çiğnemek için 5 ml serolojik pipet veya P1000 mikropipet kullanın.
    1. sağkalım ve daha sonra proliferasyon optimal olacak şekilde, çok küçük bir küme veya tek üreten hücrelerin kaçının. koloniler yeniden kaplama yaparken, 1: 4 ile 1: 6 bölünmüş optimum koloni yoğunluğu koruyacaktır. Yavaşça plaka koloniler ve ortamı çıkartın ve yeni, Matrigel kaplı kuyucuklara ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen "kara delik") ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının balataları benzer ve çevresel maruziyet immün yanıtta da aktif vaskülarize mukoza dokusunun tarafından kaplıdır.

Doğru doku örneği yeniden programlanması hücreler epitel hücreleridir sağlar. Bu, aynı zamanda kültürdeki hücrelerin gözlemleyerek başlangıç ​​hücre sayısı ve Sitospin ile değerlendirilebilir.Cytospin, bir kez döndürülür, kurutuldu ve lekeli numunenin makyaj gösterir. Çoğu örnekleri bir yuvarlak çekirdeği ile, sütunlu ve kirpikli epitel hücreleri, oluşur. Birlikte clumped görülen burun doğrudan alındığında Hema 3 leke kiti ile, genellikle (Şekil 2) koyu mor çekirdeği ile açık mavi bir renk leke ve. Burun hücre örnekleri, başlangıçta kültür ve ortam değişiklikleri ile zaman bir burun hücre tiplerinin bir karışımı olarak enkaz olsa da, epitel hücreleri baskın (Şekil 3A, B) olmaktadır. Epitel hücreleri izdiham büyüyor, onlar çekirdek büyük bir taze kırık yumurta, şeklinde ve merkezinde bulunan ve hücre (Şekil 3B) bölmek için hazırlanırken sitoplazma "uzanarak" ve germe tür olduğunu vardır. Hücreler bir araya büyüdükçe, onlar bir futbol şekli daha almak ve (tabak rahatça birbirine Şekil sığacak başlar3C).

Hücreler transdüksiyona tâbi tutulursa, onlar. Çekirdekte tdTomato fluoresan işaretleyici ifade edecek da transduse edilmiş sonra parlak saha, floresan ve her iki resim birleştirilmiş olan, 4 hücrelerini göstermektedir. Her hücre işaretleyici ifade ve bu nedenle her hücrenin transduse, ancak her bir kuyunun yaklaşık yüzde 90 transdüksiyon verimliliği olmalı ve bu bazı hücreler MEFS üzerinde kaplama edildikten sonra pluripotensini elde olasılığını artıracaktır.

ko-kültür MEFS ve hücreleri gibi koloniler oluşmaya başlar, onlar yavaş yavaş tdTomato ifade duracaktır. Ancak, bu koloni oluşumunun en iyi göstergesi değildir. koloni oluşumunun en iyi göstergesi görsel teyididir. pluripotency "altın standart" olan hESC koloniler, çoğunlukla yuvarlak ve larg ile çok sayıda küçük, yuvarlak hücrelerden oluşure çekirdekleri ve sitoplazma oranı yüksek bir çekirdek. Her hücre, çoğunlukla çekirdeklerin oluşan görünür ve diğer organelleri açıkça görülebilir değildir. Standart besleyici içermeyen koşullarda iPSC koloni hasat ve kültür ardından, yeni kurulan iPSC kolonileri çok kendi HESC meslektaşları gibi görünmelidir ve Şekil 5B görüldüğü gibi bireysel hücreler, HESC fenotip hemen hemen aynıdır.

kullanan iPSCs deneylerde nazal epitel hücreleri (NEC-iPSCs) elde etmeden önce, yeni hatların kalitesini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu genellikle karyotip, Pluripotency belirteçlerinin ifadesi ve 3 embriyonik germ (endoderm, mezoderm ve ektoderm) her birine ayırt etmek iPSCs yeteneğinin değerlendirilmesini içermektedir. Farklılaşma kapasitesi birçok yönden test edilebilir, ancak şu anda, en sıkı tahlil teratom tahlil 2,23,30 olduğunu. Bu transkripsiyonel olarak daha kapsamlı deneyler ve Epigenomik profil herhangi bir kromozom anomalileri 23 yeniden programlama tarafından tanıtıldı belirlemek için yararlıdır.

Şekil 1
Şekil 1. İnferior Konka. Örnekleme hareketi ve örnekleme hedefi, alt konka, siyah ok ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. sitospin. Numunenin çoğu bir ucunda silya ve diğer bir yuvarlak çekirdeği ile, uzun ve sütunlu olan epitel hücreleri oluşur. Nare doğrudan örneklenmiş zaman sık sık birlikte clumped. Oklar bağımsız epitel hücreleri göstermektedir."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Numune alındıktan ve kaplama hemen sonra kültüründe Şekil 3. Primer nazal epitel hücreleri. (A) Yüzer hücreleri ve enkaz. (B) Hücreler bir gün sonra pasajlanır ediliyor. Hücre morfolojisi tutarlı ve kültür başta burun epitel hücreleri, 10X büyütme ve (C) 5X büyütme oluşur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
UEM Şekil 4. İletimi. Hücreler vektör alınmış ve kırmızı floresan işaretleyici tdTomato göstermek var transduced ediliyor. Onlar bir pluripotent devlete doğru ilerlerken Bu işaretleyici solmaya gerekir. (A), kalıt aktarımlı hücrelerin Aydınlık alan görüntüsü. (B), kalıt aktarımlı hücrelerin florasanla görüntüsü. (C) Yerleşimi parlak bir alan ve floresan görüntüleri (paneller A ve B). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. iPSC hücre benzeri koloniler kaynaklanıyor. (A) MEFS üzerinde büyüyen koloni çoğunlukla kenarları yuvarlak ve hiçbir farklılaşma az gösterir. (B) Bireysel hücreleri büyük çekirdekler ile küçük yuvarlak hücreler ile tipik hESC benzeri morfoloji göstermektedir.5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem havayolu hastalıklarının araştırılmasında özellikle pediatrik hasta popülasyonlarında faydalı ve alakalı olabilir. UEM diğer bir avantajı, kültür içinde bir kez, epitel hücreleri ortam kültür koşulu ile seçilir ve homojen hale olmasıdır. Bu, kan hücreleri gibi karmaşık bir doku kullanarak daha avantajlı ve daha kolay transkriptomik ve epigenetik yaklaşımlar kullanılarak iPSC hatları ortaya çıkan hücre kökenli etkisini değerlendirmek için yapar.

Ne zamanburun mukozası, örnekleme çoğunlukla epitel hücreleri alınır, böylece bir mikroskop (Şekil 2) altında sitospin görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, burun doğru alanı örneklenir önemlidir. Doğru örnekleme ≥90% epitel hücreleri verecektir. Sağlıklı hastalarda numune elde etmek üzere ve örnek elde edilir ve kaplama hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için, uygun bir şekilde toplanır sağlamak için çok önemlidir. Protokol (Bölüm 1.5) 'de tarif edilen büküm hareketi fırça mümkün olduğu nazal yüzeyinin kadar temas sağlar. Yabancı bir cisim kişinin yüzüne doğru gidiyor zaman kişinin başını açmak için doğal bir reflekstir. Bu nedenle, bir çocuğun başını ya açar veya çekiliyor durumunda, numune hızlı ve doğru bir şekilde meydana esastır. Bu tekniklerin kullanılması protokolün her adımında verimliliğini artırmak ve başarılı yeniden programlama olasılığını belirleyecektir. çocuğu sormayatmak ve hatta altlarında ellerini yere ya da bir ebeveyn veya kardeş ellerini tutmak zorunda hala yalan ve pürüzsüz ve ağrısız örnek toplama garanti yardımcı olmak için onları teşvik etmek için iyi bir yoldur.

Son zamanlarda, birkaç örnekleme teknikleri, konforlu, kolay ve örnek sonuçlar değerlendirilmiştir hücre içeriği ve kompozisyon gibi RNA göre ve DNA 33 verim edilmiştir. grup polyester bez karşı bir sitoloji fırçası ile örnekleme gözden ve onlar aşağı konka yanı sıra şiddetle burun etrafında fırça veya bez dönen tarafından ön burun deliğine hem örneklenmiş. en iyi RNA kazançları elde mi en siliyalı epitel hücrelerinin oluşmasına rağmen bir poliester çubuk ile karşılaştırıldığında bir fırça ile alt konkanın Örnekleme, biraz rahatsız olduğu bulunmuştur. Bu protokolde önerilen yöntemin bu nedenle solunum hava yolu incelemek için bir yol olarak burun epitel örnekleme en güvenilir yöntem olarak doğrulandıepitel.

Örnek elde edildikten sonra, bu, 37 ° C'de tutulmalıdır. en etkili yollarından biri, katılımcıyı karşılamak için hazırlanırken güvenli taşıma için bir strafor kap içine daha fazla 37 ° C ve nestle o su bir beher sıcak olduğunu. Numune alındıktan hemen önce, sıcaklık yaklaşık 37 ° C'ye getirilir ve böylece soğuk su ekleyin ve medya ile konik tüp ekleyin. Fırça konik tüp eklendiğinde, su banyosunda hemen tüp dönmek ve hangi hücrelerin kadar tüp düzenlenmiş 37 ° C su banyosunda konulmalıdır işaret laboratuvara iade edilebilir kadar orada tutmak bir kültür karnisi üzerine tohumlandı. tüm noktalarda, steril bir teknik kültür yabancı maddeler oluşumunu ortadan kaldırmak için kullanılır.

Hücreler kültür bindirildi zaman örneklerin arasında değişkenlik önemli miktarda görüldü. Bu değişkenlik donör kaynağı hem de kök yanı sıra gibiydiNumune kalitesi kendisi. örnek kalitesini artırmak için bir yolu, her burun deliğine birer fırça veya katılımcı başına iki fırça elde etmektir. Hücreler geçişli taze örnek tohumlama sonra, ve, hücrelerin koşulu da yeniden programlanması için uygun olduğundan emin olmak için düzenli olarak izlenmelidir. için en iyi aday yapmak Hücreler kültüre almak ve hızlı bir şekilde çoğalırlar olanlardır. Bazı donörlerden alınan hücreler, diğer hücrelerden daha daha sağlam neden bilinmemektedir, ama bu tür örnekleme zamanında yaşı, burun boyutu ve vericinin sağlığı gibi faktörlere bağlı olabilir. Örnek verimleri çok az sayıda hücre ya da hücrelerin sadece az sayıda kez kaplama takarken, örnek ortak akışa kadar büyümeye mümkün değildir. Bir mücadele kültür izdiham ulaşmak yaparsa, hücreler zayıf olma eğilimindedir ve birçok hücre pasajlarının sırasında ölür. numunenin bu tür olduklarını hücrelerin hızlı ve güçlü bir çoğalan olarak önemli olduğundan, yeniden programlama için çok zayıf bir aday olup,mümkün olan en erken geçit numarasına transduced. Çok ince, donör değişkenliğine, kötü numune veya pasajlama kültürlerine bağlı olup olmadığını, yavaş büyüyen hücreler transfeksiyonu için tavsiye edilmez. yeniden programlama kötü hücre kültürü ile teşebbüs ise, semere devam etmek mümkün değildir.

transdüksiyon hücrelerini hazırlamak için en zor olan protokolün bir parçasıdır. 5 x 10 5 hücre hücre büyümesi, 2 x 10 5 göre transdüksiyon için önerilen ve özel hasta örneklerinde, bu bağımlı olan. Bu nedenle ideal bir sayısını elde etmek için hücre sayıları değişen kaplı bir kaç kuyu gerekebilir.

Bu protokol örnekleme kolaylığı değil, aynı zamanda göreli kolaylığı ve primer hücre kültürleri kurulması zaman çizelgeleri ve daha sürdürülebilir ve çok yönlü araştırma fırsatları iPSC hatları için bu birincil hücre kültürleri sonraki yeniden programlanması sadece özetliyor. Tümklinikten kültürde ayrı iPSCs kurulmasına süreci yaklaşık 3 ay sürer ve yeniden programlama sürelerini kısaltmak için yeni yöntemler 6,34,35 geliştirilmektedir. Bu alan hızla iPSCs birincil hücreleri dönüştürmek için, ve daha sonra ilgi belirli hücre ve doku tiplerine iPSCs ayırt etmek daha verimli ve tam yollar bulmak için gelişmektedir. Ancak, hava yolu hastalığı için önemli dokular için farklılaşma protokolleri, akciğer epiteli olarak, hala 36-38 dışarı çalıştı ediliyor.

UEM gelen iPSCs oluşturma hücrelerinin basit ve nispeten acısız izolasyon avantajı vardır. Ayrıca, NEC iPSCs yararlanılabilir diğer doku türleri türetilen iPSCs göre avantajlar sunar mümkündür. kanıtlar, fare ve insan iPSCs arasında somatik hücrenin transkripsiyonel ve epigenetik belleği barındıran göstermektedir, ancak daha sonra iPSC farklılaşma iPSC epigenetik etkisi tamamen anlaşılamamıştırkökeni ve bu seçici diğer kaderi 5,26 kısıtlayan iken donör hücre tipi ile ilişkili soy içine farklılaşma yana olduğunu. Nedeniyle menşe dokusunun önemi ve daha iyi anlaşılır doku spesifik epigenetik işaretleri 39-45 tutulması özellikle saygı ile bu etkiler iPSCs fonksiyonel özellikleri, iPSC hatları daha net sırayla çalışılması gereken nasıl kaynaklı doku etkisi. NEC türetilmiş iPSCs kökenli 23 kendi doku epigenetik bellek tutma gösteren bir genomik metilasyon imza liman olduğunu daha önce gösterilmiştir. Daha önceki çalışmalar, daha kolay bir fibroblast ya da daha kan hücreleri ayrılırlar kökenli kan hücrelerinin epigenetik bellek arzeden kan hücresi kaynaklı iPSCs göstermiştir NEC'in-iPSCs korunur Bu epigenetik belleği hava yolu hücrelerine pluripotent kök hücrelerin farklılaşması faydalı olabilir Bloo yoksun yumuşak kas kaynaklı iPSCsd hücreye spesifik epigenetik bellek 5,26. modelleme akciğer hastalıkları için iPSC kökenli havayolu hücrelerinin büyük potansiyeli göz önüne alındığında, UEM havayolu hücre / doku içine iPSCs farklılaşması için optimal hücre tipini temsil olup olmadığının araştırılması için önemli olacaktır. Ayrıca, bu sabit şekilde tutulan bellek donör hücrelerin hastalık durumları için kromozomal yeniden programlama dirençli yerleri ve adayları temsil edebilir. IPSCs dönüştürmek protokoller proksimal ve distal akciğer hücre tipleri 36-38 geliştirilen gibi, bu NEC-iPSCs astım, KOAH, kistik fibrozis, ve diğerleri gibi ve akciğer gelişimi üzerine çevresel etkileri inceleyerek modelleme hava yolu hastalıklarında bir avantaj olabilir ve homeostasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29, (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28, (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7, (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10, (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322, (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26, (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8, (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6, (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91, (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5, (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30, (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127, (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129, (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41, (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135, (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115, (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7, (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29, (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34, (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13, (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122, (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2, (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8, (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30, (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4, (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20, (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5, (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9, (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75, (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13, (5), 541-549 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics